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문제 정의
- 본 연구에서 는 소나무버 섯의 균사체가 YM 배지 에서 보다 CP 배지에서 생육도가 빠른 현상을 구체적으로 알아보기 위하여 이들 배지에서의 배양기간에 따른 성장과 다당류 함량 및 형태학적 변화를 관찰하였다.
제안 방법
- , Korea)를부착한 20 L 들이 plastic 용기를 사용하여 30℃에서 16일간 배양하였다. CP (citrus peel)배지에서의 배양은 glucose 5%, yeast extract 및 peptone 0.5%, malt extract 0.3% 를 함유하는 2%의 귤껍질 물추출물(pH 5.0)을 배지로 하여 YM 배지의 경우와 동일하게 배 양하였다. 귤껍질추출물은 귤껍 질분말 100 g에 증류수 2.
- CP 배지에서 배양한 균사체가 YM 배지에서 배양한 경우보다 AIS 및 알칼리 가용성 다당류의 함량이 높은 현상 (Table 2)과 관련하여 세포조직 에서의 나타나는 현상과 관련이 있는지를 관찰하기 위하여 균사체를 YM 및 CP 배지에서 각각 8일(YM-1, 2 및 CP-1, 2), 10일(YM-3, 4 및 CP-3, 4), 12일(YM-5, 6 및 CP-5, 6), 16일간 배양(YM-7, 8 및 CP-7, 8) 하여 전자현미경으로 관찰한 결과는 Fig. 2~4와 같다. CP 배지에서 10일간 배양한 균사체의 세포벽(CP-3, 4)은 YM 배지의 경우(YM-3, 4)보다 비후한 것으로 나타났으며, YM 배지에서 12일간 배양하였을 때의 세포벽 두께(YM-5, 6)는 0.
- YM 배지(yeast extract 0.5%, peptone 0.5%, malt extract 0.5%, glucose 1%, pH 65)(24)에서의 배양은 상기의 종균을 동일 배지를 사용하여 30℃에서 10일간 배양한 배양액을 5%되게 접종하여 공기여과장치 (DY-60, Dong Yang Co., Korea)를부착한 20 L 들이 plastic 용기를 사용하여 30℃에서 16일간 배양하였다. CP (citrus peel)배지에서의 배양은 glucose 5%, yeast extract 및 peptone 0.
- 균사체의 수율은 배양액을 Nracloth로 여과하여 얻은 생 균사체의 중량을 측정하였다. 알코올불용성물질(AIS)의 함량은 배양액에 10배 량의 에탄올을 가하여 침전된 물질을 10, 000 X g에서 10분간 원심분리하여 얻은 후 60℃에서 충분히 건조하여 중량을 측정하였다(25).
- 포매된 시료는 ultramicrotome에 의해 1~2 μm 두께로 절편을 만든 후 toludin blue로 염 색하여 관찰 대상 부위를 확인하였다. 그 후 동일한 부위에서 초 미세박편하여 uranyl acetate-lead citrate로 이 중 염색한 후 투과전자현미경 (Hitachi-7000, 100 kv)을 사용하여 2, 500~9, 000배율로 관찰하였다.
- 수세한 후 시료는 저농도인 30% 알코올에서 서서히 농도를 높여 무수 알코올까지 각각 15분 간격으로 탈수과정을 거친다. 그 후 무수알코올 : LR white를 3:1, 1:1, 1:3으로 각각 45분씩, LR white I, II에서 각각 16, 4시간 shaking한 후 LR white(high)에서 60℃로 24시간 polymerization한 후 포매하였다. 포매된 시료는 ultramicrotome에 의해 1~2 μm 두께로 절편을 만든 후 toludin blue로 염 색하여 관찰 대상 부위를 확인하였다.
- 알코올불용성물질(AIS)의 함량은 배양액에 10배 량의 에탄올을 가하여 침전된 물질을 10, 000 X g에서 10분간 원심분리하여 얻은 후 60℃에서 충분히 건조하여 중량을 측정하였다(25). 산 가용성 다당류(AcSP) 함량은 AIS 1 g에 0.05N H2SO4를 100 mL 가하여 100℃에서 5시간 끓인 후 10, 000 X g에서 10분간 원심분리하여 상징액을 얻었으며 여기에 10배량의 알코올을 가하여 얻은 AIS를 dialysis cellulose tube(MW cut off 12000) 에 넣어 증류수에서 72시간 투석한 후 동결건조하여 무게를 측정하였다.
- 0)로 3-4회 수세하였다. 시료의 막성구조를 상세히 관찰하기 위하여 0.8% potassium hexacyanoferrate가 함유된 1% OsQ 용액에 1시간 후고정 (26) 한 후 위와 동일한 완충용액으로 15분씩 3V회 수세하였다. 수세한 후 시료는 저농도인 30% 알코올에서 서서히 농도를 높여 무수 알코올까지 각각 15분 간격으로 탈수과정을 거친다.
- 알칼리 가용성 다당류(A1SP)의 함량은 산가용성 다당류를 제거시킨 잔사에 100mL의 2N KOH를 가하여 1시간 동안 추출한 후 상기와 동일한 조건으로 원심분리하고 2N HCl 로 중화시킨 다음 상기와 동일하게 투석, 동결건조하여 무게를 측정하였다(22).
- 그 후 무수알코올 : LR white를 3:1, 1:1, 1:3으로 각각 45분씩, LR white I, II에서 각각 16, 4시간 shaking한 후 LR white(high)에서 60℃로 24시간 polymerization한 후 포매하였다. 포매된 시료는 ultramicrotome에 의해 1~2 μm 두께로 절편을 만든 후 toludin blue로 염 색하여 관찰 대상 부위를 확인하였다. 그 후 동일한 부위에서 초 미세박편하여 uranyl acetate-lead citrate로 이 중 염색한 후 투과전자현미경 (Hitachi-7000, 100 kv)을 사용하여 2, 500~9, 000배율로 관찰하였다.
대상 데이터
- 소나무 잔나비버섯균사체는 경북 포항시 소재 재생 농산에서 분양받아 sucrose 1% 및 peptone 0.6 %를 함유하는 2% potato agar 평판배지에 이식하여 30℃에서 10일간 배양, 생성된 균사체를 종균으로 사용하였다.
- 실험용 귤껍질은 대구약령시에서 구입한 진피를 80-100 mesh입도로 분쇄하여 사용하였다.
데이터처리
- 분석은 3회 반복 측정한 평균치 와 표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 SPSS (statistical package social science, version 11.5)를 이용하여 Duncan's multiple range test 및 t-test를 행하였다.
성능/효과
- 그러나 본 실험에서는 소포가 균사체 세포질 내에 광범위하게 분포(YM-5~8, CP-5~8)하여 소포의 분포상태가 균사체의 생육에 뚜렷한 영향을 미치는 못하는 것으로 나타났으며 균사체 분화과정에 mitochondria의 cristae가 발달하였다(YM-9, 10 및 CP-9, 10).
- 같다. 배양기간에 따른 AIS 함량은 YM 배지의 경우는 3.17~3.22%로 뚜렷한 차이를 보이지 않았으나 CP 배지에서는 배양 8일째 8.32%로 다소 높았다가 12~16일째에는 6.94~6.96%(w/w) 범위로 다소 감소하였으나 YM 배지에서보다 높았다(Fig. 1).
- 산가용성 다당류의 함량은 YM 배지에서는 0.47-0.52 %(w/w)로 배양기간에 따른 뚜렷한 변화를 보이지 않았으며 CP 배지 에서는 8~12일째에는 0.32~0.37%(w/w)로 YM 의 경우보다 낮은 함량을 보였으나 배양 16일째는 L05% (w/w)로 높은 증가를 나타내었다. 알칼리 가용성 다당류의 경우도 산가용성 다당류의 경우와 비슷한 경향을 보였으며 그 함량은 YM 배지에서는 1.
- 이상의 결과로 보아 본 실험에서 균사체는 기존의 YM 배지보다는 CP 배지 에서 세포벽 합성 이 보다 빠르게 형성되어 생육이 촉진되는 것으로 여겨진다.
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