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문제 정의
- 따라서 토양의 지력저하 즉, 토양 중에서 식물이 흡수하여 이용 가능한 유리인산의 양은 대부분 소실되고, 식물이 이용할 수 없는 불용성 인산의 양만 증가되는 결과를 초래한다. 동시에 유실되는 비료 성분을 증가시켜 하천 등 지표수의 부영양화와 지하수의 오염을 초래하는 결과를 가져온다. 최근의 근해 적조현상 등은 부영양화된 지표수의 유입이 한 원인으로 생각되고 있다.
- 본 연구에서는 다양한 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지고 있으며, 동시에 경작지 토양에 식물이 흡수하기 어려운 불용성의 형태로 다량 축적되어 있는 각종 인산염을 가용화시킬 수 있는 세균을 분리하여 생물농약 및 생물비료로서의 기능을 모두 가지고 있는 다기능성 미생물 제제 개발을 위한 기초자료를 구축하고자 하였다. 일차적으로 상기 목적에 부합하는 미생물을 분리한 후, 불용성 인산 가용화 최적조건을 검토하였다.
제안 방법
- 05%, FeSO4 . 7H2O 0.05 % 및 yeast extract 0.05% (pH 7.0)이었으며, 불용성 인산원으로 Ca3(PO4)2 0.5%를 첨가하였다(10). 기본 배지 선정에 사용된 배지는 NBRIY 배지 [glucose 1%, (NH4)2SO4 0.
- 가용성 인산을 생성할 수 있는 불용성 인산의 범위를 조사하기 위하여 각종 불용성 인산(CaHPO4 Ca3(PO4)2, FePO4, AlPO4, hydoxyapatite)이 각각 적정 농도로 첨가된 최적배지에 실험 균주를 접종하여 30℃, 200 rpm에서 5일간 배양한 후, 가용성 인산의 농도 및 배양액의 최종 pH를 측정하였다.
- 경남 밀양지역의 논, 밭 및 농작물의 근권 토양으로부터 Ca3(PO4)2가 함유된 PVK plate 상에서 직경 1 cm 이상의 투명환을 생성하는 42 균주를 분리한 후, PVK broth에서 200 mg/L 이상의 가용성 인산을 생성하는 24 균주를 재분리하였다. 이 균주들을 대상으로 30℃에서 7일 동안 대치배양하면서 각종 식물 병원성 진균에 대한 항진균 효과를 검토한 결과, 농작물에 잿빛곰팡이병을 초래하는 Botrytis cinerea와 줄기썩음병을 초래하는 Rhizoctonia solani의 균사 생장을 억제할 수 있는 RAF15를 최종 실험균주로 선정하였다.
- 5%를 첨가하였다(10). 기본 배지 선정에 사용된 배지는 NBRIY 배지 [glucose 1%, (NH4)2SO4 0.05%, NaCl 0.02 %, MgSO4 · 7H2O 0.01%, KCl 0.02%, MnSO4 · 7H20 0.05%, FeSO4 · 7H2O 0.05%, pH 7.0](ll), NBRIP 배지[glucose 1%, (NH4)2SO4 0.01%, MgSO4 · 7H2O 0.025%, MgCl2 · 6H2O 0.5%, pH7](11) 및 Son 배지[glucose 1%, NH4NO3 0.1%, MgSO4 . 7H2O 0.02%, CaCl2 . 2H2O 0.06%, pH 7.0](12)이었으며, 불용성 인산원으로 Ca3(PO4)2 0.5%를 각각 첨가하였다.
- 동시에 API 20NE kit (bioMerieux, France)를 통하여 동정 결과를 검정하였다.
- 알려져 있다. 따라서 본 균주의 배양을 위한 기본 배지를 선정하기 위하여 문헌에 보고된 몇 가지 배지를 이용하여 불용성 인산 가용능을 먼저 조사하였으며, 그 결과는 Table 2에서 보는 것과 같다. NBRIP 배지에서 가장 우수한 불용성 인산 가용 능이 나타났으나 균체 생육은 가장 낮았다.
- 배양액 속의 가용성 인산의 농도는 17,418 × g, 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액을 대상으로 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method (17)로 조사하였으며, 균주를 접종하지 않은 각 배지를 대조구로 사용하여 실험 결과를 보정하였다. 모든 실험은 3회 반복으로 실시하였으며, 나타낸 각 결과들은 이들의 평균값이다.
- 배양액 시료와 1N HCl을 1 : 1의 비율로 혼합함으로써 배양액 속의 잔존 불용성 인산을 가용화시킨 후, spectrophotometer를 이용하여 660 nm에서의 홉광도를 측정하여 균체 생육도를 조사하였다(16). 배양액 속의 가용성 인산의 농도는 17,418 × g, 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액을 대상으로 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method (17)로 조사하였으며, 균주를 접종하지 않은 각 배지를 대조구로 사용하여 실험 결과를 보정하였다.
- 이것은 생성된 가용성 인산이 실험균주의 생육에 이용되고, 이에 따라 균체 생육도가 증가한 것으로 추정되나 차후에 좀 더 자세한 실험이 필요한 것으로 판단된다. 본 실험에서는 생성된 균체당 가용성 인산 생성능이 가장 우수한 NBRIP 배지를 기본배지로 선정하여 이후의 실험을 진행하였다.
- 콜로니 주위에 생성된 투명환의 직경이 큰 콜로니들을 불용성 인산 가용화 세균으로 1차 선정하였다. 선정균주들을 각각 1%의 NaCl이 함유된 PVK broth에 접종하여 30℃, 200 ipm, 5일간 회전 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 가용성 인산의 농도를 측정하여 인산 생성능이 우수한 균주를 고농도 염 존재 하에서도 불용성 인산을 가용화시킬 수 있는 균주로 2차 선정하였다.
- 실험균주의 불용성 인산 가용능에 영향을 미치는 조건을 알아보기 위하여 각종 탄소원, 질소원 및 무기이온의 종류와 농도, 배양온도, 초기 pH 등에 따른 균체 생육도, 가용성 인산 농도 및 배지의 최종 pH를 측정하였으며, 특별한 언급이 없는 한 200 rpm에서 5일간 회전진탕배양하였다.
- 선정균주들을 각각 1%의 NaCl이 함유된 PVK broth에 접종하여 30℃, 200 ipm, 5일간 회전 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 가용성 인산의 농도를 측정하여 인산 생성능이 우수한 균주를 고농도 염 존재 하에서도 불용성 인산을 가용화시킬 수 있는 균주로 2차 선정하였다. 항진균능을 가진 불용성 인산 가용화 균주를 선정하기 위하여 대표적인 식물병원성 진균인 Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ultimum, Altemaria porri을 대상으로 PDA plate에서 대치배양을 실시하여가장 큰 생육저지대를 생성하는 균주를 실험균주로 최종 선정하였다.
- 구축하고자 하였다. 일차적으로 상기 목적에 부합하는 미생물을 분리한 후, 불용성 인산 가용화 최적조건을 검토하였다.
- 경남 밀양의 각종 농경지 토양 및 농작물 근권 토양을 시료로 채취하였으며 , 준비된 토양시료 현탁액을 단계적으로 희석한 후, 일정액을 PVK agar plate에 도말하여 3CTC에서 7일간 배양하였다. 콜로니 주위에 생성된 투명환의 직경이 큰 콜로니들을 불용성 인산 가용화 세균으로 1차 선정하였다. 선정균주들을 각각 1%의 NaCl이 함유된 PVK broth에 접종하여 30℃, 200 ipm, 5일간 회전 진탕 배양하였다.
대상 데이터
- 이용한 plate assay method로 분리하였다(10). 경남 밀양의 각종 농경지 토양 및 농작물 근권 토양을 시료로 채취하였으며 , 준비된 토양시료 현탁액을 단계적으로 희석한 후, 일정액을 PVK agar plate에 도말하여 3CTC에서 7일간 배양하였다. 콜로니 주위에 생성된 투명환의 직경이 큰 콜로니들을 불용성 인산 가용화 세균으로 1차 선정하였다.
- 가용성 인산을 생성하는 24 균주를 재분리하였다. 이 균주들을 대상으로 30℃에서 7일 동안 대치배양하면서 각종 식물 병원성 진균에 대한 항진균 효과를 검토한 결과, 농작물에 잿빛곰팡이병을 초래하는 Botrytis cinerea와 줄기썩음병을 초래하는 Rhizoctonia solani의 균사 생장을 억제할 수 있는 RAF15를 최종 실험균주로 선정하였다. RAF15의 불용성 인산 가용능 및 항진균 능은 Fig.
- 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 가용성 인산의 농도를 측정하여 인산 생성능이 우수한 균주를 고농도 염 존재 하에서도 불용성 인산을 가용화시킬 수 있는 균주로 2차 선정하였다. 항진균능을 가진 불용성 인산 가용화 균주를 선정하기 위하여 대표적인 식물병원성 진균인 Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ultimum, Altemaria porri을 대상으로 PDA plate에서 대치배양을 실시하여가장 큰 생육저지대를 생성하는 균주를 실험균주로 최종 선정하였다.
데이터처리
- 배양액 속의 가용성 인산의 농도는 17,418 × g, 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액을 대상으로 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method (17)로 조사하였으며, 균주를 접종하지 않은 각 배지를 대조구로 사용하여 실험 결과를 보정하였다. 모든 실험은 3회 반복으로 실시하였으며, 나타낸 각 결과들은 이들의 평균값이다.
이론/모형
- 불용성 인산 가용화 세균은 전통적으로 불용성 인산 가용화 미생물을 분리하는데 사용되고 있는 Pikovskaya 배지(PVK 배지) 를 이용한 plate assay method로 분리하였다(10). 경남 밀양의 각종 농경지 토양 및 농작물 근권 토양을 시료로 채취하였으며 , 준비된 토양시료 현탁액을 단계적으로 희석한 후, 일정액을 PVK agar plate에 도말하여 3CTC에서 7일간 배양하였다.
- 실험균주를 동정하기 위하여 형태학적, 배양적 특성 및 생리학적 특성을 Biochemical tests for identification of medical bacteria (13)에 준하여 검토하였으며, 도출된 결과를 Cowan and Steel's Manual for the identification of medical bacteria (14) 및 Bergey's manual of determinative bacteriology (15)를 참조하여 동정하였다. 동시에 API 20NE kit (bioMerieux, France)를 통하여 동정 결과를 검정하였다.
성능/효과
- 따라서 본 균주의 배양을 위한 기본 배지를 선정하기 위하여 문헌에 보고된 몇 가지 배지를 이용하여 불용성 인산 가용능을 먼저 조사하였으며, 그 결과는 Table 2에서 보는 것과 같다. NBRIP 배지에서 가장 우수한 불용성 인산 가용 능이 나타났으나 균체 생육은 가장 낮았다. NBRIY 배지, Son 배지 및 균주 분리에 사용한 PVK 배지에서는 높은 균체 생육을 보여주었으나 상대적으로 불용성 인산 가용능은 낮았다.
- NBRIP 배지에서 가장 우수한 불용성 인산 가용 능이 나타났으나 균체 생육은 가장 낮았다. NBRIY 배지, Son 배지 및 균주 분리에 사용한 PVK 배지에서는 높은 균체 생육을 보여주었으나 상대적으로 불용성 인산 가용능은 낮았다. 실험에 사용된 네 종류의 배지 모두 가용성 인산 생성량이 가장 많은 시간대에서 배양액의 pH가 가장 낮았다.
- 실험에 사용된 네 종류의 배지 모두 가용성 인산 생성량이 가장 많은 시간대에서 배양액의 pH가 가장 낮았다. PVK 및 NBRIY 배지의 경우, 각각 배양 2일 후 가용성 인산의 생성량이 감소하기 시작하였으며, 이에 비례하여 균체 생육도는 증가하였다. 이것은 생성된 가용성 인산이 실험균주의 생육에 이용되고, 이에 따라 균체 생육도가 증가한 것으로 추정되나 차후에 좀 더 자세한 실험이 필요한 것으로 판단된다.
- 따라서 앞으로 본 균주가 생성하는 유기산의 종류와 농도에 대한 실험이 뒤따라야 할 것으로 판단된다. 가용성 인산생성에 최적인 glucose의 농도를 조사한 결과, glucose의 농도 증가에 따라 가용성 인산의 생성량도 증가하여 1.5%에서 785 mg/ L의 가용성 인산이 생성되었으며, 그 이상의 농도에서는 일정하였다. pH는 4.
- 무기 질소원보다 영양적으로 우수한 유기 질소원에서 균체 생육 도가 낮은 것은 특이한 결과였다. 가장 높은 가용성 인산 생성 능과 균체 생육도를 나타낸 urea를 최적 질소원으로 선정한 후, 최적농도를 조사한 결과 0.005%까지는 가용성 인산 생성량이 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 완만하게 감소하기 시작하여 0.04% 이상의 농도에서 가용성 인산이 거의 생산되지 않았다 (10-14 mg/L). 그러나 균체 생육도는 urea의 농도 증가에 따라 비례적으로 증가하여 0.
- 01%에서 가용성 인산 생성량이 가장 높았으며, KCl은 가용성 인산 생성에 영향을 미치지 않았다(자료 미제시). 기본 배지에 포함되지 않은 다른 무기염 첨가 효과를 조사한 결과, 0.01% CaCl2 · 2H2O 및 0.05% NaCl이가용성 인산 생성량을 증가시켰다(자료 미제시).
- Penicillium radicum은 CaHPO4, FePO4, AlPO4로부터 각각 176, 10, 0mg/L 가용성 인산을 생성하며(20), Rahnella aquatilis는 hydroxyapatite로부터 230 mg/L의 가용성 인산을 생성한다고 보고되어 있다(21). 따라서 본 균주는 이들보다 훨씬 우수한 불용성 인산 가용능을 가지고 있음을 알 수 있었다. 한편, calcium phosphate에 active하게 작용하는 미생물들은 iron 또는 aluminum phosphate의 가용능이 매우 저조한 것으로 알려져 있으며(22), 본 균주도 유사한 결과를 나타내었다.
- 항진균능이 없는 Pantoea agglomerans R-42는 3% glucose로부터 750mg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있는 것으로 보고되어 있다(12). 따라서 본 실험균주가 기질 이용면에서 P. agglomerans R-42보다 우수한 것으로 판단된다.
- 7% 수준에서 유사한 것으로 나타났다. 따라서 실험균주 RAF15를 Pseudomonas fluorescens RAF15로 명명하였다.
- Glucose, galactose, mannitol로부터 각각 632, 416, 99’ mg/L의 가용성 인산이 생성되었으며, lactose, sucrose, maltose, sorbitol 등으로부터는 가용 성인산이 전혀 생산되지 않았다. 또한 가용성 인산 생성에 탄소 원은 필수적인 것으로 나타났으며, 가용성 인산 생성은 배지의 pH 감소와 밀접한 관련이 있는 것으로 추정되었다. 일반적으로 불용성 인산이 가용성 인산으로 전환되는 이유는 미생물이 생산한 각종 유기산에 의한 배양액의 pH 감소가 주원인으로 보고되어있다(17).
- 본 균주는 그람음성의 운동성이 있는 통성혐기성 간균으로서, 배양적 및 생리생화학적 제반 특성을 Cowan and Steel's Manual for the identification of medical bacteria (14) 및 Bergey's manual of determinative bacteriology (15)에 준하여 검토한 결과, Pseudomonas 속에 포함될 가능성이 가장 높았다. 또한, API 20NE kit (bioMerieux, France)를 이용하여 4시간 반응시킨 후 동정한 결과, Pseudomonas fluorescent 99.7% 수준에서 유사한 것으로 나타났다. 따라서 실험균주 RAF15를 Pseudomonas fluorescens RAF15로 명명하였다.
- 01%씩 첨가하여 30℃, 200 rpm에서 5일간 배양한 결과는 Table 4에서 보는 바와 같다. 무기 질소원이 유기질 소원보다 높은 가용성 인산 생성능과 균체 생육도를 나타내었으며, 질소원의 첨가가 가용성 인산 생성에 필수적인 것은 아니었다. 무기 질소원보다 영양적으로 우수한 유기 질소원에서 균체 생육 도가 낮은 것은 특이한 결과였다.
- 실험균주의 분류학적 위치를 밝힌 결과는 Table 1과 같다. 본 균주는 그람음성의 운동성이 있는 통성혐기성 간균으로서, 배양적 및 생리생화학적 제반 특성을 Cowan and Steel's Manual for the identification of medical bacteria (14) 및 Bergey's manual of determinative bacteriology (15)에 준하여 검토한 결과, Pseudomonas 속에 포함될 가능성이 가장 높았다. 또한, API 20NE kit (bioMerieux, France)를 이용하여 4시간 반응시킨 후 동정한 결과, Pseudomonas fluorescent 99.
- 4에서 보는 바와 같다. 본 균주는 비교적 높은 농도의 KCl (1-4%) 및 NaCl (1-3%)에서도 각각 489-610 mg/L 및 224-588 mg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있었으며, 1% CaCl2· 2H20의 농도에서도 약lOOmg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있었다. 따라서 본 균주는 염류 축적이 보편화된 국내 토양에 충분히 적용 가능할 것이라고 판단된다.
- NBRIY 배지, Son 배지 및 균주 분리에 사용한 PVK 배지에서는 높은 균체 생육을 보여주었으나 상대적으로 불용성 인산 가용능은 낮았다. 실험에 사용된 네 종류의 배지 모두 가용성 인산 생성량이 가장 많은 시간대에서 배양액의 pH가 가장 낮았다. PVK 및 NBRIY 배지의 경우, 각각 배양 2일 후 가용성 인산의 생성량이 감소하기 시작하였으며, 이에 비례하여 균체 생육도는 증가하였다.
- 이상에서 확립된 불용성 인산 가용화를 위한 최적 배지 및 배양조건은 glucose 1.5%, urea 0.005%, MgCl2 · 6H2O 0.3%, MgSO4 · 7H2O 0.01%, CaCl2 · 2H2O 0.01%, NaCl 0.05%, 배양온도 30℃ 및 초기 pH 7.0이었다.
- agglomerans R- 42는 상기의 환경 범위에서 69-215 mg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있었으므로 본 실험균주의 응용 가능성이 더 높은 것으로 판단된다. 이상의 결과는 본 실험균주가 기존에 알려진 불용 성인산 가용화 미생물보다 훨씬 적용환경 범위가 넓고, 효율적인 새로운 균주임을 시사한다.
후속연구
- agglomerans R-42가 알려져 있다(12). 그러나 P. agglomerans R- 42는 상기의 환경 범위에서 69-215 mg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있었으므로 본 실험균주의 응용 가능성이 더 높은 것으로 판단된다. 이상의 결과는 본 실험균주가 기존에 알려진 불용 성인산 가용화 미생물보다 훨씬 적용환경 범위가 넓고, 효율적인 새로운 균주임을 시사한다.
- 배양 5일 후, 30℃에서 가장 높은 가용성 인산 생성능을 나타내었으나 10-25P의 경우, 배양시간을 12-14일까지 연장시 매우 높은 가용성 인산 생성능 (705-933 mg/L)을 나타내 었다. 따라서 본 균주는 연중 기온이 10℃ 이하로 유지되는 계절에도 충분히 야외에 적용가능 할 것으로 판단된다. 40℃에서는 가용성 인산 생성 및 균체 생육이 나타나지 않았다.
- 본 균주는 비교적 높은 농도의 KCl (1-4%) 및 NaCl (1-3%)에서도 각각 489-610 mg/L 및 224-588 mg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있었으며, 1% CaCl2· 2H20의 농도에서도 약lOOmg/L의 가용성 인산을 생성할 수 있었다. 따라서 본 균주는 염류 축적이 보편화된 국내 토양에 충분히 적용 가능할 것이라고 판단된다.
- 일반적으로 불용성 인산이 가용성 인산으로 전환되는 이유는 미생물이 생산한 각종 유기산에 의한 배양액의 pH 감소가 주원인으로 보고되어있다(17). 따라서 앞으로 본 균주가 생성하는 유기산의 종류와 농도에 대한 실험이 뒤따라야 할 것으로 판단된다. 가용성 인산생성에 최적인 glucose의 농도를 조사한 결과, glucose의 농도 증가에 따라 가용성 인산의 생성량도 증가하여 1.
- 1에서 보는 것과 같다. 본 균주는 불용성 인산 가용 능과 항진균능을 동시에 가짐으로써 미생물 비료 및 미생물농약 동시 공급원으로서 잠재적 응용 가능성이 클 것으로 판단된다. 실험균주의 분류학적 위치를 밝힌 결과는 Table 1과 같다.
- PVK 및 NBRIY 배지의 경우, 각각 배양 2일 후 가용성 인산의 생성량이 감소하기 시작하였으며, 이에 비례하여 균체 생육도는 증가하였다. 이것은 생성된 가용성 인산이 실험균주의 생육에 이용되고, 이에 따라 균체 생육도가 증가한 것으로 추정되나 차후에 좀 더 자세한 실험이 필요한 것으로 판단된다. 본 실험에서는 생성된 균체당 가용성 인산 생성능이 가장 우수한 NBRIP 배지를 기본배지로 선정하여 이후의 실험을 진행하였다.
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