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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 닭의 마이코플라즈마 감염증 예방을 위해 미국, 서유럽 등지에서 1991년부터 사용하고 있는 MG 6/85 생균 백신을 국내의 실용 산란계 농장에 백신 접종 하였을 때의 안전성과 효능을 조사하고자 하였다.
- 이 연구에서 헨 하우스 산란수를 25주령부터 산출한 이유는, A농장의 경우 백신 접종군과 대조군 모두에서 마렉병으로 의심되는 폐사와 약추를 선별하여 도태 시켰고, B농장의 경우에도 백신 접종군 및 대조군에서 가금 티프스에 의한 폐사 및 약추를 선별하여 도태시킨 폐사율을 제외 시키기 위해서였다. 그 결과 A, B농장 모두 헨 하우스 산란수가 대조군에 비하여 백신 접종 군이 약 8~9개 정도 많았고, 난중에 있어서는 A와 B농장 모두 백신 접종군이 대조군에 비해 무거운 것으로 나타났다.
제안 방법
- gallisepticum R strain을 미국 Poultry Diagnosis and Research Center(USA)의 Kleven 박사로부터 분양 받아 사용하였다. MG의 분리 배양을 위해 12% 돼지 혈청이 첨가된 Frey 배지 [14]를 사용하였고, 기관 및 기낭에서의 MG의 채취는 멸균된 면봉을 사용하여 채취한 후 준비된 Frey배지에 접종한 후 37℃에서 배지의 색깔이 오렌지 또는 노랑색으로 변할 때까지 배양하였다. MG의 동정은 Nascimento 등이 보고한 PCR 방법을 사용하였다 [27],
- Nobilis® MG 6/85 백신의 유효성을 알아보기 위하여 공격 접종후의 백신의 효과를 관찰하였다. Hyline 계통의 SPF 종란에서 부화한 병아리 32마리를 8마리씩 4군으 로 나눈 뒤 무균 사육시설(Biosafbty isolator; 쓰리샤인, 한국)에서 항생제 무첨가 열처리 배합사료와 물을 자유 급식시키면서 사육 시켰다.
- Nobilis® MG 6/85 백신의 유효성을 알아보기 위하여 공격 접종후의 백신의 효과를 관찰하였다. Hyline 계통의 SPF 종란에서 부화한 병아리 32마리를 8마리씩 4군으 로 나눈 뒤 무균 사육시설(Biosafbty isolator; 쓰리샤인, 한국)에서 항생제 무첨가 열처리 배합사료와 물을 자유 급식시키면서 사육 시켰다. 6주령 때에 모든 개체에서 채혈을 한 후 백신 접종군의 경우 Nobilis® MG 6/85을 마리당 1 dose(1069cfu/dose) 용량이 되도록 제조회사가 권장하는 분무기 (Atomist; Desvac, France)를 사용하여 20 마이크론의 입자로 분무하였다.
- Hyline 계통의 SPF 종란에서 부화한 병아리 32마리를 8마리씩 4군으 로 나눈 뒤 무균 사육시설(Biosafbty isolator; 쓰리샤인, 한국)에서 항생제 무첨가 열처리 배합사료와 물을 자유 급식시키면서 사육 시켰다. 6주령 때에 모든 개체에서 채혈을 한 후 백신 접종군의 경우 Nobilis® MG 6/85을 마리당 1 dose(1069cfu/dose) 용량이 되도록 제조회사가 권장하는 분무기 (Atomist; Desvac, France)를 사용하여 20 마이크론의 입자로 분무하였다. 백신 비접종군의 경우 동일한 용량의 인산완중용액(Phosphate Buffered Saline: PBS, pH7.
- 등급을 매겼다. 간단히 기술하면 정상적인 기낭 소견을 보이는 경우는 0, 약한 혼탁, 비후 및 가벼운 노란 삼출액이 관찰되는 경우를 1, 회색 또는 노란색의 삼출물이 관찰된 경우를 2, 심한 삼출물과 기낭의 비 후가 심한 경우를 3, 심한 기낭 비후 및 삼출물이 수반되는 심한 기낭염인 경우를 4로 등급을 매겨 구분하였다 [22], 혈청학적 검사는 백신 접종전과 백신 접종 후 2주 때 혈액을 채취하여 검사하였다.
- 농장)을 대상으로 실시하였다. 시험 대상인 2개 농장, 4개의 계사는 백신 접종 전 농장의 마이코플라즈마감염 상황을 파악하기 위해 백신 접종 1주전 계사별로 20수씩 채혈하여 혈청검사를 실시하여 마이코플라즈마감염 여부를 파악하였다.
- 각 농장의 2개의 계사 중 한 계사의 산란계는 백 신접 종군[A-l(9, 830수)과 B-1(42, 377수)]으로 삼고 나머지 다른 계사의 산란계를 백신을 접종하지 않은 군[A-2(7, 670 수)와 B-2(42, 251 수)]으로 설정한 후 백신접종군의 경우 Nobilis® MG 6/85 백신을 마리당 ldose(> 1069cfo/dose) 용량으로 제조회사에서 권장하는 20마이크론 분무기 (Atomist)를 사용하여 백신을 접종하였다. 백신 접종은 A농장의 경우 17주령에, B농장의 경우 15주령에 각각 실시하였다.
- 백신 접종은 A농장의 경우 17주령에, B농장의 경우 15주령에 각각 실시하였다. 백신 접종 후 50주령 까지 폐사율, 산란율, 계란의 질(특란, 대란, 중란, 소란, 경란의 분포), 호흡기 증상을 비롯한 기타 임상증상 등을 자세히 관찰 기록하였다. 산란율은 두 가지 방식, 헨데이와 헨하우스 산란율을 측정하였는데 헨 데이 (hen-day, HD) 산란율은 폐사를 감안한 산란율 계산 방법으로 농장의 그날 그날의 현황을 파악하기에 용이하여 흔히 사용하는 방법으로 HD 산란율 = [산란갯수/(초기 입식 마리수 - 폐사 마리수)] X 100(%)으로 산출하였다.
- 백신 접종 후 50주령 까지 폐사율, 산란율, 계란의 질(특란, 대란, 중란, 소란, 경란의 분포), 호흡기 증상을 비롯한 기타 임상증상 등을 자세히 관찰 기록하였다. 산란율은 두 가지 방식, 헨데이와 헨하우스 산란율을 측정하였는데 헨 데이 (hen-day, HD) 산란율은 폐사를 감안한 산란율 계산 방법으로 농장의 그날 그날의 현황을 파악하기에 용이하여 흔히 사용하는 방법으로 HD 산란율 = [산란갯수/(초기 입식 마리수 - 폐사 마리수)] X 100(%)으로 산출하였다. 헨 하우스(hen-house, HH) 산란수는 헨 하우스(hen-house) 산란율과 같은 개념의 표현 방식으로 총누적 산란수를 초기입식 마리수로 나눈 값이다.
- B 농장의 경우, 백신 접종 후 혈청학적 검사를 실시하기 위하여 백신 접종 후 일정한 간격으로 각 군당 20 마리씩 무작위로 선발하여 채혈을 하고, 혈청을 분리한 후 상기에 언급한 방법대로 SPA와 ELISA 검사를 실시하여 양성율 및 역가의 변화를 분석하였다.
- 부검 후 기낭염의 병변 소견을 관찰하였다. 음성대조군(IV), 백신만 접종한 군 (I)은 모두 기낭염이 관찰되지 않았다.
- 실시하였다. 야외 실험의 경우 A와 B농장 간 계군의 수수에서 큰 차이를 보이는 것은 다양한 수수에 대한 반응을 알아보기 위해 국내 농장 중 소규모의 농장과 대규모의 농장을 택 일 했고 한 농장내에서 두 개의 계사로 구분하여 백신 접종군과 백신 비접종 대조군으로 시험을 수행하였다. A와 B농장 모두 농장의 평균 산란율은 백신 접종군이 대조군에 비해서 유의성 있게 높은 것으로 나타났다.
- A, B농장 모두 백신 접종 전 채혈을 통하여 MG가 감염되지 않았음을 확인한 후 백신을 접종하였다. B 농장의 경우 15주령에 백신을 접종했는데 20주령 때 채혈을 실시하여 혈청검사를 한 결과, 백신 접종군(B-1)은 물론 백신을 접종하지 않은 군(B-2)에서도 양성항체가 검출되었다.
- MG 6/85 백신을 국내의 산란계 농장에 적용하기에 앞서 백신의 유효성 및 안전성을 조사하기 위해 SPF 닭 및 규모와 사육시설이 다른 두 개의 국내 산란계 농장에 접종한 후 나타나는 생산성 효과를 비교 분석하였다. MG 6/85 백신 접종은 강병원성의 MG R strain으로 공격 접종에도 기낭 병변의 형성이 거의 일어나지 않았고 기낭 내의 균 분리도 최소화 시켜 MG 6/85백신 균주가 병원성 균주의 감염에 대해 우수한 방어능이 있음이 확인되었다.
- MG에 대한 혈청학적 검사는 국립수의과학검역원에서 제조한 혈청평판응집반응용 MG진단액을 이용한 혈청 평 판응집 반응(serum plate agglutination: SPA)과 IDEXX 사(IDEXX Laboratories, USA)에서 제조한 MG 항체시험 FlockCheck ELISA kit를 사용하였으며, 항체 역 가가 1, 076 보다 클 경우 양성으로 판정하였다. SPA경우 국립수의과학검역원 권장방법을, ELSIA의 경우 제조회사의 방법에 준해 실시하였다.
대상 데이터
- 시험한 백신은 (쥐인터베트에서 제조된 Nobilis® MG 6/85를 사용하였고, 백신의 역가는 106.9 colony forming unit(cfo)/dose 이상이었다. 공격 접종용 균주로는 M.
- 9 colony forming unit(cfo)/dose 이상이었다. 공격 접종용 균주로는 M. gallisepticum R strain을 미국 Poultry Diagnosis and Research Center(USA)의 Kleven 박사로부터 분양 받아 사용하였다. MG의 분리 배양을 위해 12% 돼지 혈청이 첨가된 Frey 배지 [14]를 사용하였고, 기관 및 기낭에서의 MG의 채취는 멸균된 면봉을 사용하여 채취한 후 준비된 Frey배지에 접종한 후 37℃에서 배지의 색깔이 오렌지 또는 노랑색으로 변할 때까지 배양하였다.
- 야외 계군을 대상으로 시험 백신의 유효성과 안전성을 조사하기 위해 약 20, 000수 규모의 A자 케이지 유창 계사 형태의 산란계 농장(A 농장)과 약 100,000수 규모의 직립식 케이지 무창계사 형태의 Hyline 산란계 농장 (B 농장)을 대상으로 실시하였다. 시험 대상인 2개 농장, 4개의 계사는 백신 접종 전 농장의 마이코플라즈마감염 상황을 파악하기 위해 백신 접종 1주전 계사별로 20수씩 채혈하여 혈청검사를 실시하여 마이코플라즈마감염 여부를 파악하였다.
- 사용하여 백신을 접종하였다. 백신 접종은 A농장의 경우 17주령에, B농장의 경우 15주령에 각각 실시하였다. 백신 접종 후 50주령 까지 폐사율, 산란율, 계란의 질(특란, 대란, 중란, 소란, 경란의 분포), 호흡기 증상을 비롯한 기타 임상증상 등을 자세히 관찰 기록하였다.
- MG 6/85 백신의 야외 임상 시험은 두 개의 농장을 대상으로 실시하였다. 야외 실험의 경우 A와 B농장 간 계군의 수수에서 큰 차이를 보이는 것은 다양한 수수에 대한 반응을 알아보기 위해 국내 농장 중 소규모의 농장과 대규모의 농장을 택 일 했고 한 농장내에서 두 개의 계사로 구분하여 백신 접종군과 백신 비접종 대조군으로 시험을 수행하였다.
- 본 연구는 (쥐인터베트 코리아와 강원대학교 동물의학 종합연구소의 지원에 의해 수행되었다.
데이터처리
- 통계적 처리에서 각 군간의 비교는 Bonferroni-Dunn- T test 방법에 의해 실시하였다. 통계적 분석은 유의차 수준 0.
- test 방법에 의해 실시하였다. 통계적 분석은 유의차 수준 0.05에서 결과에 대한 가설 검정을 실시하였다.
이론/모형
- MG의 분리 배양을 위해 12% 돼지 혈청이 첨가된 Frey 배지 [14]를 사용하였고, 기관 및 기낭에서의 MG의 채취는 멸균된 면봉을 사용하여 채취한 후 준비된 Frey배지에 접종한 후 37℃에서 배지의 색깔이 오렌지 또는 노랑색으로 변할 때까지 배양하였다. MG의 동정은 Nascimento 등이 보고한 PCR 방법을 사용하였다 [27],
- 클 경우 양성으로 판정하였다. SPA경우 국립수의과학검역원 권장방법을, ELSIA의 경우 제조회사의 방법에 준해 실시하였다.
성능/효과
- 백신 접종 4주 후에 MG R strain으로 공격 접종을 실시하였고, 공격 접종 후 14일 동안 임상 증상 및 폐사율을 매일 관찰한 결과 각 군간에 임상 증상과 폐사율은 특별히 차이점이 없었다. 각 군의 혈청학적인 결과를 보면, 혈청평판응집반응으로 측정한 경우 백신 비접종음성 대조군(IV)에서는 항체 양성율이 0%인 반면에, 백신만 접종한 군(1)이나 공격 접종한 군(Ⅱ, HI)은 모두 100%의 항체 양성율을 나타냈다.
- 차이점이 없었다. 각 군의 혈청학적인 결과를 보면, 혈청평판응집반응으로 측정한 경우 백신 비접종음성 대조군(IV)에서는 항체 양성율이 0%인 반면에, 백신만 접종한 군(1)이나 공격 접종한 군(Ⅱ, HI)은 모두 100%의 항체 양성율을 나타냈다. 양성 항체의 역가를 ELISA로 측정한 결과 백신 접종 후 공격 접종한 군(II) 이 가장 높은 역가 3, 272을 보였고 백신만 접종한 군(1) 과 공격 접종만 한 군(Ⅲ)은 역가가 각각 784와 708으로 유사하게 나타났다(Table 1).
- 각 군의 혈청학적인 결과를 보면, 혈청평판응집반응으로 측정한 경우 백신 비접종음성 대조군(IV)에서는 항체 양성율이 0%인 반면에, 백신만 접종한 군(1)이나 공격 접종한 군(Ⅱ, HI)은 모두 100%의 항체 양성율을 나타냈다. 양성 항체의 역가를 ELISA로 측정한 결과 백신 접종 후 공격 접종한 군(II) 이 가장 높은 역가 3, 272을 보였고 백신만 접종한 군(1) 과 공격 접종만 한 군(Ⅲ)은 역가가 각각 784와 708으로 유사하게 나타났다(Table 1).
- 2)ELISA titers greater than 1,076 are considered positive.
- 3)SPF chickens in vaccinated groups were vaccinated at 6 week old.
- 실험계에서 기관 및 기낭으로부터 균을 분리한 결과, 음성 대조군(IV)의 경우 기관과 기낭에서는 MG가 전혀 분리되지 않았다. 백신만 접종한 군(I)에서는 기관에서 25%가 검출된 반면, 기낭에서는 전혀 검출 되지 않았다.
- 1로 매우 낮았다. 따라서, Nobilis® MG 6/85 백신은 공격 접종 균주에 충분히 방어 능력을 부여하는 것으로 나타났다.
- 1)Commercial layers on farm A and B were vaccinated at 17 and 15 week old, respectively.
- A농장의 평균 산란율은 백신 접종군(A-1)이 82.61%, 대조군(A-2)이 77.30%로 백신 접종군이 유의성 있게 5.31% 더 높게 나타났고, B농장 역시 백신 접종군(B-1) 과 대조군(B-2)에서 각각 86.11%와 83.81%로 백신 접종 군이 유의성 있게 2.30% 더 높은 것으로 나타났다 (Table 2).
- 평균 폐사율에 있어서는 유의성 있는 수준은 아니나, A농장이 백신 접종군(A-1)과 대조군(A-2)에서 각각 0.07%와 0.28%로 백신 접종군이 0.21% 더 낮은 것으로 나타났지만, B농장에서는 백신 접종군(B-1)과 대조군(B- 2)이 각각 0.23%와 0.15%로 오히려 백신 접종군이 0.08% 더 높은 것으로 나타났다.
- A농장의 경우 헨 하우스 산란수가 대조군에 비하여 백신 접종군이 8.95개가 많았으며, B농장의 경우 백 신접 종군이 8.15개가 더 많은 것으로 나타났고, 난중에 있어서는 A와 B농장 각각 0.40 g과 0.44 g이 백신 접종 군에서 더 높은 것으로 나타났다.
- A와 B 농장의 4개 계사를 대상으로 백신 접종 1주 전계 사별로 각각 20수씩 채혈한 후 MG항체를 SPA와 ELISA로 측정한 결과 모두 음성으로 나타나 백신 접종 전 감염이 일어나지 않은 것으로 나타났다. B농장의 경우 백신 접종5주(20주령)후에 백신 접종군(B-1)에서는 45%의 항체 양성율을 보이고 평균 역가는 301을 나타냈다.
- 공격 접종 균주 R strain으로 접종한 후 2주 뒤에 기낭 염 형성을 관찰한 결과 87.5%의 기낭 병변 형성을 보이고 기낭염 병변 정도도 평균 1.0을 보였다. 백신 균주 6/85의 권장 용량을 분무로 접종한 후 4주 뒤에 R strain 으로 접종한 경우에는 기낭염 발생율이 12.
- 0을 보였다. 백신 균주 6/85의 권장 용량을 분무로 접종한 후 4주 뒤에 R strain 으로 접종한 경우에는 기낭염 발생율이 12.5%로 감소하였고 기낭염 병변 정도도 0.1 로 공격 접종군에 비해 크게 감소하였다. Abd-El-Motelib과 Kleven [4]은 6/85 백신 균주의 기낭염 병 변을 방어하는 능력 이 F-strain과 ts- 11에 비해 떨어지는 것으로 발표하였는데, 이러한 이유는 6/85 백신의 경우 권장 접종 경로인 분무에 의한 접종이 아니라 점안 접종으로 실시하였기 때문으로 판단된다.
- 야외 실험의 경우 A와 B농장 간 계군의 수수에서 큰 차이를 보이는 것은 다양한 수수에 대한 반응을 알아보기 위해 국내 농장 중 소규모의 농장과 대규모의 농장을 택 일 했고 한 농장내에서 두 개의 계사로 구분하여 백신 접종군과 백신 비접종 대조군으로 시험을 수행하였다. A와 B농장 모두 농장의 평균 산란율은 백신 접종군이 대조군에 비해서 유의성 있게 높은 것으로 나타났다.
- 평균 폐사율에 있어서는 A농장의 백신 접종군이 대조군에 비해 유의성 있지는 않지만 더 낮은 것으로 나타났고, B농장에서는 백신 접종군이 대조군에 비해 유의성 있지는 않지만 높은 것으로 나타났다. B농장의 경우 폐사율이 백신 접종군에서 약간 높게 나타난 것은 백신접종군과 대조군 모두에서 약추를 선별하여 강제 도태시키고, 22~23주령에 가금 티프스에 의한 폐사를 포함시킨 점에 기인한 것이다.
- 제외 시키기 위해서였다. 그 결과 A, B농장 모두 헨 하우스 산란수가 대조군에 비하여 백신 접종 군이 약 8~9개 정도 많았고, 난중에 있어서는 A와 B농장 모두 백신 접종군이 대조군에 비해 무거운 것으로 나타났다. 이러한 결과는 기존의 보고와 유사하게 나타났다 [8, 12, 16],
- 이러한 수치는 MG 6/85 백신 접종에 의한 항체 형성보다는 농장내에 비록 임상 증상으로는 관찰이 되지 않았지만 MG의 감염이 있었던 것으로 판단된다. 이 연구에서 행한 백신의 공격 접종 시험에서 백신만 접종한 군에서의 평균 항체가가 공격 접종한 군의 역가에 비해서 다소 높게 나타난 점과 특히, 백신을 한 후 공격 접종을 한 군에서 매우 높은 항체 가를 보인 것을 근거로 볼 때 B농장의 경우 농장 내에 야외 MG 균주의 감염이 있었던 것으로 추정되고 있다. 따라서 백신을 접종한 경우 농장내에 MG의 감염이 있다 하더라도 잘 방어하는 것으로 나타났다.
- 이 연구에서 행한 백신의 공격 접종 시험에서 백신만 접종한 군에서의 평균 항체가가 공격 접종한 군의 역가에 비해서 다소 높게 나타난 점과 특히, 백신을 한 후 공격 접종을 한 군에서 매우 높은 항체 가를 보인 것을 근거로 볼 때 B농장의 경우 농장 내에 야외 MG 균주의 감염이 있었던 것으로 추정되고 있다. 따라서 백신을 접종한 경우 농장내에 MG의 감염이 있다 하더라도 잘 방어하는 것으로 나타났다.
- 분석하였다. MG 6/85 백신 접종은 강병원성의 MG R strain으로 공격 접종에도 기낭 병변의 형성이 거의 일어나지 않았고 기낭 내의 균 분리도 최소화 시켜 MG 6/85백신 균주가 병원성 균주의 감염에 대해 우수한 방어능이 있음이 확인되었다. MG 6/85 백신을 실제 국내 실용 산란계에 적용하여 시험한 결과에서도 산란율의 증가 및 도태를 포함한 폐사율의 감소 등에서 백신을 접종하지 않은 비접종 대조군과 비교할때 백신 접종군의 생산성 효과를 인정할 수 있었다.
후속연구
- 이상으로, 이번 연구 결과와 여러 연구자들의 보고 결과를 미루어 볼 때 MG 6/85 백신은 국내에 만연된 마이코플라즈마 감염증의 발생 방지를 위하여 효과적인 생균 백신으로서 활용이 가능할 것으로 생각된다.
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