연구배경 : 클라미디아 감염의 진단은 혈청검사로 이루어진다. 현재 표준 방법은 MIF(microimmunofluorescence)이나 이 방법은 주관적이고 시간이 많이 걸리는 단점이 있다. 최근을 SPR(surface plasmon resonance) 센서를 이용한 단백질 칩이 감염의 새로운 진단 방법으로 제시되고 있다. 클라미디아 감염의 진단을 위한 단백질 칩 개발을 위하여 금 칩 표면에 세균을 고정하고 클라미디아 균에 대한 항체와 표면 위 세균과의 반응을 SPR 센서를 이용하여 측정하고자 하였다. 방법 : 표면 항원으로 배양한 Chlamydophila pneumoniae LKK1의 EB를 정제하였다. 양전하를 띤 PDDA (polydiallyldimethylammonium chloride)를 이용하여 전하를 이용한 단백질 칩을 제작하였다. 클라미디아 균을 고정시킨 후에 atomic force microscopy를 이용하여 표면을 관찰하였다. 클라미디아 균에 대한 항체를 투여하고 나서 자체 제작한 SPR 센서를 이용하여 항원 항체 반응을 SPR 파장 변화로 측정하였다. 결과 : 양전하를 띤 PDDA 표면위에서 클라미디아 균이 고정되었음을 확인 하였다. 그리고, 항체를 투여한 후에 SPR 파장의 증가를 확인하였다. 파장 변화는 항원의 농도와 관련이 있었다. 결론 : 전하를 이용하여 클라미디아 폐렴균의 EB를 단백질 칩에 고정하였고, 단백질 칩 위에서의 항원 항체 반응을 확인하였다. 비정형 폐렴의 진단에 SPR 센서가 기여할 수 있을 것으로 사료되나, 실제 임상 시료에의 적용을 위해서는 좀더 연구가 필요할 것으로 사료된다.
연구배경 : 클라미디아 감염의 진단은 혈청검사로 이루어진다. 현재 표준 방법은 MIF(microimmunofluorescence)이나 이 방법은 주관적이고 시간이 많이 걸리는 단점이 있다. 최근을 SPR(surface plasmon resonance) 센서를 이용한 단백질 칩이 감염의 새로운 진단 방법으로 제시되고 있다. 클라미디아 감염의 진단을 위한 단백질 칩 개발을 위하여 금 칩 표면에 세균을 고정하고 클라미디아 균에 대한 항체와 표면 위 세균과의 반응을 SPR 센서를 이용하여 측정하고자 하였다. 방법 : 표면 항원으로 배양한 Chlamydophila pneumoniae LKK1의 EB를 정제하였다. 양전하를 띤 PDDA (polydiallyldimethylammonium chloride)를 이용하여 전하를 이용한 단백질 칩을 제작하였다. 클라미디아 균을 고정시킨 후에 atomic force microscopy를 이용하여 표면을 관찰하였다. 클라미디아 균에 대한 항체를 투여하고 나서 자체 제작한 SPR 센서를 이용하여 항원 항체 반응을 SPR 파장 변화로 측정하였다. 결과 : 양전하를 띤 PDDA 표면위에서 클라미디아 균이 고정되었음을 확인 하였다. 그리고, 항체를 투여한 후에 SPR 파장의 증가를 확인하였다. 파장 변화는 항원의 농도와 관련이 있었다. 결론 : 전하를 이용하여 클라미디아 폐렴균의 EB를 단백질 칩에 고정하였고, 단백질 칩 위에서의 항원 항체 반응을 확인하였다. 비정형 폐렴의 진단에 SPR 센서가 기여할 수 있을 것으로 사료되나, 실제 임상 시료에의 적용을 위해서는 좀더 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Background; The diagnosis of chlamydial infection is based on serology. The current gold standard of diagnosis is MIF(microimmunofluorescence), but this modality is subjective and time-consuming. Protein microarray with using a SPR(surface plasmon resonance) sensor has recently been suggested as a m...
Background; The diagnosis of chlamydial infection is based on serology. The current gold standard of diagnosis is MIF(microimmunofluorescence), but this modality is subjective and time-consuming. Protein microarray with using a SPR(surface plasmon resonance) sensor has recently been suggested as a method for detecting infection. For developing a protein chip to diagnose chlamydial infection, EBs(elementary bodies) were immobilized on a gold chip and the interaction between an antibody for Chlamydophila pneumoniae and the EBs(elementary bodies) immobilized on the surface of the gold chip was measured by using an SPR sensor. Methods; For the surface antigen, the EBs of Chlamydophila pneumoniae LKK1 were purified. Charged arrays were prepared by using PDDA(polydiallyldimethylammonium chloride) which has a positive charge. After immobilization of the chlamydial EBs on the PDDA surface, the investigation of the surface was done with using atomic force microscopy. After the antibody for C. pneumoniae was applied on chip, we monitored the SPR wavelength-shift to detect any antigen-antibody interaction with using a self-assembled SPR sensor. Results; The chlamydial EBs on the positively charged PDDA were visible on the surface with using atomic force microscopy. The SPR wavelength increased after interaction of antibody for C. pneumoniae with the EBs immobilized on charged gold surface. The wavelength-shift was correlated with the concentration of antigens. Conclusion; The surface immobilization of EBs on the gold surface with the charged arrays was identified and the antigen-antibody interaction on the gold chip was detected via the SPR sensor. Further investigations are needed to apply this technique to the clinical field.
Background; The diagnosis of chlamydial infection is based on serology. The current gold standard of diagnosis is MIF(microimmunofluorescence), but this modality is subjective and time-consuming. Protein microarray with using a SPR(surface plasmon resonance) sensor has recently been suggested as a method for detecting infection. For developing a protein chip to diagnose chlamydial infection, EBs(elementary bodies) were immobilized on a gold chip and the interaction between an antibody for Chlamydophila pneumoniae and the EBs(elementary bodies) immobilized on the surface of the gold chip was measured by using an SPR sensor. Methods; For the surface antigen, the EBs of Chlamydophila pneumoniae LKK1 were purified. Charged arrays were prepared by using PDDA(polydiallyldimethylammonium chloride) which has a positive charge. After immobilization of the chlamydial EBs on the PDDA surface, the investigation of the surface was done with using atomic force microscopy. After the antibody for C. pneumoniae was applied on chip, we monitored the SPR wavelength-shift to detect any antigen-antibody interaction with using a self-assembled SPR sensor. Results; The chlamydial EBs on the positively charged PDDA were visible on the surface with using atomic force microscopy. The SPR wavelength increased after interaction of antibody for C. pneumoniae with the EBs immobilized on charged gold surface. The wavelength-shift was correlated with the concentration of antigens. Conclusion; The surface immobilization of EBs on the gold surface with the charged arrays was identified and the antigen-antibody interaction on the gold chip was detected via the SPR sensor. Further investigations are needed to apply this technique to the clinical field.
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문제 정의
본 연구는 클라미디아 폐렴의 진단을 위해 단백질 칩 표면에 클라미디아 항원을 고정하고, 항체를 반응시켜 확인한 처음 시도라는 데에 의의가 있다. 앞으로 여러 가지 비정형 폐렴에 대한 항체를 고정하여 단백질 칩을 만들면 적은 양의 혈액으로 빠른 시간 내에 비정형폐렴에 대한 혈청학적 진단을 동시에 할 수 있을 것이다.
본 연구에서는 지금까지의 진단법으로는 한계가 있는 클라미디아 폐렴 진단의 새로운 시도를 위하여 단백질 칩의 개발을 위한 과정 중, gold 칩 표면 위에 클라미디아 폐렴균을 고정하고자 하였는데, 공유결합을 이용하여 단백질을 고정하기 위한 mixed thiol을 이용한 고전적 방법과 화학물질로 음전하 또는 양전하를 이용한 방법 등을 시도하였다. 대표적인 나노 이미징 영상 방법인 atomic force microscopy(AFM)로 고정한 후의 표면의 상태를 확인하고자 하였고, 항원을 고정한 칩 위에 클라미디아 폐렴균에 대한 항체를 반응시킨 후, 표면 위의 나노 수준의 높이 변화를 감지할 수 있도록 고안한 surface plasmon resonance (SPR) 센서를 이용해 항원항체 반응을 관찰하고자 하였다.
HEp 2 세포주에서 클라미디아 균주(LKK-1)가 배양이 되었음을 형광 현미경으로 확인하였다.
감염여부의 확인은 3일간 배양한 well에서 시행하였다. 배지를 흡인한 후, PBS로 세척하고 메탄올 1 mL 씩 15분간 고정한 후, C.
고정된 EB 표면은 AFM과 스캐닝 전자현미경(SEM, JEOL JSM-5410)으로 관찰하였다. AFM imaging영상은 Nanoscope IIIa(Digital Instruments, USA)의 접촉방식의 nanoprobe cantilever(spring constant 0.
글라스 슬라이드위에 50 Å Ti과 450 Å Au film(2x4)으로 금 칩을 준비하였고, NH4OH/H2O2/H2O(1:1:5, v/v)로 70℃에서 10분간 세정한 후, 여러 가지 조건으로 표면을 만들었다.
본 연구에서는 지금까지의 진단법으로는 한계가 있는 클라미디아 폐렴 진단의 새로운 시도를 위하여 단백질 칩의 개발을 위한 과정 중, gold 칩 표면 위에 클라미디아 폐렴균을 고정하고자 하였는데, 공유결합을 이용하여 단백질을 고정하기 위한 mixed thiol을 이용한 고전적 방법과 화학물질로 음전하 또는 양전하를 이용한 방법 등을 시도하였다. 대표적인 나노 이미징 영상 방법인 atomic force microscopy(AFM)로 고정한 후의 표면의 상태를 확인하고자 하였고, 항원을 고정한 칩 위에 클라미디아 폐렴균에 대한 항체를 반응시킨 후, 표면 위의 나노 수준의 높이 변화를 감지할 수 있도록 고안한 surface plasmon resonance (SPR) 센서를 이용해 항원항체 반응을 관찰하고자 하였다.
감염여부의 확인은 3일간 배양한 well에서 시행하였다. 배지를 흡인한 후, PBS로 세척하고 메탄올 1 mL 씩 15분간 고정한 후, C. pneumoniae에 대한 FITC-conjugated monoclonal antibody(Denka Seiken, Japan) 20㎕씩 올려놓고 커버글라스를 덮고 나서 37℃에서 45분간 반응시키고, PBS로 세척한 후, 형광현미경으로 관찰하였다.
. 본 연구에서는 PDDA를 이용하여 양전하를 표면에 만들어 항원을 고정하였다. 고전적인 방법으로는 mixed thiol에 NHS, EDC를 이용하여 carboxyl 기를 활성화시키고, 단백질의 아민기와 결합을 유도하나, EB 표면에서는 아민 결합을 이용한 고정이 거의 되지 않음을 확인하였다.
세포주와 reticulate body(RB)를 제거하고 순수한 elementary body(EB)를 항원으로 이용하기 위하여 EB의 분리 과정을 시행하였다. 먼저, 감염 세포액에 sonification을 30초간 2회 시행하였고, 2500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다.
20 W의 텅스텐 할로겐 램프(Oriel, USA)를 광원으로 이용하였고, transverse magnetic polarized light를 얻기 위해 polarizer를 설치하였다. 실리카 프리즘과 단백질 칩을 올려놓고 LabVIEW 소프트웨어를 이용하여 시스템을 움직이도록 하였다. 입사각은 48°로 유지하여 resonance wavelength를 얻을 수 있도록 조절하였고, 반사된 SPR spectrum은 광학 spectrometer(AVS-S2000, Avantes, Netherlands)로 감지하였다.
전하를 가진 표면을 만들기 위하여, 5 mM의 MUA에 16시간동안 보존하고, 에탄올로 세정한 후, 0.05 N NaOH 로 5분간 처리하고 양전하와 음전하를 띤 표면을 위해 각각 1 mg/mL polydiallyldimethylammonium chloride(PDDA)과 poly (sodium 4-styrenesulfonte)(PSS)로 처리하였고, 여기에 추출한 EB를 고정하였다.
클라미디아 폐렴에 대한 항체(100 mg/L, DAKO, UK)를 농도별로 반응시킨 후 파장 변화를 자체 개발한 파장 분석형 SPR 센서로 측정하였다(Fig. 1). 20 W의 텅스텐 할로겐 램프(Oriel, USA)를 광원으로 이용하였고, transverse magnetic polarized light를 얻기 위해 polarizer를 설치하였다.
항원을 준비하기 위하여, MEM 배양액으로 배양한 Hep-2 세포주에 국내 환자에서 분리한 클라미디아 폐렴균(LKK-1)13을 감염시켰다. 효과적인 감염을 위하여 균주를 세포주에 투여하고, 900 g에서 1시간 동안 실온에서 원침한 후, 35℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
을 감염시켰다. 효과적인 감염을 위하여 균주를 세포주에 투여하고, 900 g에서 1시간 동안 실온에서 원침한 후, 35℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
이외에도 역동적 상호작용을 실시간으로 확인할 수 있고, 광학 시스템이 비교적 단순하다는 점 등이 있으며, 단점은 민감도에 한계가 있다는 점 등이다25. 본 연구에서 SPR 센서에 이용한 방법은 파장 신호를 감지하는 방식을 이용했다. 이전까지의 SPR 센서는 고정된 파장으로 들어온 빛을 센서에서 각도 신호로 감지하여 단백질 상호작용을 분석하였다.
성능/효과
EB를 고정시킨 금 칩에 클라미디아 폐렴균에 대한 항체를 반응시킨 결과 항원-항체의 농도비에 비례하여 파장 변화가 30 nm까지 증가함을 확인하였다(Fig. 4)
고전적인 방법으로 단백질 결합을 유도한 표면위에서 AFM과 SEM으로 관찰한 결과 EB가 확인되지 않아 EB가 고정되지 않음을 알 수 있었다. FITC- conjugated 이차 항원을 반응시키고, 형광현미경으로 관찰한 경우에도 뚜렷한 증가를 확인할 수 없었다.
FITC- conjugated 이차 항원을 반응시키고, 형광현미경으로 관찰한 경우에도 뚜렷한 증가를 확인할 수 없었다. 다음 실험으로 클라미디아 폐렴균의 EB를 PDDA로 처리한 금 칩 표면위에서 AFM(Fig. 2)과 SEM(Fig. 3)으로 관찰하여 EB가 양전하를 이용하여 표면위에 고정 됨을 확인하였다. 음전하를 이용하여 반응시킨 표면에서는 EB가 관찰되지 않아 음전하로는 고정되지 않음을 알 수 있었다.
본 연구에서 전하를 이용하여 클라미디아 폐렴균의 EB를 gold chip 표면에 고정하여 AFM 영상으로 확인하였고, 제작된 칩을 항체와 반응시킨 후 SPR 센서로 항원-항체 반응이 농도에 비례하여 증가함을 SPR 센서로을 확인하였다.
클라미디아 균의 고정을 atomic force microscopy(AFM) 이미징영상으로 관찰하였는데, AFM은 이전의 광학현미경, 형광현미경, 레이저를 이용한 공초점현미경 등보다 해상도가 뛰어나 나노미터 수준의 이미징영상이 가능하고, 세균의 표면이나 분포도 분석할 수 있다는 장점이 있다.
후속연구
본 연구는 클라미디아 폐렴의 진단을 위해 단백질 칩 표면에 클라미디아 항원을 고정하고, 항체를 반응시켜 확인한 처음 시도라는 데에 의의가 있다. 앞으로 여러 가지 비정형 폐렴에 대한 항체를 고정하여 단백질 칩을 만들면 적은 양의 혈액으로 빠른 시간 내에 비정형폐렴에 대한 혈청학적 진단을 동시에 할 수 있을 것이다.
단백질 칩을 임상에 적용하기에는 해결해야 할 점들이 있는데, 특히, 혈청에는 SPR 센서로 측정하는 경우, 여러 가지 비특이적인 반응들을 일으키는 물질들이 있어 측정에 오차가 생기는 것으로 알려지고 있다. 향후의 연구에서 실제 임상 검체를 이용한 항원항체 반응의 감지를 이용하기 위해서는 혈청을 반응 전에 가열시키거나, 미리 blocking을 차단시키거나, 완충제로 희석 시키는 등 여러 가지 방법들이 이용되고 있고27, 단백질 칩을 이용한 비정형폐렴의 진단에 있어서도 앞으로 민감도와 특이도를 개선시키기 위하여 여러 가지 비특이적인 반응을 줄이는 방법들의 조합하여 시도하거나, 새로운 시도들이 있어야 할 것으로 사료된다.
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