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문제 정의
- 본 연구에서는 임상적으로 당뇨병 치료에 자주 사용되고 있는 경혈 중 척중혈(GV6)과 태백혈(SP3)을 실험적으로 유발된 당뇨흰쥐에 자극하여 체중, 혈당량 변화, 당내성변화, 간효소치 활성도, 지질대사에 미치는 영향을 관찰하였다. 또한 간세포에서 IGF-ⅠmRNA 유전자 발현변화와 조직학적 관찰 및 전자현미경을 통해 간세포재생에 관해 관찰하였다.
- 이에 저자는 임상에서 당뇨병 치료에 많이 활용하고 있는 태백혈과 척중혈에 대한 자극이 당뇨 치료 효능과 간 기능 보호 효과에 관여함을 관찰한 바 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1 회용 호침 (0.25 × 40 mm, steinless steel, 동방침구제작소)을 사용하여 1일 1회 인체의 척중혈 (GV6)과 태백혈(SP3)에 상응하는 부위에 일주일에 2회 6주간 시술하였다. 정확한 시술부위는 실험동물의 체적이 여타 동물에 비해 작아 척중혈(GV6)은 제11흉추하에서, 태백혈 (SP3)은 제1중족골의 원위부 하연부로 정하였다.
- Korea)와 물을 충분히 자유급식하면서 실험실 환경 (실내온도 25±1℃, 습도 55±5%, 12시간 dark/light)에 1 주일간 적응시킨 후 사용하였다. 12시간 동안 절식시킨 다음 Streptozotocin (이하 STZ, Sigma, ST. Louis, MO., USA)을 10 mM citrate buffer에 녹여 pH를 4.5에 맞추 었고, 50㎎/㎏을 24시간 간격으로 2회 투여한 다음 3일 후에 100㎎/㎏을 복강 투여하여 고혈당 흰쥐 모델을 구축하였다.
- Hematoxylin과 Eosin으로 이중염색을 한 다음 탈수를 하였다. Canada balsam으로 봉합한 후 카메라 부착 광학현미경 (Olympus BX51, Japan)으로 관찰한후 사진을 촬영하였다.
- 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시킨 다음 이를 xylene으로 paraffin을 제거한 다음 100, 90, 80% ethanol과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게하였다. Hematoxylin과 Eosin으로 이중염색을 한 다음 탈수를 하였다. Canada balsam으로 봉합한 후 카메라 부착 광학현미경 (Olympus BX51, Japan)으로 관찰한후 사진을 촬영하였다.
- STZ 유발 당뇨병 흰쥐의 혈청을 분석하여 혈청 Cholesterol, HDL-cholesterol, Triglyceride, Free fatty acid의 함량을 알아보았다(Table 1). 혈청 cholesterole 정상군과 대조군의 차이가 뚜렷하지 않았으며, SP3+GV6군에서 67±2.
- STZ를 투여하여 고혈당을 유발시킨 흰쥐에서 GV6과 SP3의 침 시술이 간장에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈액학적 검사를 통해 GOT와 GPT의 수치를 조사해 보았다 (Table 2). GOT는 정상군에 비하여 대조 군에서 270±41 U/L로 증가되었으나, SP3군은 227±54 U/L, GV6는 153±24 U/L, SP3+GV6은 204±14 U/L로 GV6군으로 정상군과 유사한 수치까지 감소하였다.
- STZ를 투여하여 췌장의 Langerhans islet을 파괴한 흰쥐에 GV6와 SP3을 6주 동안 자극한 다음 β-세포의 재생 또는 기능의 회복 정도를 밝히기 위하여 당내성 검사를 시행하였다. 포도당(1.
- STZ를 투여한 다음 흰쥐의 혈당량이 약 113mg/dL인 것을 대조군과 실험군으로 구분하였다. 대조군의 혈당량은 유발 후 급격히 증가하여 3주에 가장 높은 수치를 나타내었고, 6주까지 실험군에 비하여 높은 혈당을 유지하였다.
- After an overnight fast, glucose was injected intraperitoneally at a dose of 1 g/kg, and blood glucose level was measured. The groups were divided untreated, acupuncture with SP3, acupuncture with GV6, acupuncture with SP3 plus GV6 supplementation. Data are mean ± SEM, where n=7 from two independently performed experiments.
- 혈장성분은 별도로 준비한 깨끗한 용기에 분리 보관하였다. Total cholesterole 혈장에서 Boehringer Mannheim Cholesterol/HP system pack (Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems, Indianapolis, IN)과 Boehringer Mannheim Hitachi 911 Analyzer를 이용하여 측청하였다. HDL-cholesterole 혈장에서 phosphotungstic acid/magnesium chloride 침전법으로 침전된 LDL-cholesterol과 VLDL-cholesterol로부터 얻었으며, HDL-Cholesterol system pack (Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems)의 방법을 따랐다.
- HDL-cholesterole 혈장에서 phosphotungstic acid/magnesium chloride 침전법으로 침전된 LDL-cholesterol과 VLDL-cholesterol로부터 얻었으며, HDL-Cholesterol system pack (Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems)의 방법을 따랐다. Triglyceride와 fatty acid는 200μL의 혈장성분을 500μL의 침전시약과 혼합한 뒤, 배양실에서 10~30분간 배양한 뒤 원심분리여 Boehringer Mannheim triglyceride, free fatty acid kit(Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems, Indianapolis, IN)로 조사하였다.
- 각 군의 체중은 침 시술 후 매주 6주간 측정하였다.
- 혈당은 12시간 동안 절식 후 실험 동물의 꼬리부분에서 정맥혈을 채집하여 Glucometer (LIFESCAN,USA)로 측정하였고, 6주 동안 매주 1회에 걸쳐 측정하였다. 당 내성은 12시간 절식 후 glucose (1.0 g/kg body weight)를 복강내 주사하고 30, 60, 90, 120분에 각각 혈액을 채집하여 측정하였다. 혈당 농도는 당산화 기법에 따라 당분석기(MS-GR101; Terumo, Tokyo)로 측정하였다.
- 본 연구에서는 임상적으로 당뇨병 치료에 자주 사용되고 있는 경혈 중 척중혈(GV6)과 태백혈(SP3)을 실험적으로 유발된 당뇨흰쥐에 자극하여 체중, 혈당량 변화, 당내성변화, 간효소치 활성도, 지질대사에 미치는 영향을 관찰하였다. 또한 간세포에서 IGF-ⅠmRNA 유전자 발현변화와 조직학적 관찰 및 전자현미경을 통해 간세포재생에 관해 관찰하였다.
- 실험군은 당뇨병을 유도한 대조군, 당뇨병 유도 후 척중혈(GV6)만을 자극한 군, 당뇨병 유도 후 태백혈(SP3)만을 자극한 군, 당뇨병 유도 후 척중혈(GV6)과 태백혈(SP3)을 동시에 자극한 군으로 나누였으며, 각 군에 7마리씩 배정하였다.
- 심장 천자하여 채혈한 후 혈청을 분리한 다음 glUtamic-oxaloacetic transaminase(GOT)와 glutamic-pyruvic transaminase(GPT) 효소활성도 측정용 kit 시약(Elitech, France)을 사용하여 340 nm에서 photometer (photometer 5010, Germany)로 측정하였다.
- 포매된 직들을 LKB-V형 ultramicrotome을 사용 1 μm 두께로 절편을 제작하여 1 % toluidine blue로 hot plate (60℃)상에서 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경으로 관찰하여 조직을 확인한 다음 동일한 부위에서 60 nm 두께로 초박절편을 제작하여 silver grid에 부착하였고, uranyle acetate와 lead citrate로 이 중 염색한 다음 Hitachi H-7600 투과형 전자현미경 (80kV)으로 관찰하였다.
- 포매된 조직은 microtome을 사용하여 5 μm 두께로 절편하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시킨 다음 이를 xylene으로 paraffin을 제거한 다음 100, 90, 80% ethanol과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게하였다. Hematoxylin과 Eosin으로 이중염색을 한 다음 탈수를 하였다.
- 정상 흰쥐의 간에서 발현되는 IGF-ⅠmRNA 발현이 당뇨유발 후 침자에 의해 조절되는지 보고자 역전사 중합효소연쇄 반응을 실시하였다. STZ 당뇨유발군인 대조군은 정상군에 비해 60% 정도 감소되었으며 SP3 군과 GV6군은 50% 정도 감소된 양상으로 발현이 증 가되었고, SP3+GV6군은 정상군과 동일한 수준까지 유의하게 IGF-ⅠmRNA 발현이 증가되었다 (P<0.
- 25 × 40 mm, steinless steel, 동방침구제작소)을 사용하여 1일 1회 인체의 척중혈 (GV6)과 태백혈(SP3)에 상응하는 부위에 일주일에 2회 6주간 시술하였다. 정확한 시술부위는 실험동물의 체적이 여타 동물에 비해 작아 척중혈(GV6)은 제11흉추하에서, 태백혈 (SP3)은 제1중족골의 원위부 하연부로 정하였다. 침 시술은 흰쥐의 피부로부터 10mm 직경 내외의 깊이로 자입하여 3분간 유침하였다(Fig.
- 정확한 시술부위는 실험동물의 체적이 여타 동물에 비해 작아 척중혈(GV6)은 제11흉추하에서, 태백혈 (SP3)은 제1중족골의 원위부 하연부로 정하였다. 침 시술은 흰쥐의 피부로부터 10mm 직경 내외의 깊이로 자입하여 3분간 유침하였다(Fig. 1).
- STZ를 투여하여 췌장의 Langerhans islet을 파괴한 흰쥐에 GV6와 SP3을 6주 동안 자극한 다음 β-세포의 재생 또는 기능의 회복 정도를 밝히기 위하여 당내성 검사를 시행하였다. 포도당(1.0 g/kg body weight)을 흰 쥐에 복강주사 한 후 30, 60, 90, 120분에서 대조군과 각 실험군의 당내성 정도를 검사한 결과 다음과 같았다(Fig. 4). 대조군에서는 투여 90분 후에 혈당이 550 ±21.
- 혈당은 12시간 동안 절식 후 실험 동물의 꼬리부분에서 정맥혈을 채집하여 Glucometer (LIFESCAN,USA)로 측정하였고, 6주 동안 매주 1회에 걸쳐 측정하였다. 당 내성은 12시간 절식 후 glucose (1.
- 흰쥐 간조직을 파쇄하고 TRI-zol (Sigma, USA)를 이용하여 RNA를 추출한 뒤, 75 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 각각 0.6 mM 의 dATP, dTTP, dGTP, dCTP mixture, 10U of RNase inhibitor (Promega Corp, Madison, WI), 100 pmol random hexmer, 600 U의 M-MLV reverse transcriptase (Life Technologies, Inc., Berlin, Germany)과 3 μg of RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하고 94℃에서 30 sec, 65℃에서 30sec, 72℃에서 60 sec, 72℃에서 5min 30 cycles로 역전사중합효소반응을 시켰다. 인슐린성장인자 oligo-nucleotide primer는 Bionia (Daechun, Korea)에서 구입하였으며 Sequences는 IGF-Ⅰ (5'- CACAGGGTATGGCTC-3', antisense: 5'-CTTCTGG- GTCTTGGG-3') 이다.
- Korea)를 사용하였다. 흰쥐를 항온항습 및 주야조절(주간 14시간, 야간 10시간)이 가능한 사육장에서 고형사료 (Samyang Co. Korea)와 물을 충분히 자유급식하면서 실험실 환경 (실내온도 25±1℃, 습도 55±5%, 12시간 dark/light)에 1 주일간 적응시킨 후 사용하였다. 12시간 동안 절식시킨 다음 Streptozotocin (이하 STZ, Sigma, ST.
- 흰쥐의 간 조직을 적출한 다음 10%의 포르말린을 사용하여 2각시간 동안 고정시킨 다음, 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100 Ⅰ, 100 Ⅱ와 같이 알코올 농도를 상승시켜 탈수를 한 다음 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 paraffin으로 포매 하였다. 포매된 조직은 microtome을 사용하여 5 μm 두께로 절편하였다.
대상 데이터
- 동물은 체중 200±5g 내외의 Sprague-Dawley계 암컷 흰쥐 (Daehan Lab. Korea)를 사용하였다. 흰쥐를 항온항습 및 주야조절(주간 14시간, 야간 10시간)이 가능한 사육장에서 고형사료 (Samyang Co.
- , Berlin, Germany)과 3 μg of RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하고 94℃에서 30 sec, 65℃에서 30sec, 72℃에서 60 sec, 72℃에서 5min 30 cycles로 역전사중합효소반응을 시켰다. 인슐린성장인자 oligo-nucleotide primer는 Bionia (Daechun, Korea)에서 구입하였으며 Sequences는 IGF-Ⅰ (5'- CACAGGGTATGGCTC-3', antisense: 5'-CTTCTGG- GTCTTGGG-3') 이다. Internal control로서 GAPDH의 Sequences는 5'-TGCATCCTGCACCACCAACT-3', 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3') 이며 562-bp fragment의 product를 얻었다.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준오차 (mean±S.E.)로 나타내었으며, 각 실험군들 사이의 통계적 유의성 검정을 위하여 one-way ANOVA를 실시한 뒤 P-value값이 0.05 미만인 경우에만 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- Total cholesterole 혈장에서 Boehringer Mannheim Cholesterol/HP system pack (Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems, Indianapolis, IN)과 Boehringer Mannheim Hitachi 911 Analyzer를 이용하여 측청하였다. HDL-cholesterole 혈장에서 phosphotungstic acid/magnesium chloride 침전법으로 침전된 LDL-cholesterol과 VLDL-cholesterol로부터 얻었으며, HDL-Cholesterol system pack (Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems)의 방법을 따랐다. Triglyceride와 fatty acid는 200μL의 혈장성분을 500μL의 침전시약과 혼합한 뒤, 배양실에서 10~30분간 배양한 뒤 원심분리여 Boehringer Mannheim triglyceride, free fatty acid kit(Boehringer Mannheim Diagnostic laboratory Systems, Indianapolis, IN)로 조사하였다.
- 0 g/kg body weight)를 복강내 주사하고 30, 60, 90, 120분에 각각 혈액을 채집하여 측정하였다. 혈당 농도는 당산화 기법에 따라 당분석기(MS-GR101; Terumo, Tokyo)로 측정하였다.
성능/효과
- 고혈당 유발 후 6주 동안 혈당의 변화를 측정한 결과 대조군에 비하여 침시술한 실험군 모두에서 대조군에 비하여 보다 효과적으로 조절되고 있음을 확인할 수 있었다. 6주 후 당내성 검사 결과 GV6군의 혈당이 전 시간에 걸쳐 대조군에 비해 유의하게 낮은것으로 나타났으며, SP3군과 SP3+GV6군도 120분후에는 대조군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이와 같이 침 시술이 β-세포의 재생 또는 기능의 회복에 긍정적 인 영향을 미치며, 특히 GV6가 가장 효 과적임을 알 수 있었다.
- 7mg/dL로 높은 혈당치를 나타냈다. SP3군은 투여 60분 후에 530±7.9 mg/dL로 가장 높았고 120 분후에 482±18.0 mg/dL로 유의하게 감소하였고 GV6군은 전 시간에 걸쳐 측정한 혈당치가 유의하게 낮았다. SP3+GV6군은 투여 60분 후에 518±16.
- 5A). SP3군의 간 조직에서 중심정맥은 타원형으로 뚜렷이 관찰되었으며, 중심정맥의 상피세포의 형태 또한 또렷이 관찰되었다. 동모양혈관들은 중심정맥을 축으로 방사형으로 뚜렷이 나타났다.
- 정상 흰쥐의 간에서 발현되는 IGF-ⅠmRNA 발현이 당뇨유발 후 침자에 의해 조절되는지 보고자 역전사 중합효소연쇄 반응을 실시하였다. STZ 당뇨유발군인 대조군은 정상군에 비해 60% 정도 감소되었으며 SP3 군과 GV6군은 50% 정도 감소된 양상으로 발현이 증 가되었고, SP3+GV6군은 정상군과 동일한 수준까지 유의하게 IGF-ⅠmRNA 발현이 증가되었다 (P<0.05)(Fig. 6).
- 간세포는 대부분 하나의 핵을 갖고 있었는데 드물게 2개의 핵을 갖는 세포들도 있었다. 간세포의 핵들은 정상적인 소견을 보여 주었으며, 세포질 또한 eosin에 강한 염색성을 보여주는 정상적인 간세포의 소견을 나타냈다(Fig. 5B). GV6군의 간조직은 중심정맥이 원형으로 관찰되었으며 상피세포가 뚜렷이 관찰되었다.
- 이는 혈당 추이를 고려할 때 혈당의 상승으로 인한 체중의 감소가 아닌 대사의 항진으로 인한 체중의 감소로 사료되었다. 고혈당 유발 후 6주 동안 혈당의 변화를 측정한 결과 대조군에 비하여 침시술한 실험군 모두에서 대조군에 비하여 보다 효과적으로 조절되고 있음을 확인할 수 있었다. 6주 후 당내성 검사 결과 GV6군의 혈당이 전 시간에 걸쳐 대조군에 비해 유의하게 낮은것으로 나타났으며, SP3군과 SP3+GV6군도 120분후에는 대조군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났다.
- STZ를 투여한 다음 흰쥐의 혈당량이 약 113mg/dL인 것을 대조군과 실험군으로 구분하였다. 대조군의 혈당량은 유발 후 급격히 증가하여 3주에 가장 높은 수치를 나타내었고, 6주까지 실험군에 비하여 높은 혈당을 유지하였다. SP3군은 당뇨병 유발 후 혈당이 193±28.
- , 2006)이 활성수치가 높다는 것은 간의 급성염증을 시사하며, 두 효소의 활성변화는 간세포 손상정도와 기능을 나타내는 지표로 활용된다. 본 실험 결과에서 대조군의 GOT 수치가 유의성 있게 증가되어 선행연구 결과와 일치하는 경향을 보였으며, 침 시술을 시행할 경우 GOT와 GPT 수치가 대조군에 비해 감소되었다. 특히, GOT는 GV6군에서 더욱 정상에 가깝게 감소되었고, GPT는 SP3+GV6군은 정상수치와 같은 수준으로 감소되었다.
- , 1985). 본 실험에서 cholesterole 모든 실험군에서 대조군에 비해 감소하였으며, 특히 SP3+GV6군의 경우 유의하게 감소된 것으로 나타났으며, HDL-cholesterol, triglyceride 및 free fatty acid도 모든 실험군에서 정상군 및 대조군에 비해 감소하여 STZ 유발 당뇨 흰쥐에 대한 침 시술이 혈중 지질 증가억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 단, HDL- cholesterol과 triglyceridee 대조군의 수치가 동일한식이 조건을 적용하였음에도 정상군에 비해 오히려 감소되어 기존 연구 결과와 달랐는데, 이에 대해서는 실험 대상이 흰쥐이며 체중, 식이 조건의 적용과 관련된 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 최근 Park (2006)에 의하면 STZ에 의해 유도된 당뇨 흰쥐의 간에서 IGF-Ⅰ의 합 성이 감소됨을 보고한 바 있다. 본 연구에서 IGF-Ⅰ mRNA 유전자는 정상군 간조직과 비교시 대조군에서 60% 이상 발현이 감소되었고 침 시술 후 발현이 증가되었으며, SP3+GV6군의 경우 정상군과 동일한 수준까지 유의하게 증가하여 (P< 0.05) STZ 유발 당뇨모델에 있어서 침 시술이 IGF-Ⅰ에 의한 인슐린 분비조절에 관여함을 시사했다.
- , 1992). 이에 저자는 STZ유발 당뇨병 흰쥐의 침 시술시 간세포에 미치는 영향을 보고자 간세포를 체취하여 전자현미경을 통해 분석한 결과, 대조군은 정상군에 비해 소기관의 발달이 미약하고 다소 손상되어 있었으나, 침 시술 후 50% 이상 핵질이 발달되었고 미토콘드리아의 cristae의 형태가 대조군에 비해 뚜렷하였으며 무수히 많은 난원형 당원과립을 관찰하였다. 이는 GV6과 SP3에 대한 침 시술이 STZ에 의해 손상된 간세포를 재생시키는 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 6주 후 당내성 검사 결과 GV6군의 혈당이 전 시간에 걸쳐 대조군에 비해 유의하게 낮은것으로 나타났으며, SP3군과 SP3+GV6군도 120분후에는 대조군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이와 같이 침 시술이 β-세포의 재생 또는 기능의 회복에 긍정적 인 영향을 미치며, 특히 GV6가 가장 효 과적임을 알 수 있었다.
- 본 실험 결과에서 대조군의 GOT 수치가 유의성 있게 증가되어 선행연구 결과와 일치하는 경향을 보였으며, 침 시술을 시행할 경우 GOT와 GPT 수치가 대조군에 비해 감소되었다. 특히, GOT는 GV6군에서 더욱 정상에 가깝게 감소되었고, GPT는 SP3+GV6군은 정상수치와 같은 수준으로 감소되었다. 이는 간세포의 염증성파괴로부터 보호 또는 억제하는 효과가 있는 것으로 사료되었다.
- 세포질에서는 다수의 사립체가 둥글게 관찰되었는데 다소 응축되어 있었으며, cristae는 관찰되지 않았다. 핵 주변에서 관찰되는 조면소포 체의 발달은 매우 미약하였으며, 전반적인 간세포 소기관의 발달은 미약하고 다소 손상되어 있는 소견을 보여주었다(Fig. 7A). SP3군의 핵은 핵막이 둥글고 핵 질이 발달하였으며, 핵 속에서 커다란 핵소체 (nucleolus 가 관찰되었다.
- STZ 유발 당뇨병 흰쥐의 혈청을 분석하여 혈청 Cholesterol, HDL-cholesterol, Triglyceride, Free fatty acid의 함량을 알아보았다(Table 1). 혈청 cholesterole 정상군과 대조군의 차이가 뚜렷하지 않았으며, SP3+GV6군에서 67±2.9 mg/dL로 유의하게 감소하였다. HDL-cholesterole 대조군이 26±3.
후속연구
- 본 실험에서 cholesterole 모든 실험군에서 대조군에 비해 감소하였으며, 특히 SP3+GV6군의 경우 유의하게 감소된 것으로 나타났으며, HDL-cholesterol, triglyceride 및 free fatty acid도 모든 실험군에서 정상군 및 대조군에 비해 감소하여 STZ 유발 당뇨 흰쥐에 대한 침 시술이 혈중 지질 증가억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 단, HDL- cholesterol과 triglyceridee 대조군의 수치가 동일한식이 조건을 적용하였음에도 정상군에 비해 오히려 감소되어 기존 연구 결과와 달랐는데, 이에 대해서는 실험 대상이 흰쥐이며 체중, 식이 조건의 적용과 관련된 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과들을 참조하여 향후 침 시술시 염전, 보사 등의 전통 수기법, 다른 혈위에 대한 효과 등에 관한 지속적 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
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