Taxene 계 화학요법제로서 항암치료에 사용되고 있는 docetaxel 은 폐암을 포함한 다양한 종양에서 효과적인 항암 치료제로 사용되고 있다. Docetaxel 에 의한 폐암세포의 사멸 유도 기전은 정확히 알려져 있지 않으며, 기전을 연구하기 위해 docetaxel로 처리한 NCI-H1703 세포의 세포주기 및 형태적 변화를 유세포측정기, 형광현미경, western blot 분석법을 통하여 확인하였다. 그 결과 docetaxel 은 의미 있게 S기를 감소시키고 G2기를 증가시킴으로써 NCI-H1703 세포의 사멸을 증가시켰다. Docetaxel에 노출되었을 때 caspase-3와 caspase-9의 활성이 증가되었다. 이들 결과를 종합해볼때, docetaxel 은 H1703 의 세포사멸 유도 시 caspase-3 의존성 미토콘드리아 관련 세포사멸기전으로 apoptosis를 일으키는 것으로 생각한다.
Taxene 계 화학요법제로서 항암치료에 사용되고 있는 docetaxel 은 폐암을 포함한 다양한 종양에서 효과적인 항암 치료제로 사용되고 있다. Docetaxel 에 의한 폐암세포의 사멸 유도 기전은 정확히 알려져 있지 않으며, 기전을 연구하기 위해 docetaxel로 처리한 NCI-H1703 세포의 세포주기 및 형태적 변화를 유세포측정기, 형광현미경, western blot 분석법을 통하여 확인하였다. 그 결과 docetaxel 은 의미 있게 S기를 감소시키고 G2기를 증가시킴으로써 NCI-H1703 세포의 사멸을 증가시켰다. Docetaxel에 노출되었을 때 caspase-3와 caspase-9의 활성이 증가되었다. 이들 결과를 종합해볼때, docetaxel 은 H1703 의 세포사멸 유도 시 caspase-3 의존성 미토콘드리아 관련 세포사멸기전으로 apoptosis를 일으키는 것으로 생각한다.
Background: Docetaxel has been effectively used as an anti-cancer chemotherapuetic agent for various tumor treatments including lung cancer. However, the cell death induction mechanism(s) involved with docetaxel treatment in lung cancer cells has not been known yet. Material and Method: In the prese...
Background: Docetaxel has been effectively used as an anti-cancer chemotherapuetic agent for various tumor treatments including lung cancer. However, the cell death induction mechanism(s) involved with docetaxel treatment in lung cancer cells has not been known yet. Material and Method: In the present study, the cellular and biochemical changes of NCI-H1703 cells (non-small cell lung cancer cell line, p53-mutant) after docetaxel treatment have been monitored by flow cytometry, fluorescence microscopy and western blot. Result: Docetaxel treatment significantly resulted in decrease of S phase as well as increase of G2 phase, and consequently evoked an increase of cell death in NCI-H1703 cells. After docetaxel exposure the activations of caspase-3 and caspase-9 were detected. Conclusion: Take together, it is suggested that the docetaxel induces NCI-H1703 cell death by caspase-9 and caspase-3 dependent mitochondrial apoptotic pathway.
Background: Docetaxel has been effectively used as an anti-cancer chemotherapuetic agent for various tumor treatments including lung cancer. However, the cell death induction mechanism(s) involved with docetaxel treatment in lung cancer cells has not been known yet. Material and Method: In the present study, the cellular and biochemical changes of NCI-H1703 cells (non-small cell lung cancer cell line, p53-mutant) after docetaxel treatment have been monitored by flow cytometry, fluorescence microscopy and western blot. Result: Docetaxel treatment significantly resulted in decrease of S phase as well as increase of G2 phase, and consequently evoked an increase of cell death in NCI-H1703 cells. After docetaxel exposure the activations of caspase-3 and caspase-9 were detected. Conclusion: Take together, it is suggested that the docetaxel induces NCI-H1703 cell death by caspase-9 and caspase-3 dependent mitochondrial apoptotic pathway.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 실험에서는 비소세포 폐암 중 p53 돌연변이로써 편평상피세포암 세포주인 NCI-H1703 세포주에 docetaxelo] 유도하는 암세포 사멸 효과를 평가하였으며, 이들 처리에 의해서야기되는 세포 사멸 기전을 연구하였다.
본 연구에서는 비소세포 폐암 중 p53 유전자 돌연변이이며 편평상피세포암인 NCI-H1703 세포주를 이용하여 doce- taxel을 처리한 뒤 세포사멸 유도기전을 규명하고자 하였다.
제안 방법
Docetaxel의 처리가 세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포 사멸률과 세포주기를 분석하였다. 5 ng/mL의 docetaxel을 NCI-H1703 세포에 48시간 동안 처리한 후, PI로 핵을 염색하여 유세포 측정기로 세포 사멸률을 측정하였다. 48시간 처리군에서는 대조군과 비교해서 이기가 10% 정도 감소하고 S기가 30% 정도 감소하는 양상을 보였고, 대조군에 비해 세포 사멸률이 25% 정도 증가한 것으로 나타났다(Fig.
Docetaxel 5 ng/mL 처리군에 핵만을 특이적으로 염색하는 Hoechst 33342형광염색제와 propidium iodide (PI)로 세포의 핵을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였으며 다량의 핵조각과 응축된 형태의 핵이 관찰되었다. 그리고 다핵의 형태가 관찰되었다 (Fig.
Docetaxel의 처리가 세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포 사멸률과 세포주기를 분석하였다. 5 ng/mL의 docetaxel을 NCI-H1703 세포에 48시간 동안 처리한 후, PI로 핵을 염색하여 유세포 측정기로 세포 사멸률을 측정하였다.
수획한 세포는 PBS로 세척하여, 세포를 즉시 4% paraform- aldehyde로 고정하였다. Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO) 염색액을 4μg/mL의 농도로 PBS 용액에 희석하여 실온에서 2시간 동안 염색한 후, slide glass에 도말하여 핵의 형태를 형광현미경으로 관찰하였다.
3X105개의 세포를 분주하여 48시간 동안 세포배양기에서 부착시킨 후, 새로운 배양액으로 교체한 후 처리하였다. NCL H1703 세포에 5 ng/mL docetaxel을 처리한 후, 37℃에서 48시간 배양시킨 뒤, 세포를 수획하여 실험을 수행하였다. 대조군에는 docetaxel의 용해에 사용한 ethanol (최종 처리 농도; 0.
5 mM pepstatin)]로 4℃에서 40분간 용해시킨 다음, 4℃에서 15분간 14, 000 rpm으로 원심분리한 후 단백질이 포함된 상등액만을 취하여 Bradford (Pierce, Rockford, IL) 방법으로 총단백질을 정량하였다. 각각의 시료에서 단백질 70μg을 균등하게 취하여 SDS-polyacrylamide gel (8~15% gradient gel)에서 전기 영동한 후, nylon membrane에 전기적으로 전위 (electrotransfer)시켰다 Anti-caspase-3 (Santa Cruz, CA), anti-cleaved caspase-3 (New England Biolabs, Beverly, MA), anti-cleaved caspase-9 (New England Biolabs, Beverly, MA), anti-caspase-9 (Santa Cruz, CA), anti-actin (Santa Cruz, CA) 등을 일차 항체로 하였고, enhanced chemiluminescence 방법 (ECL-plus Amereham Co.)으로 발색하였으며, LAS-1000PLUS (Fujifilm)로 섬광의 발생량을 측정함으로써 단백질의 발현량을 분석하였다.
NCL H1703 세포에 5 ng/mL docetaxel을 처리한 후, 37℃에서 48시간 배양시킨 뒤, 세포를 수획하여 실험을 수행하였다. 대조군에는 docetaxel의 용해에 사용한 ethanol (최종 처리 농도; 0.05%, v/v)을 처리하였다. 모든 실험은 3번 이상 반복 수행하였다.
모든 시료의 처리는 6-welI의 배양접시에 각각 1.3X105개의 세포를 분주하여 48시간 동안 세포배양기에서 부착시킨 후, 새로운 배양액으로 교체한 후 처리하였다. NCL H1703 세포에 5 ng/mL docetaxel을 처리한 후, 37℃에서 48시간 배양시킨 뒤, 세포를 수획하여 실험을 수행하였다.
NC1-H1703 비소세포 폐암 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다, 10%의 fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Grand Ishand, NY)와 1%의 항생제 (penicillin-streptomycin)가 포함된 RPMI 1640배지에 2 mM L-glutamine, 1.5 g/L sodium bicarbonate, 4.5 g/L glucose, 10 mM HEPES와 1.0 mM sodium pyruvate (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하여 배양하였다. 5%의 CO와 95%의 공기가 포함된 37℃의 배양기에서 배양하였다.
성능/효과
5 ng/mL의 docetaxel을 NCI-H1703 세포에 48시간 동안 처리한 후, PI로 핵을 염색하여 유세포 측정기로 세포 사멸률을 측정하였다. 48시간 처리군에서는 대조군과 비교해서 이기가 10% 정도 감소하고 S기가 30% 정도 감소하는 양상을 보였고, 대조군에 비해 세포 사멸률이 25% 정도 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1).
Caspase-9의 활성 정도를 Western blot 분석법으로 나타냈을 때 대조군에서는 cleaved caspase-9가 검출되지 않았으며, docetaxel 처리군에서 가장 강한 활성을 보이는 것으로 나타났다(Fi& 3). Caspase-3의 활성화는 caspas-3를 활성화시키게 되는데 대조군에서는 활성형 caspase-3이 검출되지 않았으며, docetaxel 처리군에서 17 및 19 KDa 단백질이 검출되어 강한 활성을 보였다 (Fig. 4).
Caspase-9의 활성 정도를 Western blot 분석법으로 나타냈을 때 대조군에서는 cleaved caspase-9가 검출되지 않았으며, docetaxel 처리군에서 가장 강한 활성을 보이는 것으로 나타났다(Fi& 3). Caspase-3의 활성화는 caspas-3를 활성화시키게 되는데 대조군에서는 활성형 caspase-3이 검출되지 않았으며, docetaxel 처리군에서 17 및 19 KDa 단백질이 검출되어 강한 활성을 보였다 (Fig.
Docetaxel의 NCI-H17O3 세포주에의 처리는 세포주기 중 세포분열 과정을 억제함으로써 세포사멸을 apoptosis의 형태로 유도하는 것으로 보이며 특히, docetaxele NCI-H1703의 세포 사멸 유도시, caspase-3의 활성화와 더불어 세포사 멸 억제 단백질인 XIAP의 양이 감소하는 것으로 보아, caspase-3 의존성 세포사멸기전을 나타냄을 알 수 있으며 caspase-8의 활성이 없고 caspase-9의 활성화가 존재하는 것으로 보아 사립체 관련성 세포사멸기전으로도 apop- tosis가 일어나는 것으로 생각된다.
세포주기 분석 결과 G2기에서 대조군에 비해 45%의 강한 G2기 정지 현상을 보였으며, 이 결과는 docetaxel이 NCI-H1703 세포주의 유사 분열을 억제하여 세 포사멸을 유도했다는 것을 증명한다. Hoechst staining 결과를 보면 docetaxel 처리군에서 세포 사멸분체 (apoptotic body) 라 불리는 핵조각이 관찰되며, 이것은 docetaxel이 NCI- H1703 세포주에서 전형적인 세포사멸을 유도하는 것이라고 볼 수 있다. P53은 세포주기의 진행 과정에서 G1 기 세 포주기 점검점(check point)의 조절자로써 잘 알려져 있으나, p53 유전자의 돌연변이는 세포에 이상이 생겨도 G1 기 를 조절하지 못하여 세포를 G2기로 진행시키게 된다[15].
또한 docetaxele p53 유전자 돌연변이인 NCI-H1703 비소세포폐암의 G2/M기를 정지시킴으로써 세포의 유사분열을 억제하여 다핵을 유도하는 것을 확인하였다. 고리고 caspase-9을 직접적으로 활성화시키며, 최종적으로는 caspase- 3의 활성화를 통해 세포사멸 과정을 결정짓는 것으로 생각된다.
03 세 포주에서는 아직 활발한 연구가 이루어지지 못하고 있다. 본 실험에서 docetaxele NCI-H1703 세포주에서 시간의존 적으로 세포 사멸을 유도했으며, 48시간에 44%의 세포 사멸을 나타냈다. 세포주기 분석 결과 G2기에서 대조군에 비해 45%의 강한 G2기 정지 현상을 보였으며, 이 결과는 docetaxel이 NCI-H1703 세포주의 유사 분열을 억제하여 세 포사멸을 유도했다는 것을 증명한다.
본 실험에서 docetaxele NCI-H1703 세포주에서 시간의존 적으로 세포 사멸을 유도했으며, 48시간에 44%의 세포 사멸을 나타냈다. 세포주기 분석 결과 G2기에서 대조군에 비해 45%의 강한 G2기 정지 현상을 보였으며, 이 결과는 docetaxel이 NCI-H1703 세포주의 유사 분열을 억제하여 세 포사멸을 유도했다는 것을 증명한다. Hoechst staining 결과를 보면 docetaxel 처리군에서 세포 사멸분체 (apoptotic body) 라 불리는 핵조각이 관찰되며, 이것은 docetaxel이 NCI- H1703 세포주에서 전형적인 세포사멸을 유도하는 것이라고 볼 수 있다.
후속연구
그리나 Huisman 등[18]은 NCI-H460 세포주에 pacli- taxel을 처리한 결과 caspase와는 독립적인 세포사멸기 전이 있음을 발견하였다. 이는 페암세포주마다 같은 항암제라도 다른 세포 사멸 기전이 조직함을 시사하며 향후 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
참고문헌 (18)
Langer CJ. Advanced non-small cell lung carcinoma: the emerging role of docetaxel. Invest New Drugs 2000;18: 17-28
Ganansia-Leymarie V, Bischoff P, Bergerat JP, Holl V. Signal transduction pathways of taxanes-induced apoptosis. Curr Med Chem Anti-Canc Agents 2003;3:291-306
King TC, Akerley W, Fan AC, et al. p53 mutations do not predict response to paclitaxel in metastatic nonsmall cell lung carcinoma. Cancer 2000;89:769-73
Kolfschoten GM, Hulscher TM, Duyndam MC, Pinedo HM, Boven E. Variation in the kinetics of caspase-3 activation, Bcl-2 phosphorylation and apoptotic morphology in unselected human ovarian cancer cell lines as a response to docetaxel. Biochem Pharmacol 2002;63:733-43
Ferreira CG, Tolis C, Span SW, et al. Drug-induced apoptosis in lung cnacer cells is not mediated by the Fas/FasL (CD95/APO1) signaling pathway. Clin Cancer Res 2000;6: 203-12
Zelivianski S, Spellman M, Kellerman M, et al. ERK inhibitor PD98059 enhances docetaxel-induced apoptosis of androgen-independent human prostate cancer cells. Int J Cancer 2003;107:478-85
Masuda A, Maeno K, Nakagawa T, Saito H, Takahashi T. Association between mitotic spindle checkpoint impairment and susceptibility to the induction of apoptosis by antimicrotubule agents in human lung cancers. Am J Pathol 2003;163:1109-16
Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A, et al. Gene expression profiling for the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer. Lancet 2003;362: 362-9
Illidge TM, Cragg MS, Fringes B, Olive P, Erenpreisa JA. Polyploid giant cells provide a survival mechanism for p53 mutant cells after DNA damage. Cell Biol Int 2000;24: 621-33
Huisman C, Ferreira CG, Broker LE, et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCL-H460. Clin Cancer Res 2002;8:596
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.