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문제 정의
- 하지만 현재까지 알려진 사실만으로는 식물의 고염 스트레스에 대한 적응 기작의 전체적인 그림을 그리기에 부족한 점이 많다. 그렇기 때문에 식물의 모델이 되는 애기 장대의 유전학 시스템을 도입하여 아직 밝혀지지 않은 혹은 알고는 있지만 고염 스트레스와 연관성을 몰랐던 유전자들을 밝혀내고자 하였다.
- 하지만 현재까지 연구되어진 사실만으로는 식물의 고염 스트레스에 대한 적응기작을 이해하기에 부족한 점이 많다. 따라서, 본 연구에서는 애기 장대의 유전학 시스템을 이용하여 현재까지 알려지지 않은 식물체내의 고염 스트레스에 대한 인식, 신호 전달 과정 및 적응에 관련된 유전자를 찾고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 8시 간 후, phage plaque이 생긴 LB 배지 위 에 nylon membrane을 올려 phage plaque의 시)NA를 옮겨 주었다. Probe로 만들 주형은 pGEM T-easy vector (promega)를 Dra I 제한효소로 절단하여 얻은 AmpR 유전자 부위로 하여, random primer DNA labeling kit (TAKARA)를 사용해 c나"P]dCTP로 labeled priming을 한 후, 65 °C 에서 hybridi zation buffer에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후에 (나32pjdCTP로 labeled priming된 것을 씻어 주기 위해 1차적으로 1% SDS, 2xSSC washing bufl&로 65°C에서 15 분, 2차적으로 1% SDS, 0.
- 이 확률을 바탕으로, 애기장대의 genomic DNA상에 BamW I 제한효소로 절단될 수 있는 조각의 수는 애기장대의 chromosome I의 경우 7429기!, chromosome II의 경우 481071], chromosome III의 경우 5730개, chromosome IV의 경우 4537개, chro mosome V의 경우 6590개가 되며 이를 합치면 29096개가 나온다. 이를 바탕으로 30개의 150 mm agar plate# 준비하여 plate당 ssml 돌연변이체의 genomic DNA library 50, 000 pfh가 되게 조절하여 4"*부위를 probe로 이용해 1 차 screening하였다. 1차 screening결과 30개의 phage를 분리할 수 있었으며, 다시 2차, 3차 screening을 수행하여 최종적으로 T-DNA가 삽입된 부위의 genomic DNA가 존재하는 단일 phage 15개를 분리할 수 있었다.
- 2000)을 하였다. 1 차선별 방법으로 제초제인 bialaphos (30 mgJ)에 대해서 저항성을 가지고 있는 종자를 채종하여 2차선 별 방법으로 여러 스트레스에 대해 저항성 및 감수성을 보이는 돌연변이체를 선별하여 식물의 재료를 준비하였다. 애기장대의 종자를 70% 에탄올을 사용하여 먼저 종자 표면을 멸균한 후, 5% 락스에 10분에서 15분 동안 처리하여 소독하고 멸균수를 이용하여 종자표면에 락스가 묻어있지 않도록 7번 씻어 주었다.
- 1차 선별된 종자들을 각각 MS salt, 2% sucrose, 1.2% agar (pH 5.7)의 식물배지에 심은 후, 4°C에서 밤 상태로 4일 동안 춘화처리 하였다. 식물 배양실에 옮겨, 4일 동안 키워, 뿌리의 길이가 1 ~1.
- 7)의 식물배지에서 4일 동안 키워, 식물의 뿌리 길이가 1-1-5 cm가 된 애기장대를 다양한 농도의 NaCl와 mannitol함유된 배지에 옮겨 주었다. 9~11 일 사이에 대조군인 wild-type와 sosl 돌연변이체와 비교하여 차이를 보이는지를 관찰하고 위의 실험을 3 번 반복하여 검증하고 그래프로 나타내었다.
- DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 돌연변이체의 genomic DNA를 최대한 깨끗하게 분리하였다. 미리 BamR 1/ EcoR I 제한효소로 잘라서 나온 XEMBL3 phage vector (Giga Pack Gold Kit, Stratagene)0]] 넣기 위해 돌연변이체의 genomic DNA를 BamH I 제한효소로 절단하여 vector에 ligase를 이용해 붙여주었다.
- Genomic DNA의 농도가 20 ug 되도록 맞추어 Bam\A I, EcoR I, Sal I, BamH 1/ EcoR I의 제한효소로 절단하여 0.8% agarose gel에 걸어 50V로 8시간 동안 전기영동을 하였다. Gel위에 nylon membrane (Schleicher & Schuell BioScience, [nc, )을 놓고, membrane에 genomic DNA> 옮겨주었다.
- Hexadecyltrimethylammonium bromide를 이용하여 대조군인 wild・type과 돌연변이체의 잎에서 genomic DNA를 추출하였다. Genomic DNA의 농도가 20 ug 되도록 맞추어 Bam\A I, EcoR I, Sal I, BamH 1/ EcoR I의 제한효소로 절단하여 0.
- Mutant genomic DNA library screening을 통해 알아낸 T-DNA 상의 위치에 맞게 forward primer (5'-CTCATT・ GGCAGGGATTGTTCTGGAG-3', A. thaliana chromosome 1 의 염기서열 10016281 부터 10016306까지), reverse primer (5'-CAATAT ATACCATTCTTCTGTGCACCGG-3', A.thalianachromosome 1 의 염기서열 10015429부터 10015457 까지), left border primer (5'-GTAATACGACTCACTA-TAGGG C・3)를 설계하여 대조군인 wild-type와 돌연변이체의 genomic DNA를 가지고 위의 primer를 각각 짝지어 PCR반응을 시켰다. PCR조건은 95°C에서 먼저 5분 반응시킨 후, 95°C에서 2분, 55°C에서 30초, 72E에서 1분씩 30번 반복 반응시킨 후, 72°C에서 10분 마지막 반응을 시킨 후에 1% agarose gel에 전기영동하였다.
- ssml 돌연변이체의 genome내 T-DNA가 삽입된 부위를 찾기 위하여 AmpR부위를 probe로 사용하여 genomic DNA library screening을 수행하였다. Figure 4에서와 같이 먼저 ssml 돌연변이체의 genomic DNA를 BamH I 제한효소로 절단한 후, XEMBL3 phage vector에 넣어 phage particle로 packing해 준 후에 E.
- ssml 돌연변이체의 genome내에 T-DNA가 삽입 되었는지와 몇 copy의 유전자가 들어있는지를 확인하기 위하여, wild-type과 ssml 돌연변이체의 genomic DNA를 3종류의 제한효소로 잘라 T-DNA에 존재하는, AmpR와 35S pro moter 부위를 probe로 사용하여 Southern blot 분석 실험을 수행하였다. 그 결과 wild-type에 존재하는 band를 제외하고 ssml 돌연변이체에서는 BamH L와 BamH I/EcoR I 제한효소를 처리한 line에서는 한 band가, EcoR I 제한효소를 처리한 line에서는 세 band가 보인다는 결과를 통해 T-DNA 가 ssml 돌연변이체의 genome 안에는 최소 3개가 존재하며 이 중 하나 이상이 특정 유전자 발현에 이상을 초래했을 것임을 알 수 있었다 (Figure 3).
- ssml 돌연변이체의 고염에 대한 감수성을 검정하기 위해, 식물이 고염 스트레스에 노출되었을 때 받게 되는 이온 독성 스트레스와 세포내 삼투압의 불균형에서 오는 스트레스에 모두 관련이 있는지 혹은 한 부분에만 관련이 있는지를 확인하기 위하여 농도별로 이온 독성 스트레스에 관련된 NaCl과 삼투압 스트레스에 관련된 mannitol이 함유된 배지에 wild-type (C24)와 NaCl에 대해서 감수성을 지닌 것으로 잘 알려진 sosl 돌연변이체를 대조군으로 하여 ssml 돌연변이체와 같이 뿌리 길이 측정 실험을 수행하였다 (Figure 2A). 농도별로 측정한 결과를 그래프로 나타내어 살펴본 결과 ssml 돌연변이체는 NaCl와 mannitol이 함유된 배지에서 각각 wild-type에 비 해 뿌리가 잘 자라지 못하는 감수성 표현형을 보임을 알 수 있었다 (Figure 2B, C).
- 이러한 선별과정을 통하여 49개 돌연변이체를 선별하였으며 , 이렇게 선별되어진 돌연변이체는 T3세대를 거쳐 안정된 돌연변이체를 확보하였다. 다시 위와 동일한 과정을 거쳐 이 돌연변이체가 염에 대해 대조군에 비해서 감수성을 가지고 있는지를 검증하였다.
- 미리 BamR 1/ EcoR I 제한효소로 잘라서 나온 XEMBL3 phage vector (Giga Pack Gold Kit, Stratagene)0]] 넣기 위해 돌연변이체의 genomic DNA를 BamH I 제한효소로 절단하여 vector에 ligase를 이용해 붙여주었다. Phage의 particle로 packaging해 준 후, E.
- 스트레스에 대한 뿌리 길이를 측정하기 위하여, 먼저 MS salt, 2% sucrose, 1.2% agar (pH 5.7)의 식물배지에서 4일 동안 키워, 식물의 뿌리 길이가 1-1-5 cm가 된 애기장대를 다양한 농도의 NaCl와 mannitol함유된 배지에 옮겨 주었다. 9~11 일 사이에 대조군인 wild-type와 sosl 돌연변이체와 비교하여 차이를 보이는지를 관찰하고 위의 실험을 3 번 반복하여 검증하고 그래프로 나타내었다.
- 7)가 들어간 것을 사용하였다. 식물을 발아시키기 전, 4°C에서 밤 상태로 4일 동안 춘화처리를 하였다. 식물 배양실내의 온도는 22±2°C, 빛 양은 장일조건 (낮 16시간, 밤 8시간)으로 조정된 것을 사용하였다.
- 애기 장대 (ecotype C24)에 pSKI015를 이용하여 T-DNA를 삽입한 돌연변이체의 종자를 받아 바스타로 T-DNA가애기 장대의 genome안에 삽입되었는지 확인한 후, 2차적으로 150 mMNaCl이 함유된 배지에서 대조군에 비해 잘 자라지 못하는 ssml (salt stress-sensitive 끄utant)을 선별하였다.
- 애기장대 (Arabidopsis thaliana, ecotype C24)에 pSKI015 vector (provided by Weigel D.; Weigel D et al. 2000)를사용하여 T-DNA activation tagging (Weigel D et al. 2000)을 하였다. 1 차선별 방법으로 제초제인 bialaphos (30 mgJ)에 대해서 저항성을 가지고 있는 종자를 채종하여 2차선 별 방법으로 여러 스트레스에 대해 저항성 및 감수성을 보이는 돌연변이체를 선별하여 식물의 재료를 준비하였다.
- 1 차선별 방법으로 제초제인 bialaphos (30 mgJ)에 대해서 저항성을 가지고 있는 종자를 채종하여 2차선 별 방법으로 여러 스트레스에 대해 저항성 및 감수성을 보이는 돌연변이체를 선별하여 식물의 재료를 준비하였다. 애기장대의 종자를 70% 에탄올을 사용하여 먼저 종자 표면을 멸균한 후, 5% 락스에 10분에서 15분 동안 처리하여 소독하고 멸균수를 이용하여 종자표면에 락스가 묻어있지 않도록 7번 씻어 주었다. 식물배지는 MS salt, 2% sucrose, 1.
- 이러한 현상은 T-DNA가 애기 장대의 genome 내에 끼어 들어가면서 일어난 간섭 현상으로 알려져 있다. 염기서열 분석을 통해 알게 된 T-DNA가 들어간 위치를 확인하기 위하여 primer를 T-DNA가 들어간 부위에 맞게 forward, reverse, left border primer를 설계하여, 3종류의 primer로 각각 쌍을 지어 diagnostic PCR을 수행하였다 (Figure 5B, C). Wild-type에서는 forward와 reverse primer로 PCR을 수행하여 800 bp의 band가 존재하는 것을 확인 할 수 있었지만 다른 primer의 쌍으로 PCR을 수행했을 때는 band가 존재하지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 현재까지 연구된 고염 스트레스에 대한 저항성 기작 및 유전학적 요소들이 많이 밝혀졌는데도 불구하고 아직 많은 연구를 필요로 하고 있다. 그래서 본 연구에서는 모델식물로 잘 알려진 애기장대에 PSK1015 vector로 T-DNA를 삽입하여 고염 스트레스에 대해 감수성을 보이는 돌연변이체, ssml 돌연변이체를 선별하였다. ssml 돌연변이체는 고염 스트레스를 받게 되면 이온의 독성 스트레스와 세포내 삼투압의 불균형에서 오는 스트레스에 대해 대조군에 비해 감수성을 보였다.
- 5 cm가 된 식물을 150 mM NaCl가함유된 배지로 옮겨주었다. 대조군인 wild-type의 뿌리와 비교했을 때, 뿌리가 잘 자라지 못하는 salt-hypersensitive 돌연변이체를 선별하였다. 이러한 선별과정을 통하여 49개 돌연변이체를 선별하였으며 , 이렇게 선별되어진 돌연변이체는 T3세대를 거쳐 안정된 돌연변이체를 확보하였다.
- 애기장대의 종자를 70% 에탄올을 사용하여 먼저 종자 표면을 멸균한 후, 5% 락스에 10분에서 15분 동안 처리하여 소독하고 멸균수를 이용하여 종자표면에 락스가 묻어있지 않도록 7번 씻어 주었다. 식물배지는 MS salt, 2% sucrose, 1.2% agar (pH 5.7)가 들어간 것을 사용하였다. 식물을 발아시키기 전, 4°C에서 밤 상태로 4일 동안 춘화처리를 하였다.
- 대조군인 wild-type의 뿌리와 비교했을 때, 뿌리가 잘 자라지 못하는 salt-hypersensitive 돌연변이체를 선별하였다. 이러한 선별과정을 통하여 49개 돌연변이체를 선별하였으며 , 이렇게 선별되어진 돌연변이체는 T3세대를 거쳐 안정된 돌연변이체를 확보하였다. 다시 위와 동일한 과정을 거쳐 이 돌연변이체가 염에 대해 대조군에 비해서 감수성을 가지고 있는지를 검증하였다.
성능/효과
- 이를 바탕으로 30개의 150 mm agar plate# 준비하여 plate당 ssml 돌연변이체의 genomic DNA library 50, 000 pfh가 되게 조절하여 4"*부위를 probe로 이용해 1 차 screening하였다. 1차 screening결과 30개의 phage를 분리할 수 있었으며, 다시 2차, 3차 screening을 수행하여 최종적으로 T-DNA가 삽입된 부위의 genomic DNA가 존재하는 단일 phage 15개를 분리할 수 있었다.
- Genomic DNA library screening통해, SSM1 은 vesicular/ target membrane 융합에 관여하는 syntaxin 단백질인 AtSYP61/OSMl임을 알 수 있었다. 이 단백질은 동식물의 세포막 융합에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 건조 스트레스를 식물이 받게 되었을 때, ABA 의존적인 신호전달을 통해 잎의 기공개폐를 조절하는 것으로 알려져 있다 (Zhuet al.
- Mutant genomic DNA library screening을 통해 얻은 단일 phage에서 入DNA를 분리하여 염기서열 분석한 결과를 NCBI의 database 프로그램을 통해 검색해 본 결과, 애기장대 chromosome 1의 F3M18/AtSYP61/OSMl (Atlg28490; 19)의 ATG 번역 개시 codon을 중심으로 상위 529 bp 위치에 T-DNA가 삽입되었다는 것을 알 수 있었다 (Figure 5A). 이 결과를 바탕으로 하여 T-DNA를 중심으로 좌우 genomic DNA를 조사해본 결과, BAC clone F3M18의 nucleotide 258기부터 25952까지의 82 bp와 T-DNA의 left border의 46 bp가 genomic DNA상에 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
- ssml 돌연변이체는 NaCl와 mannitol에 대해 각각 대조군에 비해 뿌리가 잘 자라지 못하는 표현형을 보였으며 이 결과를 바탕으로 SSMl이 이온의 농도와 삼투압 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 유전자임을 알 수 있었다 (Figure 2). ssml 돌연변이체의 돌연변이가 일어난 부위를 찾기 위하여 thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) 과 inverse PCR (i-PCR)를 수행하였지만 left border부위가 ssml 돌연변이체의 genomic DNA 상에 부분적으로 존재하지 않았기 때문에 기존의 map-based cloning을 수행할 수밖에 없었다.
- ssml 돌연변이체는 고염 스트레스를 받게 되면 이온의 독성 스트레스와 세포내 삼투압의 불균형에서 오는 스트레스에 대해 대조군에 비해 감수성을 보였다. ssml 돌연변이체의 genomic DNA 상의 T-DNA가 삽입된 부위를 찾기 위하여 genomic DNA mutant library screening을 수행한 결과, 기존의 알려진 syntaxin 기능 및 환경 스트레스에 관련된 F3M18L4tSYP6HOSMI임을 알 수 있었다.
- 그 결과 wild-type에 존재하는 band를 제외하고 ssml 돌연변이체에서는 BamH L와 BamH I/EcoR I 제한효소를 처리한 line에서는 한 band가, EcoR I 제한효소를 처리한 line에서는 세 band가 보인다는 결과를 통해 T-DNA 가 ssml 돌연변이체의 genome 안에는 최소 3개가 존재하며 이 중 하나 이상이 특정 유전자 발현에 이상을 초래했을 것임을 알 수 있었다 (Figure 3).
- 하지만 이 방법은 기술적, 시간적으로 문제점이 있었기 때문에 새로운 방법을 고안해 낼 필요성을 느꼈다. 그래서 고안해 낸 방법이 T-DNA가 300-500 bp만 존재하여도 genome내에서 찾을 수 있는 genomic DNA library screening이였다.
- 농도별로 측정한 결과를 그래프로 나타내어 살펴본 결과 ssml 돌연변이체는 NaCl와 mannitol이 함유된 배지에서 각각 wild-type에 비 해 뿌리가 잘 자라지 못하는 감수성 표현형을 보임을 알 수 있었다 (Figure 2B, C). 또한 현미경을 통해 위의 실험에서 사용한 wild-type과 ssml 돌연변이체의 뿌리 생장점을 중심으로 하여 뿌리의 끝부분을 관찰해본 결과, ssml 돌연변이체가 wild・type에 비해 고염 스트레스를 받았을 때 감수성의 한 표현형으로 나타나는 세포 사멸의 한 형태로 뿌리의 세포가 많이 부풀어 올라 있는 것을 알 수 있었다 (Figure 2D).
- 농도별로 측정한 결과를 그래프로 나타내어 살펴본 결과 ssml 돌연변이체는 NaCl와 mannitol이 함유된 배지에서 각각 wild-type에 비 해 뿌리가 잘 자라지 못하는 감수성 표현형을 보임을 알 수 있었다 (Figure 2B, C). 또한 현미경을 통해 위의 실험에서 사용한 wild-type과 ssml 돌연변이체의 뿌리 생장점을 중심으로 하여 뿌리의 끝부분을 관찰해본 결과, ssml 돌연변이체가 wild・type에 비해 고염 스트레스를 받았을 때 감수성의 한 표현형으로 나타나는 세포 사멸의 한 형태로 뿌리의 세포가 많이 부풀어 올라 있는 것을 알 수 있었다 (Figure 2D). Figure 2를 통해서 ssml 돌연변이체가 이온 독성과 세포내 삼투압의 불균형에서 오는 스트레스에 대해 감수성을 가지고 있다는 것을 결론 내릴 수 있었으며, SSM1 은 고염의 세포내의 이온의 농도와 삼투압의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 유전자가 결핍된 돌연변이체라는 것을 알수가 있었다.
- 이와 달리 ssml 돌연변이체에서는 reverse와 left border primer로 PCR을 수행하여, 400 bp의 band가 존재하는 것을 확인 할 수 있었지만, 다른 primer의 쌍에서는 band를 확인할 수 없었다. 이 결과를 바탕으로 ssml 돌연변이체의 T-DNA의 삽입 부위가 앞서 염기 서열 분석으로 확인한 결과와 일치하며 SSM1 이 F3M18lAtSYP6HOSMl임을 알 수 있었다.
- 5A). 이 결과를 바탕으로 하여 T-DNA를 중심으로 좌우 genomic DNA를 조사해본 결과, BAC clone F3M18의 nucleotide 258기부터 25952까지의 82 bp와 T-DNA의 left border의 46 bp가 genomic DNA상에 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이러한 현상은 T-DNA가 애기 장대의 genome 내에 끼어 들어가면서 일어난 간섭 현상으로 알려져 있다.
- DNA상에 BamHI의 전달 부위 가 있을 확률은 46=4096이 다. 이 확률을 바탕으로, 애기장대의 genomic DNA상에 BamW I 제한효소로 절단될 수 있는 조각의 수는 애기장대의 chromosome I의 경우 7429기!, chromosome II의 경우 481071], chromosome III의 경우 5730개, chromosome IV의 경우 4537개, chro mosome V의 경우 6590개가 되며 이를 합치면 29096개가 나온다. 이를 바탕으로 30개의 150 mm agar plate# 준비하여 plate당 ssml 돌연변이체의 genomic DNA library 50, 000 pfh가 되게 조절하여 4"*부위를 probe로 이용해 1 차 screening하였다.
- 고염 스트레스의 경우에도 식물은 이를 하나의 신호로 인지하고 이에 대응할 수 있도록 많은 유전자들을 발현, 조절하여 식물이 고염에 대해 저항성을 갖도록 작용한다. 현재까지 알려진 적응 기작은앞에서 서술한 바와 같이 이온 독성을 막기 위하여 이온 수송체의 세포막을 통한 Na*이온의 유출 및 통제, 액포로의 Na*이온 격리, 삼투압 스트레스에 대한 대응으로 스트레스 관련 호르몬인 ABA에 의한 전사 인자들의 조절, osmolyte 생산 및 축적, 물수송체를 이용한 물 수송 조절 및 장거리수송 반응 등과 같이 하나의 기작의 작용이 아닌 식물체의 다양한 요소들의 종합적인 조절에 의해 수행되어 진다는 것을 알 수 있었다. 하지만 현재까지 알려진 사실만으로는 식물의 고염 스트레스에 대한 적응 기작의 전체적인 그림을 그리기에 부족한 점이 많다.
후속연구
- 하지만 현재까지 AtSYP61 이 Ca2+ channel을 조절하여 건조및 고염 스트레스에 대한 적응 기작을 보인다는 실험적 결과는 없다. 그러므로 SSM〃AtSYP61/OSMl 이 고염 스트레스를 받게 되었을 때, Ca*을 활성화 시켜 신호를 전달하는 역할을 할 것으로 예측할 수있으며, 이를 바탕으로 고염스트레스와 Ca2+및 syntaxin 단백질 사이의 관계 및 정확한 역할을 밝히기 위한 연구를 통하여 OSM1 의 기능을 규명하는 것은 흥미로울 것으로 사려 된다.
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