후추의 주요 성분인 piperine은 다양한 생리활성을 나타내고 있으며, 특히 암예방 효과가 있는 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 piperine의 항암 효과를 밝히기 위해 piperine이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향과 작용 기전을 연구하였다. Piperine을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도($0{\sim}40{\mu}M$)로 첨가하여 세포를 배양한 경우 piperine 처리 농도가 증가할수록 세포의 증식이 감소하였고, 세포사멸이 증가하였다. 이는 piperine이 HT-29 세포의 세포사멸을 유도하여 세포 증식을 억제함을 제시한다. Piperine의 세포사멸 기전을 조사하기 위해 세포사멸 조절인자의 변화를 조사하였다. Piperine에 의해 anti-apoptotic Bcl-2family 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으나, Bik 단백질 수준은 증가하였다. 또한 piperine에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 증가하였고, cytochrome c의 세포질로의 방출이 증가하였다. 또한 piperine 처리에 의해 caspase의 활성형인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 증가하였고, PARP의 불활성형인 cleaved PARP 수준이 증가하였다. Caspase의 활성을 저해하는 세포사멸억제단백질 중의 하나인 survivin 단백질 발현이 piperine에 의해 감소하였다. 이 결과로부터 대장암세포인 HT-29 세포에서 piperine이 Bcl-2 family 단백질 발현 변화를 초래하여 미토콘드리아 막 투과성 증가시키고 cytochrome c 방출을 증가시키고, caspase 활성을 증가시키고 survivin 단백질 발현을 억제하여 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다. 본 연구는 piperine이 대장암에 강한 항암 효과가 있음을 밝혔으나 향후 암예방 및 암치료제로서 piperine을 활용하기 위해서는 동물실험 및 임상실험 등 다양한 추가 실험이 필요할 것으로 보인다.
후추의 주요 성분인 piperine은 다양한 생리활성을 나타내고 있으며, 특히 암예방 효과가 있는 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 piperine의 항암 효과를 밝히기 위해 piperine이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향과 작용 기전을 연구하였다. Piperine을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도($0{\sim}40{\mu}M$)로 첨가하여 세포를 배양한 경우 piperine 처리 농도가 증가할수록 세포의 증식이 감소하였고, 세포사멸이 증가하였다. 이는 piperine이 HT-29 세포의 세포사멸을 유도하여 세포 증식을 억제함을 제시한다. Piperine의 세포사멸 기전을 조사하기 위해 세포사멸 조절인자의 변화를 조사하였다. Piperine에 의해 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으나, Bik 단백질 수준은 증가하였다. 또한 piperine에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 증가하였고, cytochrome c의 세포질로의 방출이 증가하였다. 또한 piperine 처리에 의해 caspase의 활성형인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 증가하였고, PARP의 불활성형인 cleaved PARP 수준이 증가하였다. Caspase의 활성을 저해하는 세포사멸억제단백질 중의 하나인 survivin 단백질 발현이 piperine에 의해 감소하였다. 이 결과로부터 대장암세포인 HT-29 세포에서 piperine이 Bcl-2 family 단백질 발현 변화를 초래하여 미토콘드리아 막 투과성 증가시키고 cytochrome c 방출을 증가시키고, caspase 활성을 증가시키고 survivin 단백질 발현을 억제하여 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다. 본 연구는 piperine이 대장암에 강한 항암 효과가 있음을 밝혔으나 향후 암예방 및 암치료제로서 piperine을 활용하기 위해서는 동물실험 및 임상실험 등 다양한 추가 실험이 필요할 것으로 보인다.
Piperine is an alkaloid-amine found in pepper and has been reported to have anticarcinogenic properties. To explore the possibility that piperine has cancer chemopreventive and chemotherapeutic effects in colon cancer, we examined whether piperine inhibits the growth of HT-29 human colon cancer cell...
Piperine is an alkaloid-amine found in pepper and has been reported to have anticarcinogenic properties. To explore the possibility that piperine has cancer chemopreventive and chemotherapeutic effects in colon cancer, we examined whether piperine inhibits the growth of HT-29 human colon cancer cells and investigated the mechanisms for this effect. Cells were cultured with various concentrations ($0{\sim}40{\mu}M$) of piperine. Piperine decreased the cell viability and induced apoptosis of HT-29 cells. Western blot analysis of total cell lysates revealed that piperine decreases the protein levels of Bcl-2, Mcl-1, and intact Bid but increases Bik levels. Piperine increased the percentage of cells with depolarized mitochondrial membrane, and the release of cytochrome c into cytoplasm. Piperine induced the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase and caspases 8, 9, 7, and 3 and increased the Fas levels. In addition, piperine significantly decreased the protein levels of survivin. The present results indicate that piperine inhibits the growth of HT-29 colon cancer cells by the induction of apoptosis, which may be mediated by its ability to change the Bcl-2 family proteins, increase the activation of caspases, and decrease survivin levels. Overall, our findings suggest that piperine has cancer chemotherapeutic effects in colon cancer.
Piperine is an alkaloid-amine found in pepper and has been reported to have anticarcinogenic properties. To explore the possibility that piperine has cancer chemopreventive and chemotherapeutic effects in colon cancer, we examined whether piperine inhibits the growth of HT-29 human colon cancer cells and investigated the mechanisms for this effect. Cells were cultured with various concentrations ($0{\sim}40{\mu}M$) of piperine. Piperine decreased the cell viability and induced apoptosis of HT-29 cells. Western blot analysis of total cell lysates revealed that piperine decreases the protein levels of Bcl-2, Mcl-1, and intact Bid but increases Bik levels. Piperine increased the percentage of cells with depolarized mitochondrial membrane, and the release of cytochrome c into cytoplasm. Piperine induced the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase and caspases 8, 9, 7, and 3 and increased the Fas levels. In addition, piperine significantly decreased the protein levels of survivin. The present results indicate that piperine inhibits the growth of HT-29 colon cancer cells by the induction of apoptosis, which may be mediated by its ability to change the Bcl-2 family proteins, increase the activation of caspases, and decrease survivin levels. Overall, our findings suggest that piperine has cancer chemotherapeutic effects in colon cancer.
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문제 정의
핵에 존재하고, DNA 수선에 관여하여 세포의 생존 유지에 중요한 역할을 담당하는 PARP는 caspase-3의 주요한 표적 단백질로 caspase-3에 의해 분절되면 불활성화 되어 세포의 분해를 촉진하여 세포사멸을 야기한다(34). Piperine에 의해 caspase-3의 활성이 증가하였으므로 piperine이 PARP의 분절에 미치는 영향을 조사하였다. Piperine 처리농도가 증가할수록 PARP의 불활성 형태인 cleaved PARP 단백질 수준이 현저히 증가하였고 piperine을 40 μM로 처리한 경우 piperine을 처리하지 않은 군에 비해 cleaved PARP수준이 29.
세포사멸억제단백질 중 survivin은 다른 세포사멸억제단백질과는 달리 태아기에 발현이 증가하다가 정상 성인에서는 발현이 거의 되지 않지만 여러 악성 종양에서 현저하게 재발현이 되고 암 환자에 있어 생존기간, 예후, 치료에 대한 저항성 및 암 재발 등에 관여하는 것으로 알려져 있다(18,19). Piperine이 세포사멸억제단백질인 survivin 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하였다. Fig.
2A). Sub G1기에 머무른 세포수의 증가는 세포사멸의 특징으로 간주되므로(32) piperine이 세포사멸을 유도하는 것으로 생각되어 본 연구에서는 piperine이 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다. HT-29 세포의 세포 배양액에 piperine을 첨가하여 세포를 72시간 배양한 후 Hoechst H 33258로 염색하여 세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다.
여러 연구 보고를 통해 piperine이 항암 효과를 나타내는 것을 알 수 있으나, piperine이 대장암에 미치는 영향과 작용 기전에 대해 연구된 바가 드물다. 따라서 본 연구에서는 piperine이 대장암세포의 증식에 미치는 영향과 그 작용 기전을 조사하고자 하였다.
후추의 주요 성분인 piperine은 다양한 생리활성을 나타내고 있으며, 특히 암예방 효과가 있는 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 piperine의 항암 효과를 밝히기 위해 piperine이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향과 작용 기전을 연구하였다. Piperine을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도(0～40 μM)로 첨가하여 세포를 배양한 경우 piperine 처리 농도가 증가할수록 세포의 증식이 감소하였고, 세포사멸이 증가하였다.
후추의 주요 성분인 piperine은 강한 항암 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있으나, 대장암의 증식에 미치는 영향에 대해 보고된 바가 미미하다. 본 연구에서는 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포를 사용하여 piperine이 대장암세포의 증식과 세포사멸에 미치는 영향 및 그 작용 기전을 밝히고자 하였다.
Caspase는 initiator caspase와 effector caspase로 구분되며, initiator caspase는 death-inducing signal에 의해 활성화되어 effector caspase를 활성화하고 활성화된 effector caspase는 lamin A, α-fodrin, DNA fragmentation factor와 PARP 등의 단백질을 분해하여 세포사멸을 유도한다(16). 여러 연구에서 다양한 항암 성분은 caspase의 활성을 조절하여 암세포의 세포사멸을 유도한다고 보고되고 있어(23-26) 본 연구에서는 piperine이 caspase 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 caspase의 활성화된 형태인 cleaved caspase의 단백질 수준을 조사하였다. Fig.
제안 방법
Sub G1기에 머무른 세포수의 증가는 세포사멸의 특징으로 간주되므로(32) piperine이 세포사멸을 유도하는 것으로 생각되어 본 연구에서는 piperine이 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다. HT-29 세포의 세포 배양액에 piperine을 첨가하여 세포를 72시간 배양한 후 Hoechst H 33258로 염색하여 세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다. Fig.
Piperine에 의해 Bcl-2 family 단백질의 변화가 초래되었으므로 piperine이 미토콘드리아의 막 투과성에 영향을 미쳤는지 조사하기 위해 piperine을 처리한 세포를 JC-1로 염색하여 미토콘드리아 막의 탈분극 정도를 측정하였다. Piperine 처리에 의해 red-fluorescent를 띠는 세포 수는 감소하였고 green-fluorescent를 띠는 세포 수는 증가하였다.
4B)에 의해 caspase-9이 활성화된 것으로 사료된다. Piperine에 의해 caspase-8의 활성이 증가하였으므로(Fig. 5), piperine이 cell death receptor인 Fas와 그 ligand인 Fas ligand(FasL)에 미치는 영향을 조사하였다. HT-29 세포에서 membrane-bound FasL은 Western blot analysis에 의해 검출되지 않았으나 분자량 42 kDa인 Fas는 검출되었다.
4A). Piperine에 의해 미토콘드리아 막 투과성이 증가하였으므로, piperine을 처리하여 세포를 배양한 후 세포질을 분리하여 Western blot을 실시하여 세포질로 방출된 cytochrome c를 측정하였다. Fig.
2B에서 보는 바와 같이 piperine을 40 μM로 처리한 경우 세포사멸이 일어나면 나타나는 apoptotic bodies가 관찰되었다. Piperine에 의해 유도된 세포사멸을 정량하기 위해 HT-29세포의 세포 배양액에 piperine을 다양한 농도로 첨가하여 72시간 배양한 후 Annexin V와 7-AAD로 염색하여 flow cytometry 방법으로 early apoptotic 세포 수를 측정하였다. Piperine 처리 농도가 증가할수록 살아있는 세포 수는 현저히 감소하였고, 세포사멸 세포수는 농도 의존적으로 증가하였다(Fig.
Piperine은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 40 mM로 만들어 -70℃에 보관하여 사용하였고, 대조군을 포함하여 모든 처리군의 DMSO 농도를 동일하게 하였다. Piperine을 첨가하여 세포를 0, 24, 48, 72시간 동안 배양한 후 MTT assay 방법(27)으로 세포 증식 정도를 측정하였다.
이는 piperine이 HT-29 세포의 세포사멸을 유도하여 세포 증식을 억제함을 제시한다. Piperine의 세포사멸 기전을 조사하기 위해 세포사멸 조절인자의 변화를 조사하였다. Piperine에 의해 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으나, Bik 단백질 수준은 증가하였다.
반면 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질은 미토콘드리아 막의 탈분극을 억제하여 막 투과성을 감소시켜 cytochrome c의 방출을 억제하여 세포사멸을 억제한다(17). Piperine이 Bcl-2 family 단백질 수준에 미치는 영향을 알아보기 위해 HT-29 세포에 piperine을 처리하여 세포를 배양한 후 total cell lysate를 만들어 Western blot analysis를 수행하였다. HT-29 세포에서 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-xL, pro-apoptotic 단백질인 Bax와 Bak, BH3-only 단백질인 Bad와 Bmf 등의 단백질 수준은 piperine 처리에 의해 변하지 않았다(data not shown).
암세포의 세포주기 진행 지연과 세포사멸 유도는 암세포증식 억제 기전 중의 하나며, 항암활성을 가진 물질들의 중요한 특성이며, 현재 이용되고 있는 많은 항암제는 암세포의 세포사멸을 유도하여 그 효과를 나타내고 있다(21,22). Piperine이 HT-29 세포의 증식을 효과적으로 억제하였으므로(Fig. 1) piperine의 세포 증식 억제가 세포주기 진행 지연에 의한 것인지를 확인하기 위해 HT-29 세포의 세포 배양액에 piperine을 첨가하여 세포를 48시간 배양한 후 핵을 propidium iodide로 염색하여 flow cytometry 방법으로 세포주기 진행의 변화를 확인하였다. Piperine을 40 μM 농도로 48시간 처리한 경우 sub G1기에 머무른 세포수가 증가하였고 G1기에 머무른 세포 수는 감소하였으며 S기와 G2/M기에 머무른 세포 수는 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig.
Piperine이 대장암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포에 다양한 농도(0, 10, 20, 40 μM)의 piperine을 처리하여 MTT assay 방법(27)으로 세포 증식 정도를 측정하였다.
1% Tween 20)로 1시간 교반한 후 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후 horseradish peroxidase(HRP)-linked anti-rabbit IgG 또는 HRP-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였다. 각 단백질 밴드는 ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)을 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다.
미토콘드리아 막의 투과성을 조사하기 위하여 dualemission potential-sensitive probe JC-1을 사용하였다. JC-1은 낮은 막 전위(membrane potential)에서는 greenfluorescent monomer 형태로 나타나며 미토콘드리아의 전압이 증진된 막 전위에서는 red-fluorescent J aggregate를 형성한다(29).
세포를 1% FBS가 포함되어 있는 배지에서 24시간 동안 배양한 후 1% FBS가 포함되어 있는 배지에 piperine을 0, 10, 20, 40 μM 농도로 첨가한 배지로 교환하여 세포를 배양하였다.
세포에 10 μg/mL Hoechst H 33258 용액을 넣어 어두운 곳에서 1시간 염색하였다. 세포를 PBS로 충분히 헹군 후 형광현미경으로 관찰하였다(29).
대상 데이터
(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9, cleaved poly(ADP-ribose) polymerase(PARP), survivin, Mcl-1, Bid, Bik에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
Fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin, TrypsinEDTA 등은 Cambrex Bio Technology(Walkersville, MD, USA)에서 구입하였다.
Phycoerythrin(PE)-conjugated Annexin V, 7-amino-actinomycin D와 cytochrome c 항체는 BD Pharmingen(Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다.
HT-29 세포를 위와 동일한 방법으로 piperine을 첨가하여 48시간 동안 세포를 배양하였다. 세포를 PBS로 헹군 후, trypsin-EDTA를 이용하여 분리한 세포를 수집하였다. JC-1을 2 μg/mL 농도로 첨가하여 어두운 곳에서 30분 동안 반응한 후, FACScanTM(Becton Dickinson)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 측정하였다.
인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient Mixture Ham's F12(DMEM/F12)은 Gibco/BRL(Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
수집된 결과는 SAS(Statistical Analysis System) Windows v. 8.12 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군의 평균치간의 유의성은 p<0.05 수준에서 analysis of variance와 Duncan’s multiple range test에 의해 분석하였다.
이론/모형
After serum deprivation, cells were incubated in serum-deprivation medium in the absence or presence of various concentrations of piperine. Cell viability were estimated by the MTT assay. Each bar represents the mean±SE (n=6).
JC-1을 2 μg/mL 농도로 첨가하여 어두운 곳에서 30분 동안 반응한 후, FACScanTM(Becton Dickinson)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 측정하였다.
세포 단층을 PBS로 헹구고 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 수집한 후 Kim 등(28)과 같은 방법으로 세포를 propidium iodide로 염색하였다. Propidium iodide에 의해 염색된 세포를 FACScanTM(Becton Dicknson, Franklin Lake, NJ, USA)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 세포주기를 측정하였다.
그 후 horseradish peroxidase(HRP)-linked anti-rabbit IgG 또는 HRP-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였다. 각 단백질 밴드는 ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)을 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 Bio-profile Bio-ID application(Vilber-Lourmat, Marine la Vallee, France)을 사용하여 측정하였다.
각 단백질 밴드는 ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)을 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 Bio-profile Bio-ID application(Vilber-Lourmat, Marine la Vallee, France)을 사용하여 측정하였다.
세포를 24-well plate에 50,000 cells/well의 밀도로 분주한 후 위와 동일한 방법으로 piperine을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 세포 단층을 PBS로 헹구고 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 수집한 후 Kim 등(23-26)과 같은 방법으로 세포를 phycoerythrin(PE)-conjugated Annexin V와 7-amino-actinomycin D(7-AAD)로 염색한 후 Annexin V 또는 7-AAD에 의해 염색된 세포를 FACScanTM(Becton Dicknson)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 측정하였다.
세포를 24-well plate에 50,000 cells/well의 밀도로 분주한 후 위와 동일한 방법으로 0 또는 40 μM 농도로 piperine을 처리하여 48시간 동안 세포를 배양하였다. 세포 단층을 PBS로 헹구고 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 수집한 후 Kim 등(28)과 같은 방법으로 세포를 propidium iodide로 염색하였다. Propidium iodide에 의해 염색된 세포를 FACScanTM(Becton Dicknson, Franklin Lake, NJ, USA)을 사용하여 flow cytometry 방법에 의해 세포주기를 측정하였다.
cells/dish의 밀도로 100 mm dish에 분주하였고, 위와 동일한 방법으로 piperine을 처리하여 48시간 또는 72시간 배양한 후 total cell lysate를 만들었다(23-26). 세포질 분획은 Eguchi 등(30)이 제시한 방법으로 분리하였다. Total cell lysate와 세포질 분획의 단백질 농도는 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 정량하였다.
성능/효과
Fig. 7에 나타난 바와 같이 survivin 단백질 수준은 piperine 처리에 의해 현저히 감소하였으며, piperine을 40μM 농도로 처리한 경우 piperine을 처리하지 않은 군에 비해 survivin 단백질 수준이 76% 감소하였다(Fig. 7).
Piperine에 의해 유도된 세포사멸을 정량하기 위해 HT-29세포의 세포 배양액에 piperine을 다양한 농도로 첨가하여 72시간 배양한 후 Annexin V와 7-AAD로 염색하여 flow cytometry 방법으로 early apoptotic 세포 수를 측정하였다. Piperine 처리 농도가 증가할수록 살아있는 세포 수는 현저히 감소하였고, 세포사멸 세포수는 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 2C). 이상의 결과를 통해 piperine에 의한 세포증식 억제 효과가 세포사멸 유도에 기인함을 알 수 있으며, piperine이 항암제로서 개발 가능성을 제시한다.
Piperine 처리농도가 증가할수록 PARP의 불활성 형태인 cleaved PARP 단백질 수준이 현저히 증가하였고 piperine을 40 μM로 처리한 경우 piperine을 처리하지 않은 군에 비해 cleaved PARP수준이 29.9배 증가하였다(Fig. 5).
Piperine에 의한 세포 증식 감소는 piperine 처리 후 24시간부터 나타났으며 시간이 경과함에 따라 세포 증식 감소현상은 더욱 현저히 나타났고, 40 μM 농도로 piperine을 72시간 처리한 경우 piperine을 처리하지 않은 대조군에 비해 76.4% 세포 증식이 감소하였다(Fig. 1).
Piperine에 의해 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으나, Bik 단백질 수준은 증가하였다.
Piperine을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도(0～40 μM)로 첨가하여 세포를 배양한 경우 piperine 처리 농도가 증가할수록 세포의 증식이 감소하였고, 세포사멸이 증가하였다.
HT-29 세포에서 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-xL, pro-apoptotic 단백질인 Bax와 Bak, BH3-only 단백질인 Bad와 Bmf 등의 단백질 수준은 piperine 처리에 의해 변하지 않았다(data not shown). 그러나 piperine 처리에 의해 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으며, Bik 단백질 수준은 증가하였다(Fig. 3). Bid는 불활성 전구체로 세포질에 존재하며, 활성화된 caspase-8에 의해 분절되어 활성형인 truncated Bid(t-Bid)가 된다.
5에 나타난 바와 같이 initiator caspase인 caspase-8, -9의 활성형인 cleaved caspase-8과 -9 단백질 수준이 piperine 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 effector caspase인 caspase-3과 -7의 활성형인 cleaved caspase-3, -7 단백질 수준도 piperine 처리에 의해 현저히 증가하였다(Fig. 5).
Piperine에 의해 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으나, Bik 단백질 수준은 증가하였다. 또한 piperine에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 증가하였고, cytochrome c의 세포질로의 방출이 증가하였다. 또한 piperine처리에 의해 caspase의 활성형인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 증가하였고, PARP의 불활성형인 cleaved PARP 수준이 증가하였다.
또한 piperine에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 증가하였고, cytochrome c의 세포질로의 방출이 증가하였다. 또한 piperine처리에 의해 caspase의 활성형인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 증가하였고, PARP의 불활성형인 cleaved PARP 수준이 증가하였다. Caspase의 활성을 저해하는 세포사멸억제단백질 중의 하나인 survivin 단백질 발현이 piperine에 의해 감소하였다.
Caspase의 활성을 저해하는 세포사멸억제단백질 중의 하나인 survivin 단백질 발현이 piperine에 의해 감소하였다. 이 결과로부터 대장암세포인 HT-29 세포에서 piperine이 Bcl-2 family 단백질 발현 변화를 초래하여 미토콘드리아 막 투과성 증가시키고 cytochrome c 방출을 증가시키고, caspase 활성을 증가시키고 survivin 단백질 발현을 억제하여 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다. 본 연구는 piperine이 대장암에 강한 항암 효과가 있음을 밝혔으나 향후 암예방 및 암치료제로서 piperine을 활용하기 위해서는 동물실험 및 임상실험 등 다양한 추가 실험이 필요할 것으로 보인다.
4B에 나타난 바와 같이 piperine 처리에 의해 세포질로 방출된 cytochrome c의 양은 유의적으로 증가하였다. 이상의 결과는 piperine이 Bcl-2 family 단백질의 변화를 초래하여 미토콘드리아 막의 투과성을 증가하고 세포질로 cytochrome c의 방출을 증가함을 나타낸다. 암세포의 세포사멸을 유도한 성분들은 Bcl-2 family 단백질의 변화를 초래하고 미토콘드리아 막의 투과성을 증가하여 세포사멸을 유도한다고 보고되고 있으므로(23-26,29), piperine에 의한 Bcl-2 family 단백질의 변화, 미토콘드리아 막의 투과성 증가가 piperine에 의해 유도된 HT-29 세포의 세포사멸의 유도 기전 중의 하나로 사료된다.
이상의 결과들은 후추의 주요 성분인 piperine이 대장암 세포인 HT-29 세포에 세포사멸을 유도하여 암세포의 증식을 억제함을 나타낸다. HT-29 세포에서 piperine은 세포사멸의 주요한 조절인자인 Bcl-2 family 단백질 발현 변화에 의한 미토콘드리아 막 투과성 증가와 cytochrome c 방출 증가, caspase 활성 증가, 세포사멸억제단백질인 survivin 단백질 발현을 억제하여 세포사멸을 유도하는 것으로 사료되며 이를 Fig.
후속연구
8에 나타내었다. 다른 연구들에 의해 piperine의 암예방 가능성이 제시되었고(10-13), 본 연구를 통해 piperine이 대장암에 강한 항암 효과가 있음을 밝혔으나 향후 암예방 및 암치료제로서 piperine을 활용하기 위해서는 다양한 동물실험 및 임상실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.
이 결과로부터 대장암세포인 HT-29 세포에서 piperine이 Bcl-2 family 단백질 발현 변화를 초래하여 미토콘드리아 막 투과성 증가시키고 cytochrome c 방출을 증가시키고, caspase 활성을 증가시키고 survivin 단백질 발현을 억제하여 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다. 본 연구는 piperine이 대장암에 강한 항암 효과가 있음을 밝혔으나 향후 암예방 및 암치료제로서 piperine을 활용하기 위해서는 동물실험 및 임상실험 등 다양한 추가 실험이 필요할 것으로 보인다.
이상의 결과를 통해 piperine에 의한 세포증식 억제 효과가 세포사멸 유도에 기인함을 알 수 있으며, piperine이 항암제로서 개발 가능성을 제시한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Piperine의 효과에는 무엇이 있는가?
후추에서 분리된 다양한 phytochemical들은 여러 생리활성을 나타내는 것으로 알려지고 있으며, 그 중에서 alkaloid-amine 성분인 piperine이 대표적이다. Piperine은 항산화 활성(6), 간세포 보호 효과(7), 뇌세포 보호 효과(8) 등의 효과를 나타냄이 보고되었으며, Pradeep과 Kuttan(9)은 piperine이 B16F-10 melanoma cell에서 염증과 관련된 NF-kB, c-Fos, CREB, ATF-2 및 proinflammatory cytokine의 발현을 억제함을 보고하였다. Piperine은 benzo(a)pyrene을 투여하여 폐암을 유도한 동물에서 강한 암예방 효과를 나타냈고(10,11), in vivo에서 B16F-10 melanoma cells의 폐전이를 효과적으로 억제하였고(12), Sarcoma 180에 의한 고형암 형성을 억제하였다(13). Duessel 등(14)이 대장암세포인 DLD-1 세포의 증식이 piperine에 의해 억제되었다고 보고하였으나, 이 연구를 제외하면 현재까지 piperine이 대장암에 미치는 영향과 기전에 대해 연구된 바가 없다.
세포사멸은 무엇인가?
세포사멸(apoptosis)은 선택적인 세포 소실을 일으키는 생리적인 과정으로 조직의 항상성 유지에 필수적인 조절 작용이다(15). 세포사멸은 세포 내․외적인 세포사멸 신호에 의해 시작되어 세포사멸을 조절하는 단백질인 Bcl-2 family 단백질, caspases, 세포사멸억제단백질(inhibitors of apoptosis protein)의 유기적인 상호작용에 의해 조절된다(16-19).
후추의 주요 성분인 piperine의 항암 효과를 밝히기 위해 piperine이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향과 작용 기전을 연구한 결과는 어떻게 되는가?
본 연구에서는 piperine의 항암 효과를 밝히기 위해 piperine이 인간의 대장에서 유래한 암세포인 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향과 작용 기전을 연구하였다. Piperine을 HT-29 세포 배양액에 여러 농도(0～40 μM)로 첨가하여 세포를 배양한 경우 piperine 처리 농도가 증가할수록 세포의 증식이 감소하였고, 세포사멸이 증가하였다. 이는 piperine이 HT-29 세포의 세포사멸을 유도하여 세포 증식을 억제함을 제시한다. Piperine의 세포사멸 기전을 조사하기 위해 세포사멸 조절인자의 변화를 조사하였다. Piperine에 의해 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bcl-2와 Mcl-1 단백질 수준은 감소하였고, BH3-only 단백질인 Bid 단백질 수준은 감소하였으나, Bik 단백질 수준은 증가하였다. 또한 piperine에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 증가하였고, cytochrome c의 세포질로의 방출이 증가하였다. 또한 piperine처리에 의해 caspase의 활성형인 cleaved caspase-8, -9, -7, -3 단백질 수준이 증가하였고, PARP의 불활성형인 cleaved PARP 수준이 증가하였다. Caspase의 활성을 저해하는 세포사멸억제단백질 중의 하나인 survivin 단백질 발현이 piperine에 의해 감소하였다. 이 결과로부터 대장암세포인 HT-29 세포에서 piperine이 Bcl-2 family 단백질 발현 변화를 초래하여 미토콘드리아 막 투과성 증가시키고 cytochrome c 방출을 증가시키고, caspase 활성을 증가시키고 survivin 단백질 발현을 억제하여 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다.
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