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문제 정의
- 경희대 학교 골관절질환 한방연구센터 에서 퇴 행성 관절염 치료제 개발을위하여 연구를 진행한 결과, 개발 가능성을확인하였기에 한약물 단독 또는 분획물에 대한 연구 과정 및 결과를 기술하였다. 이 결과를 바탕으로 한약처 방을 구성하고, 조성물의 비율 및 새로운 한약재의 첨가에 기인한 효능을 세포실험 및 동물실험 연구가 마무리되고 있으며, 임상실험을 단계별로 수행하여 최종적으로는 퇴행성관절염 에 대 한 효능과 그 기 전을 밝히 고, 우수한 한약물 또는 신물질의 개 발을 목표로 하고 있다.
- 시험물질의 관절 연골세포 보호효과를 측정하기 위 해 관절의 구성성 분인 콜라겐의 분해정도를 알아보는 하기 와 같은 실 험 을 실 시 하였 다.
- -23). 연골분해에 있어 MMP 효소는 프로테오글라이 칸과 콜라젠 성분과 더불어 골관절염 진행을 변화 시 킬 만한 가능성 있는 약리 학적 치 료의 표적 이 되고 있다 3 叫 따라서 본 연구에서는 관절 연골조직의 구성 성 분인 프로테 오글라이 칸, collgen 분해 억제 능을 측정 하였고, 이 의 분해 효소인 matrix metalloproteinase (MMP)의 활성 을 저 하시 키는 것을 목표로 수십종의 한약재의 활성을 검색 하였고, 실험 결과 개발가능성이 있는 수종의 한약물을 선별하였기 에 결과를 발표하고자 한다.
- 평가하여 약 200여 종의 유효한 단미 재를 일차로 선정 후, 가장 가능성 있다고 판별되는 약재를 최종적으로 36 종선정 하여 프로테오글라이 칸, 콜라젠 분해 억제 및 MMPs(MMP-3, -13) 활성 억제를 통해 연골보호 효과를 확인한 수종의 단미재 및 분획을 선정하였다. 이 결과로 효능이 검증된 퇴행성관절염 치료제 개발을 위한 처방의 기초자료를 제시하는데 그 의의가 있다고 사료된다.
- 이 결과를 바탕으로 한약처 방을 구성하고, 조성물의 비율 및 새로운 한약재의 첨가에 기인한 효능을 세포실험 및 동물실험 연구가 마무리되고 있으며, 임상실험을 단계별로 수행하여 최종적으로는 퇴행성관절염 에 대 한 효능과 그 기 전을 밝히 고, 우수한 한약물 또는 신물질의 개 발을 목표로 하고 있다.
제안 방법
- MMP-13 에 specific한 활성억 제 측정 을 위 해 MMP-13에 의 해 specific하게 반응하는 pepiide인 (3-[2, 4-dinitro- phenyl]-L-2, 3-diaminopropionyl)-Pro-Tyr-Ala-Tyr- Trp-met- Arg-OH를 활성 화된 MMP-3와 반응시 킴. 각 MMPs의 활성 억제측정을 위해 각 MMPs에 대해 specific한 peptide를 사용하며 반응의 조건은 동일 하게 설 정 하고 colotimetric spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 약재는 민간요법, 중국, 일본 및 국내외 한의학고전 처방, 각종 임상 논문 및 보고서 등 관련 문헌 등을 통해 기 존의 상용 처 방과 단미제 를 탐색 . 분석 .
- 조직을 배지로 수차례 씻어 낸 다음 5% CO, 37°C 배양기 에서 1 일간 배 양하였다. 배 양된 관절을 기본 배지(열처 리로 비활성화된 1% FBS, 10 mM HEPES 및 페니실린-스트렙토마이신 100 unit/ml이 함유된 DMEM)로 교체 하였고, 30mg의 관절 조직 을 48-웰 플래 이 트에 옮겨 놓은 후, 시 험 물질을 처 리하였다. 인터루킨-la 5 ng/mL을 1시 간동안배 양하여, 관절의 손상 및 염증을 유발시키고, 수종의 약재를 농도별로 처 리 하여 3일간 더 배 양하였다.
- 본 실험에서 사용한 약재는 민간요법, 중국, 일본 및 국내외 한의학고전 처방, 각종 임상 논문 및 보고서 등 관련 문헌 등을 통해 기 존의 상용 처 방과 단미제 를 탐색 . 분석 .
- 잔사는 다시 50% 에 탄올로 추출하고 이 조작을 2회 반복하여 모은 여액을 감압농축기르 감압농축한 후, 이를 동결 건조하여 약재 에탄올 추출물을 얻어 본 실험에 필요로 하는 농도로 희석 하여 사용하였다. 분획은 알코올 추출액 을 유기 용머 인 butanol과 residue 층인 물층으로 분획 하여 동결건 조하였다.
- 사람으로부터 연골조직을 분리 후, rhIL-la과 함께 단미 재 10종 및 그의 분획 20종을 20, 200, 400 ug/ml의 농도별로 처 리 하여 배 양후 배 양액 에 서 MMP-3, -13 효소활성 억제능을 정 량하였다. MMP-3 효소활성 억제능 실험결고卜, 양성대조군에 비해 우수한 약재 12종 (KHBJ004T, 004B, 018T, 018B, 028T, 028B, 029T, 029B, 030T, 030B, 050T, 050B)을 선정 하였다.
- 상세히 설명 하면, 멸균상태에서 사람 및 토끼의 관절 표면을 드러 낸 후, 작은 조각으로 만들어 배지(열 처 리 로 비 활성 화된 5% FBS와 페니 실 린-스트렙 토마이신 100unit/ml。] 함유된 DMEM 배지)에 담가 놓았다(Fig. 1). 조직을 배지로 수차례 씻어 낸 다음 5% CO, 37°C 배양기 에서 1 일간 배 양하였다.
- 선 정 된 유 효 단 미 재 ⑴를 butanol층 (B)과 residual(R)로 분획하여 사람의 연골조직을 분리 후, rhIL-la과 함께 10종의 단미 재 및 그의 분획 20종을 20, 200, 400ug/ml의 농도별로 처 리하여 배 양하였다. 72시 간 반응 후 proteoglycan 분해 억 제 능을 정 량한결과 활성 이 우수한 13종을 선정하였다 (KHBJ 004T, 004B, 018T, 018B, 024T, 024B, 028B, 029B, 030B, 032T, 032B, 050T, 050B).
- 침투시킨 후 블록을 제조하였다. 세포의 형태 를 관찰하기 위 하여 H&E 염 색 하였고, pmte이yean 의 합성정도를 확인하기 위하여 특수염색으로 Safranin O 염색, collagen 합성정도를 확인하기 위하여 Masson-trichrome 염색을 실시 후 현미경으로 관찰하였다.
- 시험물질의 토끼 및 사람의 관절 연골조직에서 보호 효과를 측정하기 위해 프로테오글리 칸을 구성하는 GAG의 분해정도를 알아보는 하기 와 같은 실험을 실시하였다.
- 앞으로 선정된 단미재들을 군약으로하는 복합처방 및 혼합시 료 조성 물을 구성 하고 효능을 분리 추출하여 퇴행성 관절염 한방신약의 후보로 선정하고, 동물실험 모델을 이 용한 한약제의 치 료 효과 기전 규명, 임상시험 프로토콜 작성 및 생체 내 작용기전 연 구하여 한방신 약을 개 발하고자 한다.
- 연 골을 10% formalin 고정 액 에 고정 후 70% alcohol, 80% alcohol, 90% alcohol, 95% alcohol, 100% alcohol의 탈수과정 및 xylene을 거 친 후 파라핀을 조직 내에 침투시킨 후 블록을 제조하였다. 세포의 형태 를 관찰하기 위 하여 H&E 염 색 하였고, pmte이yean 의 합성정도를 확인하기 위하여 특수염색으로 Safranin O 염색, collagen 합성정도를 확인하기 위하여 Masson-trichrome 염색을 실시 후 현미경으로 관찰하였다.
- 염색된 조직표본은 시료에 대한 사전 정보가 전혀 없는 병리학자가 염색된 슬己-이드를 판독하였으며, 200배 율의 렌즈로 측정 후 사 진촬영 하였다(Fig 3).
- 음이온성(polyanionic)물질의 양에 의해 측정하였으며 , 표준물질로는 황산콘드로이틴 (chondroitin sulfate)을 사용하였고, 540 nm에서 분광학적 GAG량을 측정하였고, 인터루킨 la로 유도된 GAG 분해 량을 기 준으로 억 제 율을 계 산하여 나타내었다.
- 배 양된 관절을 기본 배지(열처 리로 비활성화된 1% FBS, 10 mM HEPES 및 페니실린-스트렙토마이신 100 unit/ml이 함유된 DMEM)로 교체 하였고, 30mg의 관절 조직 을 48-웰 플래 이 트에 옮겨 놓은 후, 시 험 물질을 처 리하였다. 인터루킨-la 5 ng/mL을 1시 간동안배 양하여, 관절의 손상 및 염증을 유발시키고, 수종의 약재를 농도별로 처 리 하여 3일간 더 배 양하였다. 상등액을 수거한 후, 약재가 함유된 신선한 배지를 넣어준 후 18일간 더 배양하였다.
- 퇴행성관절염치료제 개발을 위해 민간요법, 중국, 일본 및 국내외 한의학 고전 처방, 각종 임상 논문 및 보고서 등 관련 문헌 등을 통해 기 존의 상용 처 방과 단 미제를 탐색 . 분석 .
- 분석 . 평가하여 약 200여 종의 유효한 단미 재를 일차로 선정 후, 가장 가능성 있다고 판별되는 약재를 최종적으로 36 종선정 하여 프로테오글라이 칸, 콜라젠 분해 억제 및 MMPs(MMP-3, -13) 활성 억제를 통해 연골보호 효과를 확인한 수종의 단미재 및 분획을 선정하였다. 이 결과로 효능이 검증된 퇴행성관절염 치료제 개발을 위한 처방의 기초자료를 제시하는데 그 의의가 있다고 사료된다.
- 현재 관절염 치 료제의 주요 목표로 알려 진바와 같이 본 연구팀에서도 MMPs의 작용기전에 대하여도 실험하였다. 연구결과, 프로테오글라이칸 및 콜라젠 분해억제에 효과를 보인 단미재 및 분획층의 약재들이 연골보호 효과가 MMP-3 및 MMP-13의 유의한 활성억제를 통해 연골보호효과가 있는 것으로 사료된다.
대상 데이터
- 양하였다. 72시 간 반응 후 proteoglycan 분해 억 제 능을 정 량한결과 활성 이 우수한 13종을 선정하였다 (KHBJ 004T, 004B, 018T, 018B, 024T, 024B, 028B, 029B, 030B, 032T, 032B, 050T, 050B). 특히 , total층에 비 해 butanol 분획층에서 유효하게 활성 이 증가한 분획은 4종(004B, 028B, 029B, 030B)이었고, 토끼의 연골조직 에 서 는 proteoglycan 분해 억 제 효과가 있었으나 사람의 연 골조직 에 서 효과가 없는 단미 재 2종(031, 052)을 확인 하였 다 (Table.
- MMP-3 효소활성 억제능 실험결고卜, 양성대조군에 비해 우수한 약재 12종 (KHBJ004T, 004B, 018T, 018B, 028T, 028B, 029T, 029B, 030T, 030B, 050T, 050B)을 선정 하였다. MMP-13 효소활성 억제능 실험결과, 양성대조군에 비 해 우수한 약재 13종 (KHBJ 004T, 004B, 018T, 018B, 024T, 024R, 02 ST, 028B, 029T, 030B, 032B, 050T, 050B)을 선 정 하잇、다 (Table. 3).
- MMP-3 효소활성 억제능 실험결고卜, 양성대조군에 비해 우수한 약재 12종 (KHBJ004T, 004B, 018T, 018B, 028T, 028B, 029T, 029B, 030T, 030B, 050T, 050B)을 선정 하였다. MMP-13 효소활성 억제능 실험결과, 양성대조군에 비 해 우수한 약재 13종 (KHBJ 004T, 004B, 018T, 018B, 024T, 024R, 02 ST, 028B, 029T, 030B, 032B, 050T, 050B)을 선 정 하잇、다 (Table.
- 경희대학교 한의과대학 부속 한방병원에 의뢰하여 구입하여 감정한 다음 정 선하여 사용하였다. 각각의 한약재를 1cm 이 하로 분쇄 한 후, 시 료 200g을 3L 플라스크에 넣은 후 50%에탄올 1, 500ml을 가하여 3시간 동안 환류 추출하고 여과하였다.
- 배양액의 글리 코스아미노글리 칸 (GAG) 와 collagen의 정 량을 위 흐H Blycan (biodye science, UK)에서 구입 하였고, MMP (Mairix metalloproteinase) ELISA kit, recombinant human IL-1 a 는 R&D system사. 에 서 구입 하였다.
- 본 실험 에 사용한 단미 재는 36종이며, 약재들은 경희대학교 한의괴대학 부속 한방병원에서 구입하였고, 감정 한 다음 정 선하여 사용하였다.
- 사람의 관절연골은 인관관절 수술을 받는 환자의 정 상femoral chondyle연골 부위 를 이 용하였고(경 희의 료원 수술실), 토끼 는 1.5kg의 5주령 된 토끼 (Samtako Biokorea Co., 대 한민국)의 관절에서 채취하였다.
- 실험에 사용한 DMEM 배지, 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 항생제 및 trypsin등의 세포배 양성 분은 GIBCO BRL사(Grand Island, NY, USA) 에서구입하였으며, 배 양용기(48 well plate)는 Falcon 사 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에서 구입 하여 사용하였다.
- 토끼 의 연골조직 으로 연골배 양을 실시 후 단미 재약제 36종에 대하여 proteo이yean 분해 억제능을 정량하여 토끼 연골조직에 유효한 활성을 보이는 단미 재를 10종(KHBJ 004, 018, 024, 028, 029 030, 031, 032, 050, 052)을 선정 하였다(Tablel).
- 분석 . 평 가하여 약 200여 종의 유효한 단미 재 를 일차로 선정 후, 가장 가능성 있다고 판별되는 약재를 최종적으로 36종 선정 하여 사용하였다.
- 분석 . 평가하여 약 200여종의 유효한 단미재를 일차로 선정 한 후 연골보호 중심으로 최종36종을 선별하여 연구를 진행하였다.
성능/효과
- 또한 collagen 분해억제능 실험결과, 가장 우수한 활성 을 보였던 단미 재가 프로테오글라이 칸 분해 억제 능에 효과가 가장 좋았던 단미 재 2종 (024, 050) 과일치하였고, 분획에 의해서도 효능이유의하게 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 2). 이 연구결과로 2종의 단미 재가 프로테오글라이 칸 및 콜라젠 분해를 모두억제시키는 것을 확인하여 앞으로의 처 방구성에 군 약으로 사용될수 있음을 제시하였다.
- 3). 또한, KHBJ004는 인터루킨-la로 유도된 연골조직의 cartilage layer, erosin정 도와 chondrocyte 숫자 등이 다시 회복함을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 사람으로부터 연골조직 을 분리 후, rhlLla과 함께 10종의 단미 재 및 그의 분획 20종에 대하여 20, 200,400 ug/ml의 농도별 로 처 리 후, 21 일 간 배 양하여 collagen 분해 억제 능을 정 량한 결과, 7종 (KHBJ 024, 024B, 024R, 032B, 050, 050B, 050R)을 선정 하였고, total층에 비해 분획층에서 유효하게 활성이 증가한 분 획 은 3종(024B, 024R, 032B)으로 확인되 며 가장 우수한 collagen 분해 억 제 능을 보인 6종(KHBJ 024T, 024B, 024R, 050T, 050B, 050R)을 선 정 하였다 (Fig. 3).
- 연구결과, 연골보호의 경우, 토끼의 연골조직에서 proteoglycan의 분해 억 제 능에 가장 우수한 활성 을보였던 단미 재는 12종이 었으나, 사람 연골조직 에서 2종의 단미재에 대해서는 효능이 관찰되지 않았으며 , proteoglycan의 분해 억 제 능이 양성 대 조군인 SKU 에 비 하여 효능이 가장 우수한 활성 을 보였던 단미재 는 total층에 서 2종(024, 050)이 며 , butanol 분획 에의 해 활성 이 증가된 단미 재 는 4종(004B, 024B, 029B, 030B)이 었고, 그 증가율은 약 20-30%로 유의 한 증가율을 보였다(Table 1, 2). 일반적 으로 한약물의 활성증가를 위해 분획, 재분획 및 유효단일물질 분리 등이 시도되고 있으나, 본 실험에 사용한 한약물 의경 우, 프로테 오글라이 칸 분해 억 제 는 total층의 활성이 butanol분획 층과 비 슷한 활성 을 보여 퇴 행성 관절염 치 료제 개 발을 위 한 처 방은 한방개념 이 도입 된복합처 방 및 분획 으로 활성 을 증진시킬 수 있는 다양한 처 방을 조합하여 연구할 수 있을 것으로 사료된다.
- 연구결과, 프로테오글라이칸 및 콜라젠 분해억제에 효과를 보인 단미재 및 분획층의 약재들이 연골보호 효과가 MMP-3 및 MMP-13의 유의한 활성억제를 통해 연골보호효과가 있는 것으로 사료된다. 이에 본 연구팀에서 선정한 단미재 및 분획들이 MMPs 활성 을 억제 시 킴으로써 항염 활성을 갖음을 시사하였고, 이 를 통해 손상된 연골조직 의보호 및 회복 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 2). 이 연구결과로 2종의 단미 재가 프로테오글라이 칸 및 콜라젠 분해를 모두억제시키는 것을 확인하여 앞으로의 처 방구성에 군 약으로 사용될수 있음을 제시하였다.
- 연구결과, 프로테오글라이칸 및 콜라젠 분해억제에 효과를 보인 단미재 및 분획층의 약재들이 연골보호 효과가 MMP-3 및 MMP-13의 유의한 활성억제를 통해 연골보호효과가 있는 것으로 사료된다. 이에 본 연구팀에서 선정한 단미재 및 분획들이 MMPs 활성 을 억제 시 킴으로써 항염 활성을 갖음을 시사하였고, 이 를 통해 손상된 연골조직 의보호 및 회복 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 72시 간 반응 후 proteoglycan 분해 억 제 능을 정 량한결과 활성 이 우수한 13종을 선정하였다 (KHBJ 004T, 004B, 018T, 018B, 024T, 024B, 028B, 029B, 030B, 032T, 032B, 050T, 050B). 특히 , total층에 비 해 butanol 분획층에서 유효하게 활성 이 증가한 분획은 4종(004B, 028B, 029B, 030B)이었고, 토끼의 연골조직 에 서 는 proteoglycan 분해 억 제 효과가 있었으나 사람의 연 골조직 에 서 효과가 없는 단미 재 2종(031, 052)을 확인 하였 다 (Table. 2).
- 그러 나 유효활성 이 검 증되 었던 단미재 및 분획에서는 발색정도가 진하게 염색되었다. 특히 KHBJ004는 인터루킨-la로 유도된 연골조직 의 손실을 회복시켜 진하게 염색됨을 확인하였다 (Fig. 3). 또한, KHBJ004는 인터루킨-la로 유도된 연골조직의 cartilage layer, erosin정 도와 chondrocyte 숫자 등이 다시 회복함을 확인할 수 있었다(Fig.
- 프로테오글라이 칸을 염 색 (Safranin-O)과, 콜라젠 염색(Masson-trichrome)한 결과, 사람 연골조직에서는 무처 리 군에 비하여 인터루킨-la로 유도된 연골조직은 프로테로글리 칸 및 콜라젠의 손실이 유도되어 염색후 발색정도가 흐렸고, 연골세포수가 줄어들었다. 그러 나 유효활성 이 검 증되 었던 단미재 및 분획에서는 발색정도가 진하게 염색되었다.
후속연구
- 보였다(Table 1, 2). 일반적 으로 한약물의 활성증가를 위해 분획, 재분획 및 유효단일물질 분리 등이 시도되고 있으나, 본 실험에 사용한 한약물 의경 우, 프로테 오글라이 칸 분해 억 제 는 total층의 활성이 butanol분획 층과 비 슷한 활성 을 보여 퇴 행성 관절염 치 료제 개 발을 위 한 처 방은 한방개념 이 도입 된복합처 방 및 분획 으로 활성 을 증진시킬 수 있는 다양한 처 방을 조합하여 연구할 수 있을 것으로 사료된다.
- 제품화로 부가가치 창출 및 인류 보건 향상에 기여할 수 있을것으로 사료된다.
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