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문제 정의
- 생물막 형성과 관 재질의 상호관계에 대한 이해 증진을 위해 본 연구에서는 생물막 형성에 미치는 관재질의 영향을 다룬 기존의 연구와는 다른 측면에서 community-level assay를 이용하여 수도관에서 형성되는 생물막 미생물의 CLPP 패턴을 분석함으로써 수도관 재질에 따른 생물막 형성 미생물의 생리학적 또는 기능적 특성을 비교 조사하고자 하였다.
제안 방법
- Re 는 유체입자에 작용하는 관성력과 점성력의 비로서, Re 1, 950과 7, 300은 각각 층류흐름과 난류 흐름으로 볼 수 있다. 모형 수도관은 실내(13~15。(2)에서 3개월 동안 운전하였으며 , 운전 시작으로부터 각각 20, 40, 70, 90일 경과 후에 수도관 시편 표면에서 생물막 형성을 조사하였다.
- Community-level assay를 이용하여 작성 한 CLPP 패 턴은 기질이용수와 MPI(metabolic potential index)에 근거하여 분석하였다. 기질이용수는 탄소원을 함유한 95개 well 중에서 positive well(A59O>0.
- 그리고 CLPP 패턴은 탄소원을 함유한 well의 흡광도 값에서 탄소원을 함유하지 않은 control well 의 홉광도 값을 빼서 작성 했으며 , 이때 (-) 를 나타낸 흡광도 값들은 0으로 기록하였다. Garland(1996)가 제안한 바와 같이 전혀 기질을 이용하지 않았거나 낮은 발색 반응을 나타낸 well을 명확하게 구별하기 위해서 흡광도가 0.25보다 큰 값을 나타낸 well(As9o>O.25)을 positivewell로 간주하였다.
- 2)로 세척한 후에 ethanol 농도를 50~100%까지 10%씩 증가시키면서 탈수(dehydration)시키고 임계점 건조기 (critical point dryer)로 건조시 켰다. 건조한 시편은 ion sputter (Model E-1010, HITACHI) 에서 Pt-Pd로 coating한 후 SEM(Model S-4300, HITACHI) 을 이용하여 적당한 배율에서 생물 막을 관찰하였다.
- 관 표면에 형성된 생물막은 주사형 현미경 (SEM, scanning electron microscope) 을 이용하여 관찰하였다. 먼저, 모형 수도관에서 회수한 시편을 2.
- )를 이용하였다 (Gagnon and Slawson, 1999). 시편에 가역적으로 부착한 생물막 세균을 증류수로 우선 제거한 후 시편을 60mL 인산염 완충용액 (0.3mM, pH 7.2)에 옮겨 ultrasonic cleaner3분씩 3회 처 리하고, cell scraper 로 수회 긁어 생물막을 회수하였다. 생물막 회수 과정은 멸균 조작법에 준해서 수행하였으며, 사용된 모든 용액 및 용기는 멸균 후 사용하였다.
- 재질(PVC, STS, GS)에 따른 생물막 형성을 알아보기 위한 본 실험에서는 모형 수도관에서의 유속을 0.08m/sec와 0.28m/sec로 각각 유지하였다. 즉, 시편 (PVC, STS, GS)을 설치한 모형 수도관 2set 중 Iset 는 수도관내 유속이 0.
- 28m/sec로 각각 유지하였다. 즉, 시편 (PVC, STS, GS)을 설치한 모형 수도관 2set 중 Iset 는 수도관내 유속이 0.08m/sec가 되도록 정량펌프 (peristaltic pump) 를 이용하여 수돗물을 4L/min의 유량으로 모형 수도관에 연속적으로 공급하였으며, 나머지 Iset는 관내 유속을 0.28m/sec로 유지하기 위하여 수돗물을 15L/min으로 공급하여 운전하였다. 관내 유속 0.
대상 데이터
- Fig. 1은 실험에 사용한 모형 수도관의 개략도이며 , 동일한 규격의 수도관 2set를 실험에 이용하였다. 모형 수도관은 전체 길이가 5m이고 내부 단면적이 9cm2 (3cm x 3cm) °1 정 사각형 구조로서 , 관을 따라 80 개소에 test plug를 설치 할 수 있도록 되어 있다.
- 모형 수도관은 전체 길이가 5m이고 내부 단면적이 9cm2 (3cm x 3cm) °1 정 사각형 구조로서 , 관을 따라 80 개소에 test plug를 설치 할 수 있도록 되어 있다. Test plug는 수도관 시편을 부착하기 위한 용도로 사용하였으며, Fig. 1과 같이 직경이 20mm가 되게 홈을 낸 모형 수도관 표면에 설치할 수 있도록 제작하였다.
- 6b). 또한 GS 표면에서 형성된 생물막 미생물은 주로 polymers(a- cyclodextrin, dextrin, tween40, tween80), carbohydrates(cellobiose, maltose, D-trehalose), carboxylic acids(/3-hydroxybutyric acid, itaconic acid, quinic acid, succinic acid), amino acids(L-glutamic acid, glycyl-L-aspartic acid), aromatic chemicals(urocanic acid, uridine)에 해당하는 몇몇 탄소원만을 이용하였다 (Fig. 6c).
-
1.생물막 시료 회수
수도관 시편 표면에 형성된 생물막을 회수하기 위해 ultrasonic cleaner (Model 2210, Bransonic®) 와 ceH scraper(Becton & Dickinson Co.)를 이용하였다 (Gagnon and Slawson, 1999)
. 시편에 가역적으로 부착한 생물막 세균을 증류수로 우선 제거한 후 시편을 60mL 인산염 완충용액 (0. - 실험에 사용한 수돗물 시료는 배 . 급수 계통을 거쳐 실험실로 공급되는 수돗물이었으며, Table 1은 모형 수도관에 공급한 수돗물의 물리·화학적 및 미생물학적 수질 특성이다.
- 실험에서 수도관 재질로는 두께가 2mm이고 유효표면적이 각각 2.0, 2.27, 2.27cm2인 PVC, STS (stainless steel) 304, GS(gal.,ainzed steel) 시편을 사용하였다. 모든 시편은 모형 수도관에 설치하기 전에 test plug에 부착시켜서 증류수로 수회 세척한 후 clean bench에서 건조시 켰다.
이론/모형
- 시료의 pH는 pH meter(Model 710A, Orion)를 이용하여 측정하였으며, 경도와 알칼리도의 분석에는 ethylenediaminetetraacetic acid-1- 이용한 적정법과 mixed bromocresol green-methyl red indicator를 이용한 적 정 법 을 각각 사용하였다. 그리고 잔류염소는 N, N-diethyl-p- phenylenediamine ferrous titrimetric method 로 분석 하였고, 암모니아성 질소와 인산염 인은 각각 Phenate 방법과 Ascorbic acid 방법으로 분석하였다. TOC는 TOC analyzer (Model Phoenix 8000, Tekmar-
- 2)에 옮겨 ultrasonic cleaner3분씩 3회 처 리하고, cell scraper 로 수회 긁어 생물막을 회수하였다. 생물막 회수 과정은 멸균 조작법에 준해서 수행하였으며, 사용된 모든 용액 및 용기는 멸균 후 사용하였다.
- 수돗물의 수질은 Standard Methods(APHA et al., 1998) 에 준하여 분석하였다. 시료의 pH는 pH meter(Model 710A, Orion)를 이용하여 측정하였으며, 경도와 알칼리도의 분석에는 ethylenediaminetetraacetic acid-1- 이용한 적정법과 mixed bromocresol green-methyl red indicator를 이용한 적 정 법 을 각각 사용하였다.
- , 1998) 에 준하여 분석하였다. 시료의 pH는 pH meter(Model 710A, Orion)를 이용하여 측정하였으며, 경도와 알칼리도의 분석에는 ethylenediaminetetraacetic acid-1- 이용한 적정법과 mixed bromocresol green-methyl red indicator를 이용한 적 정 법 을 각각 사용하였다. 그리고 잔류염소는 N, N-diethyl-p- phenylenediamine ferrous titrimetric method 로 분석 하였고, 암모니아성 질소와 인산염 인은 각각 Phenate 방법과 Ascorbic acid 방법으로 분석하였다.
성능/효과
- 1) 수돗물과 접촉한 PVC, STS, GS 표면에서는 5 ㎛ 미만의 자루형, 간상형, 구형 세균이 입자성 물질과 결합하여 형성된 생물막이 관찰되었다. 운전조건이 동일한 수도관에서 재질에 따른 생물막 형성 부착성 HPC의 차이는 약 Ilog CFU/cm2 이하였다.
- 2) 생물막 형성 미생물은 탄소원에 대한 물질대사 능력이 반영된 독특한 CLPP 패턴을 나타냈다. 특히 서로 다른 재질에서 형성된 생물막 미생물의 CLPP 패턴은 이용하는 탄소원의 종류 및 이용한 탄소 원의 활성도에 있어 차이를 나타냈다.
- 3) 생물막 미생물의 기능적 특성에 미치는 재질의 효과는 유속과 같은 수도관의 운전조건에 의해 변화하는 특징을 나타냈다. 유속이 0.
- 재질에 따라 차이를 나타냈다. Fig.4의 CLPP 패턴과 같이 생물막 미생물은 공통적으로 몇몇 탄소원 (dextrin, glycogen, /-erythritol, a-D-lactose, D- melibiose, D-raffinose, turanose, itaconic acid, a-keto valeric acid, thymidine, ghicoseT-phosphate)에 대해서는 전혀 대사 능력을 나타내지 않았지만, STS 표면에 형성된 생물막 미생물은 형성기간 동안 Biolog GN microplate의 95개 탄소원들 중에서 각각 69종과 60 종의 탄소원을 이용한 PVC와 GS 표면의 생물막 미생물보다 상대적으로 많은 78종의 탄소원을 이용하는 특징을 보였다. 특히 STS 표면에 형성된 생물막미생물은 PVC와 GS 표면에서 형성된 생물막 미생물과는 달리 특정 탄소원 (orcyclodextrin, N-acetyl-D- galactosamine, adonitol, D-psicose, a-hydroxybutyric acid, D-serine, 2, 3-butanediol, D, L-a-glycerol phospha伊)을 추가적으로 이용하는 능력을 나타냈다.
- 49와 0 981og CFU/cm2 높았다. 또한 Fig. 3b같이 수돗물을 0.28m/sec의 유속으로 공급한 수도관의 경우에서는 부착성 HPC의 수준에 미치는 재질의 효과는 더욱 작게 나타났는데, STS와 PVC 사이의 부착성 HPC의 평균적인 차이는 O.371og CFU/cm, 이었고, STS와 GS 사이의 부착성 HPC의 평균적 인 차이는 0.061ogCFU/cm2 이 었다.
- 특히 서로 다른 재질에서 형성된 생물막 미생물의 CLPP 패턴은 이용하는 탄소원의 종류 및 이용한 탄소 원의 활성도에 있어 차이를 나타냈다. 또한 동일 재질에서도 형성기간에 따라 생물막 미생물의 CLPP 패턴은 변화하는 특성을 보였다.
- 그러므로 이러한 CLPP 패턴은 미생물 군집 내에 우점하는 미생물의 물질대사 능력과 관련되어 나타난 결과라고 할 수 있을 것이다. 비록 본 연구에서 분자생물학적 기법에 근거한 생물막 구성 미생물의 군집 구조 변화에 대한 정성적인 분석을 수행하지 않은 관계로 재질에 따른 미생물 종의 분포나 변화에 대해서는 알 수 없지만, 미생물 군집의 물질대사 능력 차이에 기초한 CLPP 결과들은 관 재질과 같은 생물 막 형성을 위한 서식 환경에 따라 생물막을 구성하는 미생물의 생리적 또는 기능적 대사 활성도에 차이가 발생할 수 있다는 것을 의미한다. CLPP 패턴은 접 종원의 세포 밀도 (cell density) 에 의해 영향을 받을 수 있으나(Garland and Mills, 1991 ; Zak et al.
- 그러나 기질이용수가 유사한 군집일 경우는 이용 기질의 활성도 크기에 비례하여 나타날 수 있다. 생물 막을 구성하는 미생물의 시간적인 변화라든가 생물 막 군집의 생리학적인 불균일성으로 판단되는 원인에 의하여 생물막 형성기간에 따라 생물막 미생물의 기질이 용수와 M田가 변화하는 특성을 나타내기는 하였으나, 전반적으로 GS 표면에 형성된 생물막 미생물이 PVC와 STS 표면에서 형성된 생물막 미생물보다 동일 기간에서 상대적으로 낮은 물질대사 능력을 나타냈다. PVC와 STS 표면에 형성된 생물막 군집이 특정 기질에 대한 생리적 또는 기능적 활성도가 상대적으로 높은 미생물로 구성되었을 것으로 판단된다.
- 7b). 생물막 미생물의 기질이 용수와 MPI에 근거하여 볼 때 (Fig. 7) 주어진 수도관의 운전조건에서 PVC 표면에 형성된 생물막미생물의 물질대사 능력이 상대적으로 가장 높았으며, STS 표면에서 형성된 생물막 미생물의 물질대사 능력이 상대적으로 가장 낮은 특성을 보였다.
- 생물막 미생물의 기질이용수와 MPI에 근거하여볼 때 유속이 0.08m/sec인 수도관에서는 GS에 형성된 생물막 미생물보다 PVC와 STS에 각각 형성된 생물 막 미생물의 물질대사 능력 이 동일기 간에서 상대적으로 높았지만, 유속이 0.28m/sec인 수도관에서는 STS 표면에 형성된 생물막 미생물의 물질대사 능력 수준이 PVC나 GS에 형성된 생물막 미생물보다 상대적으로 가장 낮았다. 특히 0.
- 08m/sec(Re 1, 950)의 유속으로 3개월 동안 연속적으로 공급한 모형 수도관의 PVC, STS, GS 시편 표면을 SEM으로 관찰한 사진이다. 수돗물과 접촉한 PVC, STS, GS 시편의 모든 표면에서 생물 막을 형성하는 세균이 부착되어져 있음을 확인할 수 있었는데, 이는 Table 1과 같이 AOC나 BDOC가낮은 빈영양성 수돗물일지라도 수돗물에 존재하는 미생물이 수도관 표면에 부착하여 생물막을 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 수도관 시편 표면에서는 약 5 四보다 작은 크기의 자루형 (stalked-shaped), 간상형 (rod-shaped), 구형 (spherical-shaped) 세균이 두드러지게 관찰되었으며, 대부분 세균들은 표면에 침적된 입자성 물질과 결합한 상태로 존재하였다.
- 급수 계통을 거쳐 실험실로 공급되는 수돗물이었으며, Table 1은 모형 수도관에 공급한 수돗물의 물리·화학적 및 미생물학적 수질 특성이다. 수돗물에서 검출된 잔류염소의 평균 농도는 0.20mg/L이었으며, TOC(total organic carbon) 농도는 O.57mg/L이 었고, AOC (assimilable organic carbon) 와 BDOC(biodegradable dissolved organic carbon)의 평균 농도는 각각 38(ug/L 과 O.25mg/L이었다. 그리고 수돗물에서 검출된 평균 HPC(heterotrophic plate count)는 15CFU/mL이 었다.
- 특징을 나타냈다. 유속이 0.08m/sec인 수도관에서는 GS에서 형성된 생물막 미생물보다 PVC와 STS 에 각각 형성된 생물막 미생물의 물질대사 능력이 동일 기간에서 상대적으로 높았으며, 유속이 0.28m/sec 인 수도관에서는 STS 표면에 형성된 생물막 미생물의 물질대사 능력 수준이 PVC나 GS에 형성된 생물 막 미생물보다 상대적으로 가장 낮았다.
- 28m/sec인 수도관에서는 STS 표면에 형성된 생물막 미생물의 물질대사 능력 수준이 PVC나 GS에 형성된 생물막 미생물보다 상대적으로 가장 낮았다. 특히 0.08m/sec의 유속으로 운전한 수도관에서는 PVC와 STS 표면에 각각 형성 된 생물 막 미생물의 물질대사 능력이 서로 큰 차이를 나타내지는 않았지만, 유속이 0.28m/sec인 수도관에서는 PVC 표면에 형성된 생물막 미생물의 물질대사 능력 수준이 다른 재질에서 형성된 생물막 미생물보다 상대적으로 높았다. 이러한 점은 생물막 미생물의 생리적 및 기능적 특성에 미치는 재질의 효과가 유속과 같은 수도관의 운전조건에 의해서도 변화할 수 있다는 것을 나타낸다.
- 4의 CLPP 패턴과 같이 생물막 미생물은 공통적으로 몇몇 탄소원 (dextrin, glycogen, /-erythritol, a-D-lactose, D- melibiose, D-raffinose, turanose, itaconic acid, a-keto valeric acid, thymidine, ghicoseT-phosphate)에 대해서는 전혀 대사 능력을 나타내지 않았지만, STS 표면에 형성된 생물막 미생물은 형성기간 동안 Biolog GN microplate의 95개 탄소원들 중에서 각각 69종과 60 종의 탄소원을 이용한 PVC와 GS 표면의 생물막 미생물보다 상대적으로 많은 78종의 탄소원을 이용하는 특징을 보였다. 특히 STS 표면에 형성된 생물막미생물은 PVC와 GS 표면에서 형성된 생물막 미생물과는 달리 특정 탄소원 (orcyclodextrin, N-acetyl-D- galactosamine, adonitol, D-psicose, a-hydroxybutyric acid, D-serine, 2, 3-butanediol, D, L-a-glycerol phospha伊)을 추가적으로 이용하는 능력을 나타냈다. 또한 GS 표면에 형성된 생물막 미생물은 STS와 PVC: 표면에 형성된 생물막 미생물이 이용한 몇몇 탄 소원 (celloboise, L-fucose, maltose, D-glucosaminic acid, v-hydroxybutyric acid, p-hydroxy phenylacetic acid, malonic acid, propionic acid, L-histidine, L- phenylalanine, L-pyroglutamic acid, glucose-6- phosphate)을 전혀 이용하지 않는 특징을 보이기도 하였다.
후속연구
- 접 종된 미 생 물에 의해 탄소원이 산화되면 tetrazolium이 fbnnazari으로 환원되면서 자주색을 나타내게 된다. 미생물 군집의 기질 이용 차이를 의미하는 발색 반응의 차이로부터 CLPP 패턴을 작성할 수 있으며, 이는 미생물 군집 간의 유사성과 차이점을 평가하기 위한 자료로 사용될 수 있다. Biolog GN microplate에 함유된 95개의 탄소 원은 11개 그룹으로 분류된다(Garland and Mills, 1991) : polymers(77 = 5), carbohydrates(w = 28), esters= 2), carboxylic acids(n = 24), brominated chemicals3 = 1), amides(n = 3), amino acids3 = 20), aromatic chemicals (n = 4), amines = 3), alcohols (n = 2), phosphorylated chemicals(w = 3).
- 그러므로 고정된 배양기간 이후의 CLPP 패턴은 생물막 미생물 본래의 특성이 반영된 결과라고 할 수 있을 것이다. 비록 CLPP 패턴에 포함된 모든 잠재적 차이들을 모두 파악할 수는 없지만, 본 연구에서 적용한 방법은 환경 조건에 따른 생물막 군집의 기능적 및 대 사적인 능력을 평가하는데 유용할 것으로 판단된다.
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