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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 고추 탄저병을 야기하는 c. gloeospor- ioides에 대하여 강한 항진균 활성을 나타내는 균주를 분리하여 길항균주가 생산하는 항진균물질의 생산조건을 검토하고 고추 탄저병을 방제할 수 있는 미생물제제의 개발을 위한 가능성을 조사하였다.
제안 방법
- 24〜72시간 동안 선별한 균주를 배양한 후, 24시간마다 배양액을 sampling 하여 배양시간에 따른 항진균 활성을 조사 하였다.
- 0)로 현탁하고 4 °C에서 24시간 동안 투석하였다. C. gloeosporioides의 포자현탁액(5.52x10° spores/ml)을 50 ml의 PDB에 접종하고 동량의 회수한 물질을 각각 첨가하여 항진균 활성을 조사하였으며 대조구에는 동량의 Tris-HCl buffer (pH 8.0)를 첨가하였다.
- 노르웨이의 Oslo시 지역의 토양시료로부터 분리된 Bacillus sp. KMU-991 를 이용하여 고추 탄저병균인 Colletotruchum gloeosporioides KACC 40804에 대한항진균 활성을 위한 배양조건을 조사하였다. 항진균물질의 생산은 기본 배지로 TSB 를 사용하였으며 탄소원으로 1.
- 앞에서 조사된 조건으로 배양액을 제조하여 2일간 Bacillus sp. KMU-991 을 배양하고 배양액을 0〜 30%와 30〜60%의 ammonium sulfate로 각각 포화시킨 후 투석하여 조정제 물질을 최종적으로 회수하였다. 회수한 물질을 50 ml PDB에 동량 첨가하고 24°C, 150 rpm으로 7일간 배양한 후 건조 중량을 측정한 결과 배양액에 30-60% am monium sulfate 침전물을 처리한 경우에 0.
- 다양한 작물병원성 곰팡이에 대한 Bacillus sp. KMU-991 의 항진균 활성spectrum을 조사하기 위하여 butanol을 이용하여 항진균물질을 회수하여 사용하였다. 위와 같은 조건으로 Bacillus sp.
- Bacillus sp. KMU-991 이 생산하는 항진균물질을 조정제하여 액체 배양을 통한 C. gloeosporioides의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 앞에서 조사된 조건으로 배양액을 제조하여 2일간 Bacillus sp.
- 토양시료로부터 분리된 균주 중에서 육안관찰, 형태 및 증식양상이 서로 구별되어지는 43균주를 일차적으로 선별하였다. 고추 탄저병을 야기하는 C. gloeosporioides KACC 40804에 대한 길 항균주를 선별하기 위하여 PDA plate에서 대치배양 하여 24°C에서 배양하면서 생육을 저해하는 것으로 판단되어지는 8균주를 일차적으로 선발하였다. 선발된 균주 중에서 C.
- 노르웨이 Oslo시 지역의 토양시료 10 g을 멸균수 90 ml에 넣어 37°C에서 10분간 진탕배양 후, Bacillus속의 균주들을 분리하기 위하여 80°C에서 30분간 열처리를 하였다. LB agar(1.
- 다양한 작물병원성 곰팡이를 대상으로 하여 선발된 균이 나타내는 항진균 활성을 조사하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일 조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상 등액에 2배 vol- ume의 butanol을 첨가하여 항진균 물질을 용매층으로 이행시키고 용매를 회수하고 50°C 이하에서 감압농축한 후, 항진균 활성을 조사하였다.
- 배양 온도의 변화에 따른 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 기본 배지에 전 배양한 선발균을 접종한 후 24, 30, 37, 그리고 45°C에서 180 rpm으로 24시간 배양하여 균의 생육 및 항진균 활성을 조사하였다.
- 선발된 균주의 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞에서 조사되어진 항진균물질 생산배지 300 ml을 제조하고 선발된 균주를 앞에서 조사한 최적 조건에서 배양한 후, 10, 000 rpm, 4°C에서 20분간 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다. 항진균 활성을 나타내는 물질을 회수하기 위하여 ammonium sulfate를 0〜30%와 30-60% 농도로 첨가한 후, 4°C에서 12시간 정치하면서 항진균물질을 침전시켜 4°C에서 10, 000 rpm, 20분간 원심분리하여 회수하였다.
- gloeosporioides^ 생육을 저해하는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 선발한 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 선발하기 위하여 작물병원성 곰팡이를 직경 6 mm 크기의 culture disc에 접종하여 24°C에서 24시간 배양한 후, 6 cm 떨어진 곳에선별한 균주를 획선 접종하고 24笆에서 7일간 배양하면서 생육 저지대를 조사하였다. 공시균주인 C.
- 2) 배지에 단계 희석법으로 도 말하여 37°C에서 3일간 배양한 후, 증식한 균주들을 분리하였다. 증식한 균주들을 순수 분리한 후, 고추 탄저병균인 Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804를 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위하여 PDA(potato dextrose agar, 2.0% dextrose, 0.4% potato starch, 1.5% agar, pH 5.6±0.2) plate에 서 대치배양(pairing culture)을 실시하여 C. gloeosporioides^ 생육을 저해하는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 선발한 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 선발하기 위하여 작물병원성 곰팡이를 직경 6 mm 크기의 culture disc에 접종하여 24°C에서 24시간 배양한 후, 6 cm 떨어진 곳에선별한 균주를 획선 접종하고 24笆에서 7일간 배양하면서 생육 저지대를 조사하였다.
- 질소원의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 탄소원 1.0%를 기본 배지에 첨가한 후, 질소원으로 ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium sulfate, beef extract, bactopeptone, bactotryptone, com steep liquor (CSL), malt extract, polypeptone, urea, 그리고 yeast extract를 각각 1.0%씩 첨가하고 pH를 조정하여 동일한 방법으로 조사하였다.
- 초기 pH의 변화에 따른 영향을 조사하기 위하여 기본 배 지의 pH를 3.0〜 10.0으로 각각 조정하여 동일한 방법으로 배양하여 조사하였다.
- 탄소원의 첨가에 따른 항진균물질의 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 arabinose, fructose, glucose, glycerol, lac tose, maltose, mannitol, soluble starch, sorbitol, 그리고 su- crose를 기본 배지에 각각 1.0%씩 첨가하고 가장 높은 항진균 활성을 나타낸 pH로 조정한 후 사용하였다.
- 선발된 균주의 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞에서 조사되어진 항진균물질 생산배지 300 ml을 제조하고 선발된 균주를 앞에서 조사한 최적 조건에서 배양한 후, 10, 000 rpm, 4°C에서 20분간 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다. 항진균 활성을 나타내는 물질을 회수하기 위하여 ammonium sulfate를 0〜30%와 30-60% 농도로 첨가한 후, 4°C에서 12시간 정치하면서 항진균물질을 침전시켜 4°C에서 10, 000 rpm, 20분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 물질을 소량의 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
- 항진균 활성을 나타내는 선발균의 분류학상 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 도출된 결과를 Bergey's manual of systematic bacteri- ology[8]와 비교한 흑, 그 결과를 바탕으로 API kit (bioMerieux, France)을 선택하여 동정하였다.
- LB broth에 단일 콜로니를 접종하고 30°C에서 24시간 배양하여 전 배양액을 제조하였으며, 각각의 삼각플라스크에 전 배양액 100 #1를 접종한 후, 30°C, 180 rpm에서 24시간 배양하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 각각의 배양액을 10, 000 rpm, 10분간 4°C에서 원심분리 하여 균체를 침전시킨 후, agar diffusion method를 이용하여 공시 균주를 미리 접종하여 둔 PDA plate에 상 등액 20 ul 를 점적한 paper disc (0 6 mm)를 얹고, 24°C에서 7일간 배양하면서 항진균 활성을 조사하였다.
- 다양한 작물병원성 곰팡이를 대상으로 하여 선발된 균이 나타내는 항진균 활성을 조사하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일 조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상 등액에 2배 vol- ume의 butanol을 첨가하여 항진균 물질을 용매층으로 이행시키고 용매를 회수하고 50°C 이하에서 감압농축한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 조사한 작물병원성 곰팡이는 토마토 시들 음병을 야기하는 Fusarium oxysporum KACC 40037, 마른썩음병을 야기하는 F.
- 항진균물질의 생산을 위한 기본 배지를 선택하기 위하여 LB broth (1.0% tryptone, 0.5% yeast extract, 1.0% sodium chloride), NB (nutrient broth, 0.5% peptone from meal, 0.3% meat extract), PDB (potato dextrose broth, 2.0% dex trose, 0.4% potato starch), TSB (trypticase soybean broth,1.7% digest of casein, 0.3% soytone, 0.5% sodium chloride, 0.25% dextrose), 그리고 YM broth (yeast malt broth, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1.0% dex- trose)를 제조하여 pH를 7.0으로 조정한 후, 121°C에서 15분 간멸균하여 사용하였다. LB broth에 단일 콜로니를 접종하고 30°C에서 24시간 배양하여 전 배양액을 제조하였으며, 각각의 삼각플라스크에 전 배양액 100 #1를 접종한 후, 30°C, 180 rpm에서 24시간 배양하였다.
대상 데이터
- 선발한 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 선발하기 위하여 작물병원성 곰팡이를 직경 6 mm 크기의 culture disc에 접종하여 24°C에서 24시간 배양한 후, 6 cm 떨어진 곳에선별한 균주를 획선 접종하고 24笆에서 7일간 배양하면서 생육 저지대를 조사하였다. 공시균주인 C. gloeosporioides는 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농용 미생물보존센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받아 사용하였다.
- 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일 조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상 등액에 2배 vol- ume의 butanol을 첨가하여 항진균 물질을 용매층으로 이행시키고 용매를 회수하고 50°C 이하에서 감압농축한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 조사한 작물병원성 곰팡이는 토마토 시들 음병을 야기하는 Fusarium oxysporum KACC 40037, 마른썩음병을 야기하는 F. oxysporum KACC 40052, 벼잎집무 늬마름병을 야기하는 Rhizoctonia solani AG-1 (IA) KACC 40101, 참외줄기썩음병을 야기하는 R. solani AG-4 KACC 40142, 사과나무역병을 야기하는 Phytophthora camvibora KACC 40160, 토마토 에 질병을 야기하는 Fusarium oxy sporum KACC 40537, 장미잿빛곰팡이병을 야기하는 Botrytis cinerea KACC 40573, 참외탄저병을 야기하는 Colletotrichum orbiculare KACC 40808, 수박덩굴쪼김 병을 야 기하는 F. oxysporum KACC 40902, 수박에 질병을 야기하는 Monosporascus cannonballus KACC 40940, 잠두붉은점무늬 병 을 야기하는 Botrytis fabae KACC 40962, 보리에 질병을 야기하는 Fusarium graminearum KACC 41040, 그리고 Botrytis aclada KACC 41297-등을 사용하였다.
- 토양시료로부터 분리된 균주 중에서 육안관찰, 형태 및 증식양상이 서로 구별되어지는 43균주를 일차적으로 선별하였다. 고추 탄저병을 야기하는 C.
성능/효과
- KMU-991 을 24, 30, 37, 그리고 45°C에서 180 rpm, 24시간 배양한 결과, Table 4와 같이 3(rc에서 가장 -양호한 항진균 활성을 나타내었다. 30-C를 제외한 다른 배양 온도에서는 항진균 활성이 다소 미비한 것으로 조사되었으며, 37°C의 경우에는 균의 생육은 3 0°C와 비슷하였으나 활성은 미비한 것으로 나타 났으며 24°C에 비하여도 미비한 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 미루어 볼 때 Bacillus sp.
- 배양조건으로는 30°C, 180 rpm, 48시간 배양하였을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다. 30~ 60% ammonium sulfate 침전물을 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 butanol을 이용하여 배양액 중에 존재하는 항진균물질을 회수하여 다양한 작물병원성 곰팡이에 대한 spectrum을 조사한 결과 B. cinerea KACC 40573, C. orbiculare KACC 40808, F. oxysporum f. sp.
- 위와 같은 조건으로 Bacillus sp. KMU-991 를 배양한 후, 배양액 중에 존재하는 항진균물질을 butanol을 이용하여 회수한 후 agar dif fusion method로 확인한 결과, 다양한 작물병원성 곰팡이에 대하여 높은 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 F.
- 균의 증식은 TSB에서 가장 양호한 것으로 조사되었다. NB의 경우에 항진균 활성은 TSB의 67%를 나타내었으나 생육은 88%로 생육과 항진균 활성의 상관관계는 없는 것으로 판단되었다(Table 3).
- pH의 변화에 따른 항진균물질의 생산과 생육에 대한 영향을 조사한 결과, pH 7.0에서 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 8.0에서도 비슷한 수준의 항진균 활성을 나타내었다. 하지만, 중성pH인 7.
- sp. radi- cus-lycopersici KACC 40537, P. cambivora KACC 40160, 그리고 R. solani AG-4 KACC 40142 등에 대하여도 높은 항진균 활성을 나타내었다.
- sp. radicus-lycopersici KACC 40537, R. solani AG-4 KACC 40142, B. cinerea KACC 40573, C. orbiculare KACC 40808, 그리고 P. cambivora KACC 40160에 대하여 양호한 항진균 활성을 나타내었으며, 또한 다른 작물병원성 곰팡이에 대하여도 항진균 활성을 확인할 수 있었다(Table 8).이러한 결과들을 바탕으로 하여 작물병원성 곰팡이에 대한 미생물제제로 Bacillus sp.
- 첨가한 10종의 탄소원 중에서mannitol을 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 전반적으로 첨가된 탄소원에 의하여 항진균 활성이 증가되는 것으로 조사되었다. 그러나 maltose 의 경우에는 탄소원을 첨가하지 않은 대조구와 비교할 때 거의 차이를 나타내지 않았으며, sucrose의 경우에 mannitol을 첨가하였을 때와 비교하여 23%, 대조구와 비교하였을 때 11%의 항진균 활성이 저해되는 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 탄소원으로mannitol을 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으나 sucrose를 첨가하였을 때 대조구보다 낮은 항진균 활성을 나타내었다고 보고한 이 등의 보고[14]와는 동일하였다.
- 질소원으로 ammonium chloride를 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 polypeptone을 첨가한 경우에도 유사한 정도의 항진균 활성을 나타내었다. 그러나 앞서 조사한 탄소원의 경우와는 다르게 첨가한 유, 무기의 질소원에 의하여 전반적으로 항진균 활성이 감소하는 것으로 조사되었으며, 특히 beef extract를 첨가한 경우에는 ammonium sulfate를 첨가한 경우와 비교할 때 61%의 항진균 활성을 나타내었고 대조구와 비교할 때에도 67%의 항진균 활성을 나타내었다. 생육의 경우에는 전반적으로 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었으며 corn steep liquor를 첨가한 경우에 가장 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었다.
- 기본 배지를 선별하기 위하여 LB broth, NB, PDB, TSB, 그리고 YM broth를 대상으로 항진균 활성과 균의 생육을 조사한 결과 TSB를 사용한 경우에 18 mm로 가장 높은 항진균 활성을 나타내었으며 다른 배지의 경우 TSB와 비교하였을 때 83% 이하의 활성을 나타내었다. 균의 증식은 TSB에서 가장 양호한 것으로 조사되었다.
- 7 g의 건조 중량을 확인하였다. 따라서 30〜60%의 ammonium sulfate 침전물을 처리하여 회수하는 경우에 항진균 물질을 회수할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며 이 경우에 C. gloeosporioides의 생육은 대조구와 비교할 때 57% 저해를 받는 것으로 조사되었다.
- 배양일수에 따른 항진균 활성과 생육을 조사하기 위하여 본배지인 TSB에 1.0% mannitol과 1.0% ammonium chloride 를 첨가한 후, pH를 7.0으로 조정하여 1〜3일간 조사한 결과 2일간 배양하였을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내었으나 배양일수에 따른 항진균 활성의 큰 차이는 나타내지 않았으며, 증식은 1일째가 가장 높게 조사되었다 (Fig. 1).
- 0에서 전반적으로 양호한 항진균물질을 생산한다고 보고한 정 등의 보고[11]와는 상이하였다. 생육은 pH 5.0-8.0 사이에서 가장 양호하게 조사되었으며, pH 3.0에서는 증식하지 못하는 것으로 조사되 었다(Table 5).
- 이러한 결과는 탄소원으로mannitol을 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으나 sucrose를 첨가하였을 때 대조구보다 낮은 항진균 활성을 나타내었다고 보고한 이 등의 보고[14]와는 동일하였다. 생육의 경우에는 arabinose, soluble starch, 그리고 sorbitol을 첨가하였을 때 가장 양호한 증식을 하는 것으로 조사되었으며, 첨가한 탄소원 중에서 항진균 활성이 가장 낮게 조사된 sucrose의 경우에도 증식은 양호한 것으로 조사되었다. Glucose와 glycerol을 첨가한 경우에는 대조구와 비교할 때 균의 생육은 큰 차이를 나타내지 않았으나 항진균 활성은 약간 상승한 것으로 조사되었다.
- 그러나 앞서 조사한 탄소원의 경우와는 다르게 첨가한 유, 무기의 질소원에 의하여 전반적으로 항진균 활성이 감소하는 것으로 조사되었으며, 특히 beef extract를 첨가한 경우에는 ammonium sulfate를 첨가한 경우와 비교할 때 61%의 항진균 활성을 나타내었고 대조구와 비교할 때에도 67%의 항진균 활성을 나타내었다. 생육의 경우에는 전반적으로 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었으며 corn steep liquor를 첨가한 경우에 가장 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었다.
- gloeosporioides KACC 40804에 대한 길 항균주를 선별하기 위하여 PDA plate에서 대치배양 하여 24°C에서 배양하면서 생육을 저해하는 것으로 판단되어지는 8균주를 일차적으로 선발하였다. 선발된 균주 중에서 C. gloe이, orioides에 대하여 가장 높은 생육 저지대를 나타내는 균주를 최종적으로 선별하고 KMU-991 이라 명명하였다. KMU-991n 는 그람 양성의 rod form으로 내생포자를 형성하였으며 형성된 집락은 원형으로 점질성의 물질을 생산하는 mucoid type이였고, 표면은 smooth하였으나 광택은 나타내지 않았다.
- Glucose와 glycerol을 첨가한 경우에는 대조구와 비교할 때 균의 생육은 큰 차이를 나타내지 않았으나 항진균 활성은 약간 상승한 것으로 조사되었다. 이러한 결과를 바탕으로 균의 증식과 항진균 물질의 생산은 서로 상관관계에 있지 않다는 것을 확인할 수 있었다.
- 0%씩 첨가한 결과 Table 7과 같았다. 질소원으로 ammonium chloride를 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 polypeptone을 첨가한 경우에도 유사한 정도의 항진균 활성을 나타내었다. 그러나 앞서 조사한 탄소원의 경우와는 다르게 첨가한 유, 무기의 질소원에 의하여 전반적으로 항진균 활성이 감소하는 것으로 조사되었으며, 특히 beef extract를 첨가한 경우에는 ammonium sulfate를 첨가한 경우와 비교할 때 61%의 항진균 활성을 나타내었고 대조구와 비교할 때에도 67%의 항진균 활성을 나타내었다.
- KMU-991 이 생산하는 항진균물질의 생산에 미치는 탄소원의 영향은 Table 6과 같다. 첨가한 10종의 탄소원 중에서mannitol을 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 전반적으로 첨가된 탄소원에 의하여 항진균 활성이 증가되는 것으로 조사되었다. 그러나 maltose 의 경우에는 탄소원을 첨가하지 않은 대조구와 비교할 때 거의 차이를 나타내지 않았으며, sucrose의 경우에 mannitol을 첨가하였을 때와 비교하여 23%, 대조구와 비교하였을 때 11%의 항진균 활성이 저해되는 것으로 조사되었다.
- KMU-991 를 이용하여 고추 탄저병균인 Colletotruchum gloeosporioides KACC 40804에 대한항진균 활성을 위한 배양조건을 조사하였다. 항진균물질의 생산은 기본 배지로 TSB 를 사용하였으며 탄소원으로 1.0% mannitol과 질소원으로 1.0% ammonium chloride를 첨가하였을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다. 배양조건으로는 30°C, 180 rpm, 48시간 배양하였을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다.
- KMU-991 을 배양하고 배양액을 0〜 30%와 30〜60%의 ammonium sulfate로 각각 포화시킨 후 투석하여 조정제 물질을 최종적으로 회수하였다. 회수한 물질을 50 ml PDB에 동량 첨가하고 24°C, 150 rpm으로 7일간 배양한 후 건조 중량을 측정한 결과 배양액에 30-60% am monium sulfate 침전물을 처리한 경우에 0.3 g의 건조 중량 을 확인하였으며 대조구로 동량의 Tris-HCl buffer (pH 8.0)를 처리한 경우와 0〜30% ammonium sulfate 침전물을 처리한 경우 0.7 g의 건조 중량을 확인하였다. 따라서 30〜60%의 ammonium sulfate 침전물을 처리하여 회수하는 경우에 항진균 물질을 회수할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며 이 경우에 C.
후속연구
- 이러한 결과들을 바탕으로 하여 작물병원성 곰팡이에 대한 미생물제제로 Bacillus sp. KMU-991 을 이용할 수 있을 것이라는 가능성을 확인할 수 있었으며 실용적인 고추 탄저병의 생물학적 방제제 개발을 위한 포장실험, 제형개발 등의 다양한 조사를 진행할 예정이다.
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