급속냉동된 쥐 치아의 in vivo MTT 검색법을 이용한 치주인대세포 활성도 평가 EVALUATION OF PERIODONTAL LIGAMENT CELL VIABILITY IN RAT TEETH AFTER FROZEN PRESERVATION USING IN-VIVO MTT ASSAY원문보기
본 연구의 목적은 흰쥐 상악 대구치를 발거 한 후 급속 냉동보존을 통해 치아를 보관하였을 때 in vivo MTT 검색법을 이용하여 치주인대세포의 활성도를 측정하고자 하였다. 실험 방법은 74마리 4주령의 암컷 Sprague-Dawley계의 흰쥐를 사용하여 각군당 10마리의 쥐에서 상악 좌우 제1, 2 대구치를 발거하여 모두 40개의 치아를 사용하였다. 대조군은 즉시 발치군이며 냉동군은 F medium에 5% Dimethylsulfoxide (DMSO) 6% Hydroxyethyl starch (HES)를 포함한 군(1군), 10% DMSO를 포함한 군(2군) 그리고 $Viaspan^(R)$에 5% DMSO 6% HES(3군), 10% DMSO를 포함한 군 (4군)으로 나누어 1주일간 액체질소에 냉동한 뒤 해동하였다. 냉장군은 F medium (5군)와 $Viaspan^(R)$ (6군)에 넣어 1주간 $4^{\circ}C$ 냉장고에서 보관하였다. 냉동 및 냉장보존한 후에는 in vivo MTT검색법을 시행하였다. 개개 치아의 치근면 단위면적으로 표준화하기 위해 치근을 1% eosin Y 용액에 12시간 담근 후 1% acid alcohol로 용해시켜 530 nm에서 측정한 흡광도 값을 in vivo MTT 측정값으로 나누었다. 통계 분석을 위해 Two way ANOVA와 Duncan's Multiple Range Test를 95% 신뢰 구간에서 시행하였다. 그리고 각 군당 2개의 치아를 같은 방법으로 처리한 후 $10{\mu}m$ 두께로 냉동 절단하여 광학 현미경과 편광 현미경하에서 관찰하였다. 1, 2군은 3, 4군보다. 높은 흡광도를 나타내었으며 6군은 5군보다. 높은 흡광도를 나타내었다(p<0.05). 광학 현미경 관찰에서 MTT 결정은 파란색을, 편광현미경에서는 밝은 오렌지색을 나타내었고 전체적으로 in vivo MTT검색법의 결과와 같은 양상을 나타내었다. 본 연구의 결과 5%, 10% DMSO를 사용한 F medium 배지로 냉동보존한 경우가 $Viaspan^(R)$을 배지로 냉동하였을 때나 냉장보존 하였을 때보다 통계적으로 유의차 있게 높은 세포 활성도를 나타내었다(p<0.05).
본 연구의 목적은 흰쥐 상악 대구치를 발거 한 후 급속 냉동보존을 통해 치아를 보관하였을 때 in vivo MTT 검색법을 이용하여 치주인대세포의 활성도를 측정하고자 하였다. 실험 방법은 74마리 4주령의 암컷 Sprague-Dawley계의 흰쥐를 사용하여 각군당 10마리의 쥐에서 상악 좌우 제1, 2 대구치를 발거하여 모두 40개의 치아를 사용하였다. 대조군은 즉시 발치군이며 냉동군은 F medium에 5% Dimethylsulfoxide (DMSO) 6% Hydroxyethyl starch (HES)를 포함한 군(1군), 10% DMSO를 포함한 군(2군) 그리고 $Viaspan^(R)$에 5% DMSO 6% HES(3군), 10% DMSO를 포함한 군 (4군)으로 나누어 1주일간 액체질소에 냉동한 뒤 해동하였다. 냉장군은 F medium (5군)와 $Viaspan^(R)$ (6군)에 넣어 1주간 $4^{\circ}C$ 냉장고에서 보관하였다. 냉동 및 냉장보존한 후에는 in vivo MTT검색법을 시행하였다. 개개 치아의 치근면 단위면적으로 표준화하기 위해 치근을 1% eosin Y 용액에 12시간 담근 후 1% acid alcohol로 용해시켜 530 nm에서 측정한 흡광도 값을 in vivo MTT 측정값으로 나누었다. 통계 분석을 위해 Two way ANOVA와 Duncan's Multiple Range Test를 95% 신뢰 구간에서 시행하였다. 그리고 각 군당 2개의 치아를 같은 방법으로 처리한 후 $10{\mu}m$ 두께로 냉동 절단하여 광학 현미경과 편광 현미경하에서 관찰하였다. 1, 2군은 3, 4군보다. 높은 흡광도를 나타내었으며 6군은 5군보다. 높은 흡광도를 나타내었다(p<0.05). 광학 현미경 관찰에서 MTT 결정은 파란색을, 편광현미경에서는 밝은 오렌지색을 나타내었고 전체적으로 in vivo MTT검색법의 결과와 같은 양상을 나타내었다. 본 연구의 결과 5%, 10% DMSO를 사용한 F medium 배지로 냉동보존한 경우가 $Viaspan^(R)$을 배지로 냉동하였을 때나 냉장보존 하였을 때보다 통계적으로 유의차 있게 높은 세포 활성도를 나타내었다(p<0.05).
The purpose of this study was to examine the viability of PDL cells in rat molars by using in vivo MTT assay, which was used to compare fast cryopreservation group by liquid nitrogen $(-196^{\circ}C)\;with\;4^{\circ}C$ cold preservation group. A total of 74 Sprague-Dawley white female rat...
The purpose of this study was to examine the viability of PDL cells in rat molars by using in vivo MTT assay, which was used to compare fast cryopreservation group by liquid nitrogen $(-196^{\circ}C)\;with\;4^{\circ}C$ cold preservation group. A total of 74 Sprague-Dawley white female rats of 4 week-old with a body weight of 100 grams were used. The maxillary left and right, first and second molars were extracted as atraumatically as possible under ketamine anesthesia. Ten teeth of each group were divided as six experimental groups depending upon the preservation. Cryopreservation groups were Group 1 (5% DMSO 6% HES in F medium) Group 2 (10% DMSO in F medium), Group 3 (5% DMSO 6% HES in $Viaspan^(R)$). Group 4 (10% DMSO in $Viaspan^(R)$) which were cryopreserved for 1 week and cold preservation groups were Group 5 (F medium) , Group 6 ($Viaspan^(R)$) at $4^{\circ}C$ for 1 week. Immediate extraction group was used as a control. After preservation and thawing, the in vivo MTT assay was processed. Two way ANOVA and Duncan's Multiple Range Test was performed at the 95 % level of confidence, Another 2 teeth of each group were treated as the same manner and frozen sections $10{\mu}m$ thick for microscopic observation. The value of optical density obtained after in vivo MTT analysis was divided by the value of eosin staining for tissue volume standardization. Group 1, 2 had significantly higher optical density than Group 3 and 4 which had the lowest OD value. Group 6 had higher OD value than in Group 5 (P<0.05). Histological findings of periodontal ligament cell, after being stained with MTT solution were consistent with the in vivo MTT assay results. In this study, the groups which were frozen with DMSO as a cryoprotectant and the groups with F medium showed the best results.
The purpose of this study was to examine the viability of PDL cells in rat molars by using in vivo MTT assay, which was used to compare fast cryopreservation group by liquid nitrogen $(-196^{\circ}C)\;with\;4^{\circ}C$ cold preservation group. A total of 74 Sprague-Dawley white female rats of 4 week-old with a body weight of 100 grams were used. The maxillary left and right, first and second molars were extracted as atraumatically as possible under ketamine anesthesia. Ten teeth of each group were divided as six experimental groups depending upon the preservation. Cryopreservation groups were Group 1 (5% DMSO 6% HES in F medium) Group 2 (10% DMSO in F medium), Group 3 (5% DMSO 6% HES in $Viaspan^(R)$). Group 4 (10% DMSO in $Viaspan^(R)$) which were cryopreserved for 1 week and cold preservation groups were Group 5 (F medium) , Group 6 ($Viaspan^(R)$) at $4^{\circ}C$ for 1 week. Immediate extraction group was used as a control. After preservation and thawing, the in vivo MTT assay was processed. Two way ANOVA and Duncan's Multiple Range Test was performed at the 95 % level of confidence, Another 2 teeth of each group were treated as the same manner and frozen sections $10{\mu}m$ thick for microscopic observation. The value of optical density obtained after in vivo MTT analysis was divided by the value of eosin staining for tissue volume standardization. Group 1, 2 had significantly higher optical density than Group 3 and 4 which had the lowest OD value. Group 6 had higher OD value than in Group 5 (P<0.05). Histological findings of periodontal ligament cell, after being stained with MTT solution were consistent with the in vivo MTT assay results. In this study, the groups which were frozen with DMSO as a cryoprotectant and the groups with F medium showed the best results.
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문제 정의
Colangelo 등은睥 MTT 검색법에서 환원된 Formazan 결정을 편광현미경하에서 밝은 결정이 보이는 것을 이용하여 noncolorimetric pixel analysis을 통하여 분석하였다. 이 에 본 연구는 냉장보관과 냉동보관을 통해 치 아를 보관하였을 때 in vivo MTT 검색법을 이용하여 치주 인대 세포의 활성도를 측정하고자 하였다.
제안 방법
F medium에 DMSO를 10% 첨가한 보관 용액을 4℃ 상에서 보관한 후 발거된 치아를 PBS로 세척하고 F medi- um에 2.5%, 5%, 7.5% DMSO를 첨가한 용액에 단계적으로 5분간씩 넣은 후 2 诚 냉동튜브에 F medium에 10% DMSO 혼합 용액 1 戒와 함께 넣고 5분 후에 -196℃의 액체질소 냉동고에 넣어 1주일간 냉동상태로 보관하였다.
87 M/mni이며 부위에 따라 상당한 차이가 있음을 보고하였다. Jeone由 Hematoxylin Eosin 검색을 이용하여 치주인대세포의 양을 정량적으로 분석할 때 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그러나 Hematoxylin 과 Eosine 각각 염기성과 산성 염색 염료로서 흡광도도 590 nm, 530 岫挽로 서로 다르므로 두 가지 염색을 한 가지 파장으로 분석하는 것보다는 단일 염색, 단일파장으로 분석하는 것이 타당하다.
Ketamine (유한케타민, Yuhan co., Seoul, Korea 0.1 ml/100 g) 마취 하에 접근이 가장 용이한 좌, 우측 상악 제 1, 2 대구치 (Ml, M2)를 모두 발거하여 이들 치아를 MTT 검색법과 냉동 절단법을 이용한 조직학적 관찰에 모두 사용하였다.
각 군당 상악 제 1, 2 대구치 각각 2개 치아를 발거한 후 MTT 검색에서와 같이 치아를 MTT 용액이 있는 각 well에 담근 후 알루미늄 foil로 96-well plate를 싸서 3시간 동안 37℃에서 배양해서 MTT가 환원되도록 했다. 음성 대조군으로 MTT염색을 하지 않은 치근을 사용하였다.
각 실험군의 처리가 끝난 뒤에 96-well plate에 노란색의 MTT 용액 (0.05 mg/m, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 200 以를 넣고 각 군당 제1, 2대구치각각 40개 치아를 MTT 용액이 있는 각 well에 담았다. 이때 혈액 내의 혈구세포 개재 가능성을 최소화하기 위하여 식염수로 치근면을 깨끗이 세척하였다.
냉동 절편의 조직현미경적 관찰에서 formazan crystal 은 광학 현미 경하에서 파란색으로 , 편광현미경에서는 밝은 오렌지색으로 나타났으며 전체적인 양상은 MTT흡광도 수치와 비례 하였다.
5M EDTA에 1 주일간 4℃에서 탈회시켰다. 냉동절단을 위해 Tissue-Tek O.C.T (Optimal Cutting Temperature) Compound® (Sakura co. Torrance, CA, USA)로 포매한 후 -2 此에서 냉동시킨 다음 광학 현미경 관찰을 위해 즉시 10 ㎛ 두께로 냉동절단기 (LEICA® CM3050 S, Germany)로 절단하여 표본을 제작하였으며 음성대조군을 제외한 나머지 군의 치아 시편에 현미경 관찰시 주위조직과의 뚜렷한 차이를 보여주기 위한 대조염색으로 Nuclear Fast Red (Sigma, St. Lousis, MO, USA)를 사용하여 7분간 염색하였다. 현미경상에서 보이는 치근면상의 특징적인 MTT formazan 결정의 형태 및 분포 차이를 광학현미경과 편광현미경 하에서 40, 100, 200, 400배율로 관찰한 후 Olympus Vanox AH2 현미경 (Olympus optical co.
냉장보관과 냉동보관을 통해 치아를 보관한 후 in vivo MTT 검색법을 이용하여 치주인대세포의 활성도를 측정하여 다음의 결과를 얻었다. 급속냉동시에는 F medium을 배지로 사용한 5% DMSO 6% HES 함유군과 10% DMSO 함유군에서 Viaspan®냉동군 비해 높은 MTT 흡광도 수치를 나타내었다 (p<0.
그러나 Hematoxylin 과 Eosine 각각 염기성과 산성 염색 염료로서 흡광도도 590 nm, 530 岫挽로 서로 다르므로 두 가지 염색을 한 가지 파장으로 분석하는 것보다는 단일 염색, 단일파장으로 분석하는 것이 타당하다. 따라서 본 실험에서는 Eosin 염색을 통해 발거된 치아의 치주인대 양을 정량적으로 표현 하였다. ' 냉동절편을 이용한 광학현미경과 편광현미경의 관찰에 있어서 formazan결정 이 편광현미경에서 밝은 자주색의 결정으로 나타난다.
37℃ 수욕조에 넣어 해빙하였다. 배지가 액체 상태로 되었을 때 수욕조에서 치아를 꺼내어 F medium과 Viaspan® 의 10% DMSO 함유군 (2군, 4군)은 해빙 후 치아를 4℃ 상에서 7.5%, 5%, 2.5%, 0% DMSO가 함유된 각각의 F medium, Viaspan®용액에 5분간씩 순차적으로 넣어 DMSO를 제거한 후 MTT 검색에 사용하였다.
그러나 이 속도는 세포막을 통한 수분의 이동 능력 에 따라 결정 된다. 본 실험에서는 치아를 직접 -196℃의 액체 질소통에 넣는 급속 냉동법을 이용하여 냉동 보관하였는데 이때 세포 내에서의 얼음 결정을 방지하지는 못할 것이며 이것이 치주 인대 세포에 어느 정도 영향을 미쳤을 것이다.
실험에 사용된 치아의 치근면에 붙어있는 치주조직의 양을 정량적으로 측정하기 위해 MTT 검색 실험 후 각 군의 well에서 제거된 치아를 각 군별로 96-well plate에 치아를 넣고 eosin (1% eosin Y Muto pure chemical co. Ltd, Tokyo, Japan) 350 μI를 첨가하여 12시간 정도 염색한 후에 치 아를 제거하여 다른 well에 넣은 뒤 치 아의 탈회 없이 염색된 치주조직 부위를 깨끗이 탈색시키기 위해 치아에 1% acid alcohol 350 pl (70% ethyl alcohol, 1% HC1) 를 넣고 1시간 동안 담가두어 탈색시켰다. 그 후 치아를 각각의 96-well plate에서 꺼낸 다음 탈색된 well내의 용액을 ELISA microplate reader에 넣고 530 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험에 사용한 보존용액으로 F mediume Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, NY, USA)과 Ham's nutrient mixtures F12 (Gibco-BRL, NY, USA)를 3 : 1의 비로 섞고 10% fetal bovine serum (FBS)와 항생제 penicillin (100 units/问), streptomycin (100(4/ml), fungizone (0.3 ug/ml) (Gibco- BRL)을 첨가하여 제조하였다.
Lousis, MO, USA)를 사용하여 7분간 염색하였다. 현미경상에서 보이는 치근면상의 특징적인 MTT formazan 결정의 형태 및 분포 차이를 광학현미경과 편광현미경 하에서 40, 100, 200, 400배율로 관찰한 후 Olympus Vanox AH2 현미경 (Olympus optical co., Tokyo, Japan)과 연결시킨 디지털 카메라 (Leica DC 300F, Leica Microsystems ltd., Heerbrugg, Switzerland)로 대표적인 부위를 촬영하였다.
대상 데이터
각 군당 10마리의 쥐에서 40개의 치아를 발거하여 MTT 검색법에 사용하였으며 formazan 결정을 관찰하기 위해 냉동 절단에 4마리의 쥐 에서 14개 치아를 사용하였다.
냉동시 세포질내 동해방지제로는 DMSO (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, USA), 세포질외 동해방지제로 HES (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, USA) 를 사용하였다.
대조군으로는 즉시 발치군을 사용하였다.
생후 4주된 건강하고 평균 체중 100 gm 내외의 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 74마리를 이용하였다. 발치를 용이하게 하기 위해 0.
배양해서 MTT가 환원되도록 했다. 음성 대조군으로 MTT염색을 하지 않은 치근을 사용하였다. 4% paraformaldehyde로 조직을 고정한 후 0.
데이터처리
MTT 및 Eosin 검색법 에서 얻은 흡광도 (OD)는 실험군과 Ml, M2와 차이를 two-way ANOVA로 분석하였으며, Ml, M2는 각각 one-way ANOVA로 군간의 유의차를 구했으며 군의 순위 비교는 Duncan's Multiple Range Test 를 사용하였다. 그리고 각 군 간의 통계분석법은 95% 신뢰수준이다.
성능/효과
통계적인 유의차가 없었다. Eosin염색의 측정값이 치근면의 세포의 양을 의미하므로 치근의 단위면적으로 환산된 MTT/Eosin의 비는 전체치아의 비교에서 MTT 흡광도의 결과와 마찬가지로 1군과 2군에서는 유의차가 없었으며 3, 4군에서 유의차 있게 낮은 MTT/Eosin 비를 나타내었다. 그리고 Viaspan® 에 냉장보관한 군 (6군)에서 F medi- um에 냉장보관한 군 (5군)보다 유의차 있게 높은 MTT/ Eosin비 가 나왔다 (Figure 2).
F medium, Viaspan® 냉장군은 DMSO를 첨가한 F medium 냉동군보다 낮은 MTT 흡광도 수치를 나타냈다 (P< 0.05).
Viaspan®에 냉동보관한 군 (3, 4군)에서는 F medium 배지 군보다 낮은 흡광도를 보였으며 통계적인 유의차가 있었다. 냉장보관한 군에서는 Viaspan® 에 냉장보관한군 (6군)에서 F medium에 냉장보관한 군 (5군)보다 유의차 있게 높은 흡광도가 측정되었다 (p < 0.
이 속도 조절 냉동 프로그램을 이용하여 냉동하였을 때 장기 보관용액이 culture medium 보다 낮은 LDH (lactate dehydrogenase) activity를 보였다. 따라서 본 실험에서는 Viaspan® 냉동군이 낮은 치주인대 활성도를 나타낸 이유로 생각되는 것이 FBS첨가 없이 급속 냉동한 결과이며, F medium을 배지로 사용한 군에서 급속 냉동 시어i도'높은 활성도를 나타내는 것은 FBS 가 첨가되었기 때문이라고 생각된다.
그러나 Viaspan® 의 구성 성분 중의 하나인 glu- tathionee 항산화제로 자유라디칼 (free radical) 의 생성을 억제하거나 생성된 free radical을 없애는 기능을 한다. 본 실험에서는 1주일간의 냉장 보관에서는 Via span®냉장군에서 F medium 냉장군에 비해 유의차 있게 높은 세포 활성도를 보였으나 5%, 10% DMSO F medium 냉동군 (Group 1, 2) 보다 낮아 장기 보관하는데 적합하지 못하다고 생각된다. (Figure 2) (P< 0.
본 연구의 범위 안에서, 치아를 1 주일 이상 장기 보관 할 때 4℃ 냉장보관 보다는 냉동보관이 좋은 것으로 판단되었고 Viaspan® 배지보다는 F medium 배지를 사용하는 것이 좋을 것으로 사료된다..
Chesne 등은간 세포를 신장 보관용액으로 사용되는 Hepes, PBS and Euro-Collins와 두 가지 culture medium을 FBS없.이 속도 조절 냉동 프로그램을 이용하여 냉동하였을 때 장기 보관용액이 culture medium 보다 낮은 LDH (lactate dehydrogenase) activity를 보였다. 따라서 본 실험에서는 Viaspan® 냉동군이 낮은 치주인대 활성도를 나타낸 이유로 생각되는 것이 FBS첨가 없이 급속 냉동한 결과이며, F medium을 배지로 사용한 군에서 급속 냉동 시어i도'높은 활성도를 나타내는 것은 FBS 가 첨가되었기 때문이라고 생각된다.
제1, 2 대구치 치근면 치주조직의 정량적 측정을 위해 Eosin 염색을 시행하였을 때 제1대구치 (P = 0.1701) 와제2대구치 (P = 0.3404)에서 각각 군 간의 Eosin 흡광도에서 통계적인 유의차가 없었으며 MTT/ Eosin 흡광 도비에서도 MTT흡광도 수치와 같은 양상을 나타내었다.
현재 간장이나 췌장 등 소화기관의 장기 이식시 보관 용액으로 널리 사용되고 있다. Kime2。쥐 치아를 Viaspan® 에서 1주간 냉장 보관한 후 in vivo MTT검색법을 이용하여 세포 활성도를 측정하였는데 Viaspan® 냉장군에서 다른 치아 보관용액에 비해 현저하게 높은 결과를 보였다. 냉장 상태에서 보관 기간이 길어질 경우 cold ischemia 에 의해서 세포가 괴사되거나 사멸 되는 것으로 알려져 있다3气 이는 ATP의 부족과 반응성 산소계 (reactive oxygen species ; H2O2, O2 , OH ) 의 증가와 arachidonic acid 등으로 인해 lipid peroxidation로 세포막이 변질되기 때문이다 33).
후속연구
이를 이용하여 Colangelo 등은”>pixel image analysis를 시행한바있다. 그러므로 본 실험에서도 냉동 절편에서의 formazan 결정의 정량적인 분석이 컴퓨터 이미지 분석을 이용해 가능할 수도 있다.
따라서 보다 효율적인 치아의 보관방법을 개발하기 위해서는 냉동 후 해동된 치아나 냉장보관된 치아의 치주 인대 세포의 활성도를 효과적으로 평가하는 것이 필요하다. 이전의 연구에서 여러가지 치주인대 활성도의 평가방법이 이용되었다.
차후 냉동의 조건을 더욱 면밀하게 부여 할 수 있는 programmed freezing에 대한 프로토콜의 개발이 필요할 것으로 사료된다. 또한, 조직현미경 하에서치주인대의 세포활성도 평가를 위해 formazan crystal을 현미경 하에서 객관적으로 정량화 할 수 있는 방법의 개발이 필요할 것으로 사료된다.
. 차후 냉동의 조건을 더욱 면밀하게 부여 할 수 있는 programmed freezing에 대한 프로토콜의 개발이 필요할 것으로 사료된다. 또한, 조직현미경 하에서치주인대의 세포활성도 평가를 위해 formazan crystal을 현미경 하에서 객관적으로 정량화 할 수 있는 방법의 개발이 필요할 것으로 사료된다.
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