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문제 정의
- 따라서 본 시험에서는 화학약제를 대체하여 차나무 병 해충을 제어할 수 있는 새로운 미생물제제를 개발하기 위한 기초연구의 하나로서 차나무 주요 병해인 겹둥근무늬 병균#에 대해 길항능력이 우수한 차나무 엽권 토착 세균인 B. subtilis BD0310의 대량배양을 위한 배양 조건과 P- longiseta에 대한 항균활성을 증대시킬 수 있는 탄소원과 질소원을 선발하였다.
- 에 대하여 강력한 길항능력을 PDA상에서 나타내었지만 차나무 잎에는 상처접종에도 불구하고 병원성을 전혀 나타내지 않는 유용한 길항균주로 확인되었다. 따라서 이 연구에서는 B. subtilis BD0310 균주를 차나무 겹둥근무늬병 방제전용 미생물제제로 개발하기 위한 기초연구로서 길항균주의 대량배양을 위한 배양조건을 조사하였다.
제안 방법
- 대조구는 탄소원을 첨가하지 않은 NB에서 배양한 길항균주의 상등액을 사용하였다. 25℃에서 7일간 배양시킨 후 생장한 P. longiseta 균총의 직경을 측정하여 대조구에서 생장한 P. longiseta 균종의 직경과 비교 하였다.
- 0%씩 첨가한 후 길항균주를 접종하고 30℃, 160 rpm으로 진탕배양하였다. 5일간 진탕배양하여 얻은 배양여액을 4, 000 rpm으 로 10분간 원심분리한 후 필터(milipore filter, 0.22 μm)를 사용하여 여과시킨 상등액을 P. longiseta의 균사생장 억제정도를 파악하기 위한 배양시험에 사용하였다. 감자한 천배지(PDA)를 두께 5 mm가 되게 Petri dish에 붓고 PDA plate의 중앙에 cork borer(직경 9 mm)를 이용하여 hole (직경 9 mm)을 만들고 그 속에 paper disc(직경 9 mm)를 치상한 후 길항균주의 상등액 300㎕를 넣어 무균상내에서 음건시키면서 흡습시켰다.
- 5%씩 첨가한 후 길항균주를 접종하고 30℃, 160 rpm으로 진탕배양하였다. 5일간 진탕배양하여 얻은 배양여액을 4, 000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 필터 (milipore filter, 0.22 #를 사용하여 여과시킨 상등액을 P. longiseta의 균사생장 억제정도를 파악하기 위한 배양시험에 사용하여 앞서 기술한 탄소원 선발실험과 동일한 방법으로 수행하였다.
- 길항세균. B. subtilis BD0310 균 주의 대량배양에 적합한 초기 pH를 조사하기 위하여 NB를 IN NaOH와 IN HC1 을 이용하여 pH 3에서 pH 11까지 pH 2 간격으로 보정하고, 길항균주를 접종하여 진탕배양기에서 30℃, 160 rpm으로 24시간동안 배양한 후 배양액 1 ml을 채취하여 살균수로 10배 희석한 후 560 nm 에서 흡광도를 조사하여 세균의 밀도를 비교하였다.
- 길항세균의 항균활성을 증가시키는 질소원. B. subtilis BD0310 균주의 대량배양을 위한 질소원 중에서 P. longiseta에 대한 항균활성을 증가시키는 질소원을 선발하기 위하여 5가지 질소원을 0.5%씩 첨가한 배지에서 배양한 길항 균주의 배양여액이 P. #의 균사생육에 미치는 영장 크게 억제시켰으며, 그 다음으로 tryptone, malt extract, (NH4)2SO4, casein 등을 첨가한 배지에서 배양한 배양여액 순으로 R longiseta의 균사생육을 억제시켰다(Fig. 4). 대조구에서 생장한 P.
- Zongisefa에 대하여 강력한 항균활성을 가진 균주로 선발된 차나무 엽권 길항세균 Bacillus subtilis BD0310 균 주를 시험에 사용하였다(오 등, 2005). Nutrient broth(NB) 에서 160rpm, 30℃, 18시간동안 배양한 길항균주 배양액 1m/l을 채취해 250ml용 삼각플라스크의 100m/NB에 접종하여 각 시험에서 사용하였다. 각 시험에서는 결과의 재현성을 확인하기 위하여 3회씩 수행하였으며, 모든 시험은 3반복으로 수행되었다.
- Nutrient broth(NB) 에서 160rpm, 30℃, 18시간동안 배양한 길항균주 배양액 1m/l을 채취해 250ml용 삼각플라스크의 100m/NB에 접종하여 각 시험에서 사용하였다. 각 시험에서는 결과의 재현성을 확인하기 위하여 3회씩 수행하였으며, 모든 시험은 3반복으로 수행되었다.
- longiseta의 균사생장 억제정도를 파악하기 위한 배양시험에 사용하였다. 감자한 천배지(PDA)를 두께 5 mm가 되게 Petri dish에 붓고 PDA plate의 중앙에 cork borer(직경 9 mm)를 이용하여 hole (직경 9 mm)을 만들고 그 속에 paper disc(직경 9 mm)를 치상한 후 길항균주의 상등액 300㎕를 넣어 무균상내에서 음건시키면서 흡습시켰다. 10일동안 PDA에서 배양한 P.
- 길항세균의 항균활성을 증가시키는 질소원 선발. 길항 세균 B. subtilis BD0310 균주의 대량배양을 위한 질소원 중에서 P. longiseta에 대한 항균활성을 증가시키는 질소원을 선발하기 위하여 0.05% #와 0.005% #와 항균활성을 증가시키는 탄소원으로 선발된 maltoseS- 첨가한 NB를 기본배지로 하여 casein, tryptone, malt extract, yeast extract, (NH4)2SO4 등 5가지 질소원을 각각 0.5%씩 첨가한 후 길항균주를 접종하고 30℃, 160 rpm으로 진탕배양하였다. 5일간 진탕배양하여 얻은 배양여액을 4, 000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 필터 (milipore filter, 0.
- 길항세균의 항균활성을 증가시키는 탄소원 선발. 길항 세균 B. subtilis BD0310 균주의 대량배양을 위한 탄소원 중에서 P. 에 대한 항균활성을 증가시키는 탄소원을 선발하기 위하여 0.05% FeSQ, #와 0.005% MnCl2 - 4H2O> 첨가한 NB 배지를 기본배지로 하고 fructose, galactose, glucose, glycerol, inositol, lactose, maltose, sorbitol, starch 등 9가지 탄소원을 각각 1.0%씩 첨가한 후 길항균주를 접종하고 30℃, 160 rpm으로 진탕배양하였다. 5일간 진탕배양하여 얻은 배양여액을 4, 000 rpm으 로 10분간 원심분리한 후 필터(milipore filter, 0.
- 배양 적온 및 시간 조사. 길항세균 B. subtilis BD0310 균주의 대량배양을 위한 배양 적온 및 적정 배양 시간을 조사하기 위하여 NB에 길항균주를 접종한 후 20℃에서 45℃까지 5℃ 간격으로 조정된 진탕배양기에서 160 rpm 으로 배양하면서 12시간 간격으로 배양액 1 m7을 채취하여 살균수로 10배 희석한 후 560nm에서 흡광도를 조사하여 세균의 밀도를 경시적으로 조사하였다.
대상 데이터
- longiseta 균총으로부터 동일한 직경의 cork bore로 떼어낸 신선한 균총 disc의 표면이 길항균주의 상등액이 음건건된 paper disc 표면과 접촉하도록 PDA plate hole 속에치상시 켰다. 대조구는 탄소원을 첨가하지 않은 NB에서 배양한 길항균주의 상등액을 사용하였다. 25℃에서 7일간 배양시킨 후 생장한 P.
- 시험균주 및 배양. 차나무에 겹둥근무늬병을 일으키는 P. Zongisefa에 대하여 강력한 항균활성을 가진 균주로 선발된 차나무 엽권 길항세균 Bacillus subtilis BD0310 균 주를 시험에 사용하였다(오 등, 2005). Nutrient broth(NB) 에서 160rpm, 30℃, 18시간동안 배양한 길항균주 배양액 1m/l을 채취해 250ml용 삼각플라스크의 100m/NB에 접종하여 각 시험에서 사용하였다.
성능/효과
- 1). 25℃에서 45℃까지 배양온도가 올라갈수록 생육이 왕성해져 길항균주의 밀도가 증가하는 경향이었으며, 배양 24시간을 정점으로 배양시간이 경과함에 따라 서서히 길 항균주의 밀도가 감소하였다. 여러가지 배양 온도 중에서 30℃에서 24시간 배양하였을 때 최고 생육에 도달하였으며, 이어서 35℃, 25℃, 40℃, 45℃ 순이었다.
- 배양 적정 pH 조사. B. subtilis BD0310 균주를 여러가지 pH로 보정된 NB에서 24시간과 48시간 배양 후 길 항균주의 증식 밀도를 조사한 결과 pH 3과 pH 11에서는 길항균주가 거의 생장하지 않았으나 pH 5에서 pH 7까지는 pH가 증가함에 따라 생육이 왕성해져 길항균주의 밀 도가 급격하게 증가하였으나 pH 9에서 다소 밀도가 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 2). 24시간 배양에 비해 48시간 배양하였을 때에는 길항균주의 밀도가 감소하였다.
- 길항세균의 항균활성을 증가시키는 탄소원. B. subtilis BD0310 균주의 대량배양을 위한 탄소원 중에서 P. longiseta에 대한 항균활성을 증가시키는 탄소원을 선발하기 위하여 NB배지를 기초배지로 하여 9가지 탄소원을 1%씩 첨가시킨 배지에서 배 양시 킨 길항균주의 배양여액 이 P. lowgiseta의 균사생육에 미치는 영향을 조사한 결과 maltose 를 첨가한 배지에서 배양한 길항균주의 배양여액이 P. longiseta의 균사생육을 가장 크게 억제시켰으며, 그 다음으로 inositol, lactose, glycerol, galactose, sorbitol, glucose, starch 등을 첨가한 배지에서 배양한 배양여액 순으로 P. Sgiseta의 균사생육을 억제시켰다(Fig. 3). 대조구에서 생장한 P.
- 배양 적온 및 시간. B. subtilis BD0310 균주의 배양 적온과 적정 배양 시간을 조사하기 위하여 NB에 접종한 후 20℃에서 45℃까지 5℃ 간격으로 진탕배양시키면서 12시간 간격으로 길항균주의 증식 밀도를 경시적으로 조사한 결과 온도별로 다양한 생장곡선을 나타내었다(Fig. 1). 25℃에서 45℃까지 배양온도가 올라갈수록 생육이 왕성해져 길항균주의 밀도가 증가하는 경향이었으며, 배양 24시간을 정점으로 배양시간이 경과함에 따라 서서히 길 항균주의 밀도가 감소하였다.
- B. subtilis BD0310 균주의 배양 적온을 조사하기 위한 여러가지 조합 중에서 301에서 24시간 배양했을 때에 길항균주의 밀도가 최고에 도달하였다. 또한 B.
- subtilis BD0310 균주를 대량배양을 할 경우 P Zongiseta에 대한 항균활성을 가장 높게 증가시키는 탄소원은 maltose로 확인되었으며, inositol 도 maltose에 버금갈 정도로 길항균주의 항균활성을 증가 시킬 것으로 기대된다. 같은 방법으로 5가지 질소원을 첨 가시켜 배양한 후 길항균주의 배양여액에 의한 P.longiseta 의 균사생육 억제효과를 조사한 결과 P. #에 대한 항균활성을 가장 높게 증가시키는 질소원은 yeast extract 로 확인되었으며, tryptone도 yeast extract와 비등하게 항균활성을 증가시켰다.
- 4). 대조구에서 생장한 P. longiseta 균총의 직경은 58.1 cm인 데 비하여 yeast extract를 첨가하였을 경우에는 40.7 cm로 30% 정도의 균사생육 억제효과를 나타내었다.
- 이것은 두 탄소원이 길항균주의 항균활성을 증대시켰기 때문으로 풀이된다. 따라서 B. subtilis BD0310 균주를 대량배양을 할 경우 P Zongiseta에 대한 항균활성을 가장 높게 증가시키는 탄소원은 maltose로 확인되었으며, inositol 도 maltose에 버금갈 정도로 길항균주의 항균활성을 증가 시킬 것으로 기대된다. 같은 방법으로 5가지 질소원을 첨 가시켜 배양한 후 길항균주의 배양여액에 의한 P.
- 미생물제제의 산업화를 위한 대량배양 공정에서는 배양시간을 단축시키는 것이 경제적이면서 안정적이다. 따라서 배양온도, 배양 pH와 배양시간을 종합적으로 고려하면 B. subtilis BD0310 균주를 대량배양하기 위한 최 적온도, 최적 pH 및 시간은 30℃, pH 7, 24시간인 것으로 확인되었다.
- subtilis BD0310 균주의 배양 적온을 조사하기 위한 여러가지 조합 중에서 301에서 24시간 배양했을 때에 길항균주의 밀도가 최고에 도달하였다. 또한 B. subtilis BD0310 균주를 NB에서 배양할 경우 초기 pH를 7로 보정했을 때 가장 높은 세균 밀도를 나타내었다. 한편 B.
- subtilis BD0310 균주를 차나무 겹둥근무늬병 방제용 미생물제제로 개발하기 위한 길항균주로 선발하였다. 선발된 B. subtilis BD0310 균주는 P. 에 대하여 강력한 길항능력을 PDA상에서 나타내었지만 차나무 잎에는 상처접종에도 불구하고 병원성을 전혀 나타내지 않는 유용한 길항균주로 확인되었다. 따라서 이 연구에서는 B.
- 따라서 Bacillus 속 세균들을 대량배양하는 배지 속에 항생 물질의 생성을 촉진시킬 수 있는 탄소원 또는 질소원을 첨가시켜주는 것은 길항능력이 향상된 미생물제제를 생산하기 위하여 바람직한 공정이다. 이 연구에서도 길항세균 B. subtilis BD0310 균주의 대량배양 과정 중에서 P. Zongisda에 대한 항균활성을 증가시키는 탄소원을 선발하기 위하여 9가지 탄소원을 첨가시켜 배양한 후 길항균주의 배양여액에 의한 P longiseta의 균사생육 억제효과를 조사한 결과 특히 maltose와 inositol을 탄소원으로 첨가한 배지에서 배양한 길항균주의 배양여액이 P. longiseta 의 균사생육을 가장 강하게 억제시키는 것으로 밝혀졌 다. 이것은 두 탄소원이 길항균주의 항균활성을 증대시켰기 때문으로 풀이된다.
- subtilis BD0310 균주를 NB에서 배양할 경우 초기 pH를 7로 보정했을 때 가장 높은 세균 밀도를 나타내었다. 한편 B.subtilis BD0310 균주를 30℃에서 '배양했을 때에도 24시간 배양 이후에는 시간이 경과함에 따라 길항균주의 밀 도는 오히려 감소하였으며, pH 7에서도 48시간 배양했을 경우 24시간 배양에 비해 길항균주의 밀도가 감소하였다. 미생물제제의 산업화를 위한 대량배양 공정에서는 배양시간을 단축시키는 것이 경제적이면서 안정적이다.
후속연구
- 이러한 점들을 고려하면 대규모 다원에서 재배되고 있는 차나무 수관은 밀식된 차나무 가지와 잎이 서로 촘촘하게 얽혀있어서 다른 작물에 비해 길항세균이 안정적으로 정착할 수 있는 서식지를 제공해 줄 것으로 판단된다(오 등, 2005). 따라서 B. subtilis BD0310 균주를 차나무 수관에 살포하였을 경우 안정적으로 차나무 엽권에 정착할 수 있도록 내생포자의 발아율을 증대시키고 엽권에서 생존 및 증식 능력을 향상시킬 수 있는 제형 개발이 추후 차나무 겹둥 근무늬병 미생물농약 상용화의 관건이 될 것으로 전망된다.
- 차나무의 엽권으로부터 분리된 길항세균 B. subtilis BD0310 균주를 이 연구에서 밝혀진 대량배양 조건에서 배양하여 미생물제제로 실용화하기 위해서는 P. longiseta 에 대한 길항능력을 향상시킬 수 있는 제형화 연구 및 현장적용 시험 등이 추가로 수행되어야 한다. 식물체 표면에 존재하는 미생물상은 서식지에서 햇빛, 바람과 비에 노출정도, 유용한 영양원의 종류 및 함량, 지형 등에 의해 결정되고(Andrews와 Harris, 2000), 특히 건조와 UV에 대한 내성이나 회피가 식물체 표면 서식지에서 미생물의 생존에 가장 중요하다(Beattie와 Lindow, 1999).
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