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문제 정의
- 본 연구에서는 한국인이 섭취하는 음식 중 가장 많은 부분을 차지하는 김치를 대상으로 β-galactosidase (lactase)를 생산하며 한국인의 장내 정착성이 우수한 유산균을 분리하고, 선별된 균주의 인공위액과 담즙에 대한 내성을 조사하여 probiotic으로서의 가능성을 검토하며, pH 및 온도에 대한 효소 활성을 비교, 조사하여 β-galactosidase 활성과 생산에 대한 최적의 조건을 제시하고자 한다.
- 효소 안정성은 가장 중요한 요인 중 하나이다. 본 실험에서는 선별된 β-galactosidase 생산 유산균의 상업적 이용 가능성을 검토하기 위하여 선별 유산균의 생존력과 유산균이 생산하는 β-galactosidase의 안정성에 대한 실험을 수행하였다. 선별 유산균의 생존력과 β-galactosidase 안정성 실험은 온도(저온과 상온)와 배지(MI3 배지와 saline solution) 조건을 서로 조합하여 20일간 보존하면서 측정하였다.
제안 방법
- 분리 균주의 동정은 배양된 균주로부터 Genomic DNA isolation kit (Quiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 chromosomal DNA를 분리하였다. PCR kit (Perkin Elmer Co.
- 분리하였다. PCR kit (Perkin Elmer Co., CT, USA)와 universal primer (9F, 5' -GAGTTTGArCCTGGCTCAG-3, ; 536R, 5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 그 조건은 다음과 같다; denaturation 95℃, 5 min, annealing 60℃, 1 min, extension 72℃, 1 min, final extension 72℃, 10 min, 30 cycles. PCR 반응 후, 1% agarose gel (FMC, ME, USA)을 사용하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다.
- , CT, USA)와 universal primer (9F, 5' -GAGTTTGArCCTGGCTCAG-3, ; 536R, 5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 그 조건은 다음과 같다; denaturation 95℃, 5 min, annealing 60℃, 1 min, extension 72℃, 1 min, final extension 72℃, 10 min, 30 cycles. PCR 반응 후, 1% agarose gel (FMC, ME, USA)을 사용하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. pGEM T-easy vector (Quiagen)와 E.
- PCR 반응 후, 1% agarose gel (FMC, ME, USA)을 사용하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. pGEM T-easy vector (Quiagen)와 E.coli DH5α competent cell을 사용하여 transformation을 수행하였다. QIAprep spin miniprep kit (Qiagen)를 사용하여 plasmid DNA를 추출한 후, 염기서열 결정 및 분석을 수행하였다.
- coli DH5α competent cell을 사용하여 transformation을 수행하였다. QIAprep spin miniprep kit (Qiagen)를 사용하여 plasmid DNA를 추출한 후, 염기서열 결정 및 분석을 수행하였다. 결정된 염기서열 분석은 BLAST Search Program (NCBI)을 통하여 GenBank의 database와 비교 분석하였다.
- Buffer 종류와 ONPG 농도에 따른 β-galactosidase 활성의 차이를 측정하였다. pH 7.
- 측정하였다. pH 7.0인 Z buffer (containing yQmercaptoethargl)와 acetate buffer (pH 4.0), phosphate buffer (pH 7.0, omitting β- mercaptoethanol)를 사용하여 효소 활성을 비교하였으며, ONPG 농도에 대한 효소 활성의 경우, 4.0mg/mI과 16mg/ml의 ONPG 를 사용하여 효소 활성을 비교하였다. 또한, 균체 파쇄 방법에 따른 효소 활성을 비교하였다.
- 0mg/mI과 16mg/ml의 ONPG 를 사용하여 효소 활성을 비교하였다. 또한, 균체 파쇄 방법에 따른 효소 활성을 비교하였다. Toluene 혹은 sonicator (Sonic & Materials Inc.
- 또한, 균체 파쇄 방법에 따른 효소 활성을 비교하였다. Toluene 혹은 sonicator (Sonic & Materials Inc., USA)를 사용하여 세포를 파쇄한 후, 효소 활성을 비교하였다. Sonicatione 50/60 Hz에서 30초간 30회, 얼음 속에서 고온에 의한 효소 실활을 최소화하면서 세포를 파쇄하였으며, toluene 방법은 배양액 1 ml에 toluene 10μl를 첨가하여 세포파쇄 후, 활성을 측정하였다.
- , USA)를 사용하여 세포를 파쇄한 후, 효소 활성을 비교하였다. Sonicatione 50/60 Hz에서 30초간 30회, 얼음 속에서 고온에 의한 효소 실활을 최소화하면서 세포를 파쇄하였으며, toluene 방법은 배양액 1 ml에 toluene 10μl를 첨가하여 세포파쇄 후, 활성을 측정하였다.
- MRS 액체배지를 이용하여 37℃에서 18시간 동안 전배양 한 후, 본 배양 배지에 전배양액 1% (v/v)를 접종하였다. 37℃, 18시간 배양한 후 배양액 1 ml을 원심 분리하여 saline solution으로 2회 세척한 다음 생존력과 효소 안정성을 조사하였다.
- 본 배양 배지에 전배양액 1% (v/v)를 접종하였다. 37℃, 18시간 배양한 후 배양액 1 ml을 원심 분리하여 saline solution으로 2회 세척한 다음 생존력과 효소 안정성을 조사하였다.
- (4℃), 4) 상온 (30℃)의 4가지 조건을 조합하여 20일간 균주의 생균수를 측정하였으며, 효소의 안정성은 β-galactosidase 활성을 측정하여 나타내었다.
- 온도에 따른 β-galactosidase 활성 변화를 조사하기 위해서 pH 6.5의 ONPG solution을 사용하여 25℃~65℃ 범위에서 반응을 수행하였다. 효소반응은 prewarming을 거쳐 온도변화에 의한 β-galactosidase 활성의 오차를 최소화하였다.
- pH에 따른 β-galactosidase 활성 변화를 조사하기 위해 pH 4.0 ~pH 9.0로 조정한 0.1 M phosphate buffer를 사용하였고, 효소 활성 측정 시 반응온도를 37℃와 55℃로 구분하여 효소 활성을 비교하였다.
- 선별 유산균이 생산하는 β-galactosidase의 lactose 분해능 확인을 위하여 HPLC 분석을 수행하였다. S10 NH2 column (Waters Spheriob Co.
- 장내환경요인에 따른 유산균 내성 조사를 위하여 시중에 유통되고 있는 A사와 B사의 유제품에 사용되는 Lactobacillus 속 균주 각 1종과 선별 균주의 위액과 담즙산액에 대한 내성을 비교, 조사하였다.
- MRS 액체배지에 pepsin 1% (w/v)를 첨가하고 IN HCl로 pH 2.0, 2.5, 3.0으로 조정한 인공위액을 사용하여 위액에 대한 내성을 조사하였다(14, 17). 인공위액에서 37℃, 24시간 배양하여 배양액 1ml을 8,000Xg, 5분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다.
- 0으로 조정한 인공위액을 사용하여 위액에 대한 내성을 조사하였다(14, 17). 인공위액에서 37℃, 24시간 배양하여 배양액 1ml을 8,000Xg, 5분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 균체에 인공위액을 1:1 (v/v) 비율로 첨가하여 3시간 처리한 후 MRS 고체배지에서 37℃, 48시간 배양하여 생균수 측정을 통하여 인공위액에 대한 내성을 나타내었다.
- 인공위액에서 37℃, 24시간 배양하여 배양액 1ml을 8,000Xg, 5분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 균체에 인공위액을 1:1 (v/v) 비율로 첨가하여 3시간 처리한 후 MRS 고체배지에서 37℃, 48시간 배양하여 생균수 측정을 통하여 인공위액에 대한 내성을 나타내었다.
- 담즙산액에 대한 내성을 조사하기 위하여 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후 배양액 1 ml을 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 인공위액에서 3시간 처리한 후 0.
- 회수하였다. 인공위액에서 3시간 처리한 후 0.3% oxgall (Difco)이 첨가된 인공 담즙산액(pH 6.5)을 1:1 (v/v) 비율로 첨가하여 37P에서 24시간 동안 배양하여 담즙산액에 대한 내성을 측정하였다 (15).
- (13)에 의하면 유산균 간균의 형태에 따라 담즙에 대한 내성에 차이가 있으며, colony 형태의 경우 rough type colony보다 smooth type이 담즙에 대한 내성이 우수하다고 보고 된 바 있다. 김치로부터 위액과 담즙산액에 대하여 내성을 가지며 β-galactosidase 활성이 우수한 균을 분리하al 위해 2% X-gal이 첨가된 MRS 배지로부터 표면이 부드럽고 푸른색을 나타내는 약 100 여개의 colony를 1차 선별하였으며, 선별된 colony들을 대상으로 Cutting 등의 방법(6)을 사용하여 β-galactosidase 활성을 측정하였다. 100 여개 colony들 중 1, 500 Miller Unit/ml 이상의 β-galactosidase 활성을 나타낸 6 균주를 2차 분리하였으며, 2차 분리된 균주를 MRS 배지에서 배양한 후, 4℃에서 7일간 보존한 다음, 생균수를 측정하여 생존력이 다른 균주들 보다 높고, 효소 활성이 우수한 ET-1과 LA-12 균주를 최종 선별하였다.
- 김치로부터 위액과 담즙산액에 대하여 내성을 가지며 β-galactosidase 활성이 우수한 균을 분리하al 위해 2% X-gal이 첨가된 MRS 배지로부터 표면이 부드럽고 푸른색을 나타내는 약 100 여개의 colony를 1차 선별하였으며, 선별된 colony들을 대상으로 Cutting 등의 방법(6)을 사용하여 β-galactosidase 활성을 측정하였다. 100 여개 colony들 중 1, 500 Miller Unit/ml 이상의 β-galactosidase 활성을 나타낸 6 균주를 2차 분리하였으며, 2차 분리된 균주를 MRS 배지에서 배양한 후, 4℃에서 7일간 보존한 다음, 생균수를 측정하여 생존력이 다른 균주들 보다 높고, 효소 활성이 우수한 ET-1과 LA-12 균주를 최종 선별하였다. 선별된 균주에 대하여 16S rDNA 염기서열 결정 및 분석을 수행하여 균주를 동정하였다.
- 100 여개 colony들 중 1, 500 Miller Unit/ml 이상의 β-galactosidase 활성을 나타낸 6 균주를 2차 분리하였으며, 2차 분리된 균주를 MRS 배지에서 배양한 후, 4℃에서 7일간 보존한 다음, 생균수를 측정하여 생존력이 다른 균주들 보다 높고, 효소 활성이 우수한 ET-1과 LA-12 균주를 최종 선별하였다. 선별된 균주에 대하여 16S rDNA 염기서열 결정 및 분석을 수행하여 균주를 동정하였다. 그 결과 최종 선별된 2균주, ET-1과 LA-12는 각각 Lactobacillus femzentum과 L.
- 시중에서 유통되는 요쿠르트 A와 B사 제품으로부터 분리한 유산균과 β-galactosidase 활성을 비교하였다. 선별균주 ET-1과 LA-12의 경우 약 2,600~2,700 Miller Unit/ml의 효소 활성을 보여 시판되는 A사와 B사의 유산균(약 1,600-1,800 Miller Unit/ ml)에 비해 약 50% 정도 높은 β-galactosidase 활성을 나타내었다(data not shown).
- 본 실험에서는 선별된 β-galactosidase 생산 유산균의 상업적 이용 가능성을 검토하기 위하여 선별 유산균의 생존력과 유산균이 생산하는 β-galactosidase의 안정성에 대한 실험을 수행하였다. 선별 유산균의 생존력과 β-galactosidase 안정성 실험은 온도(저온과 상온)와 배지(MI3 배지와 saline solution) 조건을 서로 조합하여 20일간 보존하면서 측정하였다.
- 또한 배양조건과 측정 방법에 따라 효소 활성에 차이를 나타낸다(12). 본 실험에서는 선별 균주 중 효소 활성이 가장 높은 ET-1 을 사용하여 buffer의 종류, ONPG 기질의 농도, 그리고 세포 파쇄방법에 따른 효소 활성의 차이를 조사하였다. ET-1 (초기 생균수 109 CFU/ml)을 phosphate buffer (pH 7.
- 0)를사용하여 희석한 후 sonication을 통하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리하여 상등액과 균체 침전물로 구분한 후 4.0 mg/ml 와 16 mg/ml ONPG 농도를 사용하여 효소 활성을 측정하였다. Buffer 의 경우 phosphate buffer를 사용하여 활성을 측정한 결과(Table 2), Z buffer 혹은 acetate buffer와 비교하여 16%~50% 정도 높은 효소 활성을 보였다.
- 조건에 의해 영향을 받는다(10). 본 실험에서는 ET-1과 LA- 12가 생산하는 β-galactosidase에 대하여 온도와 pH에 따른 활성을 비교하였다. 반응온도는 두 균주에서 생산된 효소 모두 55℃ 에서 측정된 효소 활성이 37℃ 효소 활성에 비해 20~40% 정도증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 즉정하였다. 실제 선별 균주의 β-galactosidase가 lactose를 galactose와 glucose로 분해하는지 확인하기 위하여 HPLC를 이용하여 반응액을 분석하였다. Lactose 0.
- 선별된 균주 (ET-1과 LA-12)를 pH 2.0, pH 2.5, pH 3.0으로 조정한 인공 위액을 사용하여 내성 실험을 수행하였고, 시판되는 유제품에서 분리한 유산균과 비교하였다. ET-1의 경우 위액처리 3시간 후 초기 생균수(1010CFU/rnU)에 비해 1 log cycle 정도의 감소를 나타내었고, LA-12의 경우에는 생균수의 변화가 거의 없어 시중에서 판매되는 유산균 A와 B의 위액에 대한 내성과 비교하여 그 차이가 없음을 확인하였다(Table 3).
- 가져야 한다고 알려져 있다(2, 3). 본 실험에서는 인공 위액을 처리한 후 인공 담즙산액에 대한 생존력을 시판되는 유제품에서 분리한 유산균과 비교, 조사하였다. ET-1과 LA-12는 0.
- QIAprep spin miniprep kit (Qiagen)를 사용하여 plasmid DNA를 추출한 후, 염기서열 결정 및 분석을 수행하였다. 결정된 염기서열 분석은 BLAST Search Program (NCBI)을 통하여 GenBank의 database와 비교 분석하였다.
- 세포 파쇄 방법에 따른 효소 활성의 차이를 확인하기 위하여 toluene 방법(6)과 sonication 방법을 사용하여 세포를 파쇄한 후 효소 활성의 차이를 비교하였다. Sonication의 경우 초음파를 통하여 세균의 세포벽을 파괴하는 방법으로 효소 활성에 negative 혹은 positive effect를 나타낸다고 보고된 바 있다(11).
이론/모형
- 형성된 colony 중 외관상 표면이 부드럽고 푸른색을 나타내는 colony를 대상으로 1차 분리하였다(12). 1차 분리된 colony들을 대상으로 Cutting 등의 방법(6)을 사용하여 β-galactosidase 활성을 즉정하였다. 분리한 colony 중 1,500 Miller Units/ml 이상의 β-galactosidase 활성을 나타내는 균주를 2차 분리하였다.
성능/효과
- 선별된 균주에 대하여 16S rDNA 염기서열 결정 및 분석을 수행하여 균주를 동정하였다. 그 결과 최종 선별된 2균주, ET-1과 LA-12는 각각 Lactobacillus femzentum과 L. acidophilus와 높은 상동성을 보이는 Lactobacillus 속으로 동정되었다 (Table 1).
- 108 CFU/ml 이상의 생균수를 유지하였다. 효소 안정성은 상온, saline solution (RS) 조건을 사용하여 보존하였을 경우, 보존 5일까지 β-galactosidase 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으나, 9일 이후 급격한 감소를 나타내었다. 이에 비해 4M 조건의 경우, 보존 7일까지 상대적으로 낮은 효소 활성을 보였으나, 전자에 비해 효소 활성이 안정적이며 1,100 Miller Units/ml 이상의 효소 활성을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 효소 안정성은 상온, saline solution (RS) 조건을 사용하여 보존하였을 경우, 보존 5일까지 β-galactosidase 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으나, 9일 이후 급격한 감소를 나타내었다. 이에 비해 4M 조건의 경우, 보존 7일까지 상대적으로 낮은 효소 활성을 보였으나, 전자에 비해 효소 활성이 안정적이며 1,100 Miller Units/ml 이상의 효소 활성을 관찰할 수 있었다(Fig. 1, panel A).
- 그러나 효소 활성은 상온, saline solution 조건으로 보관하였을 때 활성이 높게 유지되었으며, 20일 경과 후 약 800 MiUer Units/ml로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 균주 LA- 12는 효소 안정성만 고려한다면 4℃, MRS 조건에서 보관할 경우 상온, saline solution 조건보다 보존 7일까지 상대적으로 낮은 활성을 나타내었지만 보존 9일 이후에는 효소 활성의 변화가 적고 완만하여 다른 조건보다 효소활성 유지에 우수한 것으로 관찰 되었다(Fig.
- 그러나 효소 활성은 상온, saline solution 조건으로 보관하였을 때 활성이 높게 유지되었으며, 20일 경과 후 약 800 MiUer Units/ml로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 균주 LA- 12는 효소 안정성만 고려한다면 4℃, MRS 조건에서 보관할 경우 상온, saline solution 조건보다 보존 7일까지 상대적으로 낮은 활성을 나타내었지만 보존 9일 이후에는 효소 활성의 변화가 적고 완만하여 다른 조건보다 효소활성 유지에 우수한 것으로 관찰 되었다(Fig. 1, panel B).
- 이상의 결과를 바탕으로 선별 균주에 대한 생존력과 효소의 안정성을 유지하기 위해서는 4℃, MRS 배지 조건을 사용하여 보존하는 경우와 4℃, saline solution 조건을 사용하여 보존하는 경우가 가장 효율적이었다. 그러나 선별 균주의 상업화시 비용 절감 효과를 통한 경제적 가치를 고려할 경우 4℃, saline solution 조건으로 보존하는 것이 최적으로 판단된다.
- 0 mg/ml 와 16 mg/ml ONPG 농도를 사용하여 효소 활성을 측정하였다. Buffer 의 경우 phosphate buffer를 사용하여 활성을 측정한 결과(Table 2), Z buffer 혹은 acetate buffer와 비교하여 16%~50% 정도 높은 효소 활성을 보였다. ONPG의 경우, 효소 반응 시 ONPG 기질 농도에 따른 효소 활성은 차이가 없는 것으로 확인되었다 (Table 2).
- 이상의 결과로부터 분리 균주 ET-1의 β-galactosidase 활성 분석의 최적 조건은 phosphate buffer (pH 7.0)를 사용하여 sonication (50/60 Hz, 30 sec, 30 times)법으로 세포를 파쇄한 후, 4.0 mg/ml의 ONPG를 al질로 이용하여 3(TC에서 5 min간 반응할 경우 최적의 효소 활성을 얻을 수 있었다.
- 본 실험에서는 ET-1과 LA- 12가 생산하는 β-galactosidase에 대하여 온도와 pH에 따른 활성을 비교하였다. 반응온도는 두 균주에서 생산된 효소 모두 55℃ 에서 측정된 효소 활성이 37℃ 효소 활성에 비해 20~40% 정도증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 선별 균주의 pH에 따른 β-galactosidase 활성 변화를 55℃에서조사한 결과, ET-1의 경우, pH 5.5에서 효소 활성이 가장 높게 관찰되었으며, pH 7.0 이상에서 감소되는 경향을 나타내었다. LA-12의 경우는 ET-1과 다르게 pH 7.
- 3). Fig. 2와 Fig. 3의 결과로부터 ET-1과 LA-12가 생산하는 ^-galacto- sidase의 경우, 반응온도 55℃에서 가장 높은 활성을 나타내었고, pH 5.5에서 ET-1은 최고 활성을 나타내었고, LA-12는 pH 7.0에서 가장 높은 활성을 보였다.
- 5 g을 controls. 사용하여 분석을 수행한 결과, retention time (RT) 3.72 min에서 lactose의 control peak가 관찰되었으며, ET-1과 LA-12의 경우는 RT 3.12 min과 3.37 min에서 각각 galactose와 glucose에 해당하는 peak 가 분해산물로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이 결과로부터 선별 균주가 생산하는 β-galactosidase는 lactose에 대한 분해능을 가진 것으로 확인할 수 있었으며, 산업적인 이용 가능성을 확인할 수 있었다.
- 4). 이 결과로부터 선별 균주가 생산하는 β-galactosidase는 lactose에 대한 분해능을 가진 것으로 확인할 수 있었으며, 산업적인 이용 가능성을 확인할 수 있었다.
- 0으로 조정한 인공 위액을 사용하여 내성 실험을 수행하였고, 시판되는 유제품에서 분리한 유산균과 비교하였다. ET-1의 경우 위액처리 3시간 후 초기 생균수(1010CFU/rnU)에 비해 1 log cycle 정도의 감소를 나타내었고, LA-12의 경우에는 생균수의 변화가 거의 없어 시중에서 판매되는 유산균 A와 B의 위액에 대한 내성과 비교하여 그 차이가 없음을 확인하였다(Table 3).
- 3%oxgall과 8시간 반응 후, control (without oxgall)과 유사하게 초기 생균수인 108, CFU/ml 이상의 생균수를 유지하였다. 24시간 반응 후에도 108 CFU/ml 이상의 생균수를 유지하는 것으로 확인되었으며, 시판되는 유산균 B의 생균수보다 1 log cycle 정도 높게 유지하는 것으로 확인되었다(Table 4). 본 실험을 통하여 선별 균주 ET-1과 LA-12는 담즙산액에 대한 내성 또한 시판되는 유산균 A, B균주와 비교하여 동등하거나 우수한 것으로 확인되어 제품화시 장내에서 probiotics로서 그 기능을 충분히 발휘할 것이라 생각된다.
- 24시간 반응 후에도 108 CFU/ml 이상의 생균수를 유지하는 것으로 확인되었으며, 시판되는 유산균 B의 생균수보다 1 log cycle 정도 높게 유지하는 것으로 확인되었다(Table 4). 본 실험을 통하여 선별 균주 ET-1과 LA-12는 담즙산액에 대한 내성 또한 시판되는 유산균 A, B균주와 비교하여 동등하거나 우수한 것으로 확인되어 제품화시 장내에서 probiotics로서 그 기능을 충분히 발휘할 것이라 생각된다.
후속연구
- 이상의 결과들로부터 본 실험에서 분리한 균주 ET-1과 LA-12 는 높은 생존력과 우수한 효소 활성β-galactosidase)을 나타냄으로써 유당불내증 저감 기능을 발휘할 것으로 기대되며, 현재 시중에 유통되고 있는 유제품으로부터 분리된 균주와 비교하여 위액과 담즙산액에 대한 내성 또한 우수하여 기능성 유가공 식품 혹은 기타 유제품 제조 시 상품화 가치가 우수하다고 생각된다.
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