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문제 정의
- 18) 당뇨병성 족부궤양 같은 만성 상처의 치유에 그 효과가 이미 증명되어 있고, 동물 피부의 부분층 및 전층 창상에서 치유 기간을 단축시키는 recombinant human EGF (rhEGF)의 효력 또한 입증되었다.19~21) 아직까지 EGF의 구내염에 대한 효과는 입증되지 않았지만 EGF가 방사선 조사성 구내염 발생의 병리학적 기전 및 그 치유에 밀접한 관련이 있으며, 위장막에 발생한 궤양 등에 치유 효과가 있을 것으로 보고되어 있기 때문에, EGF가 구내염에 충분히 효과적일 것으로 생각되어 방사선 치료 시 발생하는 구내염에 대한 EGF의 효과를 보고자 하였다.5,15,22,23)
- 본 시험은 rhEGF?} 방사선 구내염의 회복에 미치는 효과를 알아보기 위하여 임상에서 일반적으로 사용되는 방사선량보다 더 많은 양의 방사선을 고의적으로 Rat에게 조사하여 구내염을 발생시킨 후, rhEGF를 구강 내에 처치하여 rhEGF를 처치하지 않은 개체들과 생존율, 체중변화, 사료섭취율 및 조직학적 변화 등을 비교분석하여 내염에 대한 rhEGF의 효과를 평가하고자 하였다.
가설 설정
- 16) EGF는 표피세포와 섬유아세포의 EGF수용체와 반응하여 피부 창상을 재상피화, 수축, 육아조직형성 및 교원질 합성 등을 유도하여 치유한다.17) A EGF의 주요 분비 장소는 혈소판, 대식 세포와 단핵세포 등으로 밝혀져 있다.18) 당뇨병성 족부궤양 같은 만성 상처의 치유에 그 효과가 이미 증명되어 있고, 동물 피부의 부분층 및 전층 창상에서 치유 기간을 단축시키는 recombinant human EGF (rhEGF)의 효력 또한 입증되었다.
제안 방법
- 방사선 조사 전 Rat를 ketamine (100 ㎎/㎏)과 xylazine (10 ㎎/㎏)를 혼합하여 근육 주사하여 마취시켰다. 4 MV 에너지의 치료용 선형가속기(CLINAC 600 C, Varian, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분당 2 Gy의 선량률(dose rate) 로 Rat의 두부에 균일하게 조사하였다. 이때 점막에 충분한 선량이 투여되게 하기 위하여 1.
- rhEGF의 투여는 방사선 조사 후 다음날부터 18일 동안 하루 총 3회(오전 9시, 오후 1시, 그리고 오후 6시) 구강에 도포하였다. Rat의 구강에 rhEGF가 충분히 도포하기 위하여, 1회당 100㎕씩 EGF 총 300를 매일 도포하였다. 사용된 rhEGF 시료는 ml당 50μg 및 100μg 농도의 액상제로 (주)대웅제약으로부터 공급받아 본 연구에 사용하였다.
- 전체 Rat 35마리 중 방사선 조사한 Rat 28마리를 무작위로 7마리씩 4개의 시험군으로 구분하여 무처치군, 부형제 처치군, rhEGF 처치군(15 또는 30/zg/day 구강 내 처치군)으로 분류하였고, 방사선을 조사하지 않은 7마리를 정상시험군으로 분류하였다. rhEGF의 투여는 방사선 조사 후 다음날부터 18일 동안 하루 총 3회(오전 9시, 오후 1시, 그리고 오후 6시) 구강에 도포하였다. Rat의 구강에 rhEGF가 충분히 도포하기 위하여, 1회당 100㎕씩 EGF 총 300를 매일 도포하였다.
- 일반 증상의 관찰항목으로는 식욕부진(anorexia), 탈모(hair loss) 및 예민성(sensitivity)을 관찰하여 기록하였다. 또한, 실험기간 동안 모든 실험 동물에 대하여 오전 9시의 체중 및 사료섭취량을 매일 측정하였다.
- 방사선 조사 전 Rat를 ketamine (100 ㎎/㎏)과 xylazine (10 ㎎/㎏)를 혼합하여 근육 주사하여 마취시켰다. 4 MV 에너지의 치료용 선형가속기(CLINAC 600 C, Varian, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분당 2 Gy의 선량률(dose rate) 로 Rat의 두부에 균일하게 조사하였다.
- 방사선 조사 후 7일째에 구내염 유발과 정도를 시험군 간에 비교 평가하기 위하여 시험군당 1마리씩을 무작위로 선별하여 육안소견을 확인한 후 부검하였다. 혀와 구강점막 및 일반장기(간, 신장, 심장, 비장, 폐장, 소장, 대장)를 적출하였고, 10% 중성포르말린에 고정하여 조직표본 제작 후 haematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하였다.
- 혀와 구강점막 및 일반장기(간, 신장, 심장, 비장, 폐장, 소장, 대장)를 적출하였고, 10% 중성포르말린에 고정하여 조직표본 제작 후 haematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하였다. 사망 동물 및 회복 동물에 대해서도 부검을 실시하여, 조직학적 변화를 분석하였다.
- 실험기간 동안 실험 동물의 일반 증상 및 사망 동물을 관찰하였다. 일반 증상의 관찰항목으로는 식욕부진(anorexia), 탈모(hair loss) 및 예민성(sensitivity)을 관찰하여 기록하였다.
- 실험기간 동안 실험 동물의 일반 증상 및 사망 동물을 관찰하였다. 일반 증상의 관찰항목으로는 식욕부진(anorexia), 탈모(hair loss) 및 예민성(sensitivity)을 관찰하여 기록하였다. 또한, 실험기간 동안 모든 실험 동물에 대하여 오전 9시의 체중 및 사료섭취량을 매일 측정하였다.
- 전체 Rat 35마리 중 방사선 조사한 Rat 28마리를 무작위로 7마리씩 4개의 시험군으로 구분하여 무처치군, 부형제 처치군, rhEGF 처치군(15 또는 30/zg/day 구강 내 처치군)으로 분류하였고, 방사선을 조사하지 않은 7마리를 정상시험군으로 분류하였다. rhEGF의 투여는 방사선 조사 후 다음날부터 18일 동안 하루 총 3회(오전 9시, 오후 1시, 그리고 오후 6시) 구강에 도포하였다.
- 방사선 조사 후 7일째에 구내염 유발과 정도를 시험군 간에 비교 평가하기 위하여 시험군당 1마리씩을 무작위로 선별하여 육안소견을 확인한 후 부검하였다. 혀와 구강점막 및 일반장기(간, 신장, 심장, 비장, 폐장, 소장, 대장)를 적출하였고, 10% 중성포르말린에 고정하여 조직표본 제작 후 haematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하였다. 사망 동물 및 회복 동물에 대해서도 부검을 실시하여, 조직학적 변화를 분석하였다.
대상 데이터
- 동물 실험은 서울아산병원연구소의 Institutional Review Board에서 승인되었으며, 실험동물은 특정병원체 부재 SD 계 Rat 7주령 35마리(암수 각각 17, 18)(체중: 178±5 g)를 (주)오리엔트로부터 공급받아 서울아산병원연구소 실험동 물사육실에서 온도 23±1℃, 상대습도 55±5%, 배기 10~ 18회/hr, 조명 12시간, 조도 150~300 lux의 사육환경에서 사육하였다. Rat용 고형사료와 음료는 자유롭게 섭취시키며, 1주일간 순화시킨 후 시험에 사용하였다.
- Rat의 구강에 rhEGF가 충분히 도포하기 위하여, 1회당 100㎕씩 EGF 총 300를 매일 도포하였다. 사용된 rhEGF 시료는 ml당 50μg 및 100μg 농도의 액상제로 (주)대웅제약으로부터 공급받아 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
- Irradiated rats were subjected to no further treatment (Group 1) or were treated with vehicle (Group2), 50㎍/ml EGF (Group 3), or 100㎍/ml EGF (Group 4). The survival probabilities of EGF-treated rats (Groups 3 and 4) differed significantly from that of untreated rats (Groups 1 and2), as determined by the Kaplan-Meier log-rank test (p=0.0001). However, the survival probabilities of rats treated with 50"g/ml EGF (Group 3) or 100㎍/ml EGF (Group 4) showed no significant difference.
- 모든 측정치는 평균±표준편차로 표시하였고 시험군 간의 비교는 ANOVA test를 시행하였다. 시험군 간의 통계학적 유의성은 student, s t-test로 검정하였으며, p < 0.
- 모든 측정치는 평균±표준편차로 표시하였고 시험군 간의 비교는 ANOVA test를 시행하였다. 시험군 간의 통계학적 유의성은 student, s t-test로 검정하였으며, p < 0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다. 시험군의 생존분석 (survival analysis)은 Kaplan-Meier법을 이용하여 95%신뢰구간에서 검정하였다.
이론/모형
- 5 cm bolus를 이용하였다. 방사선은 단회로 조사하였으며, Potten 등3)이 발표한 논문을 참고하여 Rat 한마리당 총 25 Gy의 방사선을 조사 하였다.
- 05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다. 시험군의 생존분석 (survival analysis)은 Kaplan-Meier법을 이용하여 95%신뢰구간에서 검정하였다.
성능/효과
- 17) A EGF의 주요 분비 장소는 혈소판, 대식 세포와 단핵세포 등으로 밝혀져 있다.18) 당뇨병성 족부궤양 같은 만성 상처의 치유에 그 효과가 이미 증명되어 있고, 동물 피부의 부분층 및 전층 창상에서 치유 기간을 단축시키는 recombinant human EGF (rhEGF)의 효력 또한 입증되었다.19~21) 아직까지 EGF의 구내염에 대한 효과는 입증되지 않았지만 EGF가 방사선 조사성 구내염 발생의 병리학적 기전 및 그 치유에 밀접한 관련이 있으며, 위장막에 발생한 궤양 등에 치유 효과가 있을 것으로 보고되어 있기 때문에, EGF가 구내염에 충분히 효과적일 것으로 생각되어 방사선 치료 시 발생하는 구내염에 대한 EGF의 효과를 보고자 하였다.
- 그리고 구내염은 백혈구감소증이 있는 종양 환자에게 환부를 통한 세균 감염을 용이하게 하여 패혈증으로 인한 사망 위험을 크게 한다.2) 또한 경제적인 측면을 고려하였을 때, 통상 구내염이 심한 환자가 퇴원시까지 걸리는 시간이 길기 때문에, 그만큼 입원비용도 늘어나 경제적으로 손실을 주게 된다.
- EGF가 구강 및 위장막내를 비롯한 체내에 다량으로 존재하지만, 방사선 치료 시 구강 내에 EGF 농도가 국소적으로 감소함에 따라 구내염 발생이 용이하게 되기 때문에 EGF와 구내염 발생은 밀접한 관계가 있을 것으로 판단된다.2, 5, 23) 본 연구결과를 종합하여 볼 때 방사선 조사에 유발된 Rat의 구내염 모델을 대상으로 rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군 처치가 구내염에 대한 치료 효과가 있음을 확인하였다.
- Recombinant human epidermal growth factor (rhEGF)는 당병성 족부궤양 같은 만성 상처에 대한 치유 효과가 이미 증명되어 방사선에 의해 유발되는 구내염의 치료에도 그 효과가 기대된다.3) 최근 본 연구팀이 시행한 세포 증식 실험에서도 방사선 조사로 손상시킨 섬유아세포에 rhEGF 10 ng/ml부터 1,000 ng/ml까지 농도를 변화 시켰을 때 섬유아 세포가 농도의존적으로 증식되어지는 결과를 보여 rhEGF 의 구내염 치료제로서의 가능성을 볼 수가 있었다(unpublished). 방사선에 의한 구내염의 예방과 치료에 rhEGF의 효과가 증명된다면 두경부종양의 치료 성적 향상을 기대할 수 있다
- 구내염은 논문에 따라 다르지만 두경부 종양에 대한 방사선 치료를 받는 환자의 90% 이상에서 발생한다고 보고되어 있다.5) 특히 구내염 발생이 방사선 치료의 중단 및 식이섭취의 불량을 초래하기 때문에, 환자의 전신적인 상태를 악화시켜서 전반적으로 방사선 치료를 받은 환자의 예후를 나쁘게 할 수 있다.2,5_) 방사선 치료 후 발생되는 구내염에 대한 치료법을 찾기 위해 많은 연구가 진행되고 있다.
- 구내염에 rhEGF를 처치함으로써 Rat의 사료섭취율 및 체중에서 유의성 있는 결과를 얻을 수 있었다. rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군에서 방사선 조사 후 6일 및 9일 사이에 사료섭취율이 증가하는 것을 확인함으로써, 사료섭취율의 증가 시점과 점막 치유 시점간의 상관관계를 예상할 수 있었다. 하지만 점막 치유가 되지 않은 무처치 군 및 부형제 처치군의 Rat는 방사선 조사 후 10일 이전에 모두 사망하였다.
- rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군에서 생존율, 체중 회복 및 사료섭취율에 있어 무처치군 및 부형제 처치군 에 비하여 각각 유의성 있는 효과를 보였지만, rhEGF 15 또는 30/zg/day 구강 내 처치군 사이에는 유의성 있는 차이를 관찰할 수는 없었다. 피부의 창상 치유에 있어 일정 농도 이상에서 rhEGF의 상처 치유 효과는 비슷하다는 점을 고려 하였을 때, 방사선 조사로 인하여 발생한 구내염에서도 일정 농도 이상에서 유사한 결과가 발생하기 때문에 rhEGF의 농도 변화에 따른 차이가 없을 것으로 생각된다2)
- 방사선 조사 후 8일째에는 시험군 간에 유의성 있는 체중 차이를 관찰할 수 없었는데, 이는 무처치군과 부형제 처치군의 사망으로 인한 개체수 감소 때문에 비교가 더 이상 어려웠다. rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군은 방사선 조사 후 지속적으로 체중이 감소하는 추세를 보이다가 9일째부터 증가하였으며, 13일째에는 체중이 증가되는 양상이 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 2).
- 그러나, 무처치군과 부형제 처치군에서는 상피 조직의 심한 손실과 심한 염증 및 가성 점막이 확연하게 관찰되어 나쁜 예후를 예상할 수 있었다. rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군의 방사선 처치 후 18일째의 구강 점막은 방사선 조사를 받지 않은 정상시험군의 구강 점막 과 비교하였을 때, 거의 정상에 가까워 구내염으로부터 완전하게 회복된 것으로 판단되었다. 이는 rhEGF가 점막을 덮고 있는 상피세포의 당단백질 수용체의 하나인 EGF 수용체와 결합하여 상피세포의 DNA합성을 유도하여 세포분 열을 촉진하기 때문에 점막 내에 발생한 상처 및 궤양 치 유를 촉진한 것으로 예상한다.
- 또한, rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군과 무처치군 및 부형제 처치군간에 생존율의 명확한 차이를 보였다. rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군의 실험종료시의 생존율이 각각 33%이었던 반면, 무처치 및 부형제 처치군에서는 회복되는 개체없이 실험종료시의 생존율이 0%이었다. 임상에서 구내염의 악화로 인하여 환자의 식이섭취가 불량해지고, 이로 인하여 전신상태의 악화되어 방사선 치료를 중단하는 경우가 발생 되기 때문에 본 실험의 결과를 기초로 rhEGF를 임상적인 치료제로써 고려해 볼 수 있다.
- 3마 리가 사망하였고, 11일째에 1마리가 추가적으로 사망한 것을 제외하고는 더 이상 사망동물이 관찰되지 않아 33% (2/6)의 생존율을 나타내었다. rhEGF 15 및 30μg/day 처치 군은 무처치군 및 부형제 처치군에 비하여 각각 통계적으로 유의한 생존율을 보였다(p=0.0001). 하지만, rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군은 서로 통계적인 유의성을 보이지 않았다(Table 1, Fig.
- 구내염에 rhEGF를 처치함으로써 Rat의 사료섭취율 및 체중에서 유의성 있는 결과를 얻을 수 있었다. rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군에서 방사선 조사 후 6일 및 9일 사이에 사료섭취율이 증가하는 것을 확인함으로써, 사료섭취율의 증가 시점과 점막 치유 시점간의 상관관계를 예상할 수 있었다.
- 9 g으로써 뚜렷한 사료섭취율의 증가를 관찰할 수 있었다. 또한 실험종료 18 일째에 rhEGF 15 및 30μg/day 구강 내 처치군의 평균 사 료섭취율을 정상시험군(29.4 g)과 비교하였을 때, 각각 26.4 g 및 25.6 g으로써 정상시험군과 매우 유사하게 관찰되었다(Table 4, Fig. 3).
- 본 시험 결과, 5일 및 8일 사이에 rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군의 평균 사료섭취량은 무처치군과 부형제군에 비하여 높았으며, rhEGF 15 또는 3(%g/day 구강 내 처치군의 Rat의 사망 시점은 무처치군 및 부형제 처치군에 비하여 현저히 지연되었다. 또한, rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군과 무처치군 및 부형제 처치군간에 생존율의 명확한 차이를 보였다. rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군의 실험종료시의 생존율이 각각 33%이었던 반면, 무처치 및 부형제 처치군에서는 회복되는 개체없이 실험종료시의 생존율이 0%이었다.
- 모든 시험군에서 방사선 조사 후 7일 동안 사망동물은 관찰되지 않았다. 무처치군에서 조직학적 검사를 위해 7일 째에 부검한 Rat 1마리를 제외한 총 6마리 중 방사선 조사 8일째에 3마리가 사망하였고, 9일째에 남은 3마리가 사망하여 0% (0/6)의 생존율을 보였다.
- 모든 시험군에서 방사선 조사 후 7일 동안 사망동물은 관찰되지 않았다. 무처치군에서 조직학적 검사를 위해 7일 째에 부검한 Rat 1마리를 제외한 총 6마리 중 방사선 조사 8일째에 3마리가 사망하였고, 9일째에 남은 3마리가 사망하여 0% (0/6)의 생존율을 보였다. 부형제 처치군에서는 방사선 조사 8일째에 3마리, 9일째에 2마리 그리고 10일째에 남은 1마리가 사망하여 0% (0/6)의 생존율을 보였다.
- 하지만 시험군 간의 뚜렷한 탈모 증상의 차이는 관찰할 수 없었다(Table 2). 방사선 조사 6일째에 모든 시험군의 Rat 에서 물리적인 자극 및 소리에 대해 매우 예민한 반응을 보였으며, 무처치군 및 부형제 처치군의 Rat에서 사망 전까지 예민한 반응을 지속적으로 관찰할 수 있었다. 방사선 조사 14일째에 rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군의 Rat에서는 예민 반응과 같은 이상 증상을 보이지 않았으며, 외양적으로 양호하였다(Table 2).
- 방사선 조사 후 7일째에 부검한 무처치군과 부형제 처치 군의 Rat에서 혀와 구강점막의 표피층의 심한 위축, 진피 층의 충혈과 염증세포의 침윤, 그리고 각질층의 염증세포 및 괴사세포의 침윤에 의한 뚜렷한 위막 형성이 관찰되었다. 전형적인 심한 위막성 구내염 또는 궤양성 구내염이 관찰되었다.
- 3). 방사선 조사 후 9 일째에 rhEGF 15 및 30/zg/day 구강 내 처치군의 사료섭취 율이 증가하기 시작하였으며, 14일째에는 정상시험군(26.0 g)과 비교하였을 때, 각각 19.6 g 및 14.9 g으로써 뚜렷한 사료섭취율의 증가를 관찰할 수 있었다. 또한 실험종료 18 일째에 rhEGF 15 및 30μg/day 구강 내 처치군의 평균 사 료섭취율을 정상시험군(29.
- 방사선 조사를 받은 모든 시험군에서 방사선 조사 후 3일 동안은 체중이 점차 증가하다 4일부터는 급격하게 체중이 감소하였다(Fig. 2). rhEGF 15/zg/day 구강 내 처치군의 평균 체중은 부형제 처치군과 비교하였을 때, 방사선 조사 후 2일, 3일, 4일 및 5일째에 각각 8.
- 방사선 조사를 받은 모든 시험군에서 방사선 조사 후 4 일부터 평균 사료섭취율이 감소하는 양상을 보였고, 방사선 조사 후 5일째에 정상시험군(19.1 g)에 비하여 무처치군(2.6 g), 부형제 처치군(3.3 g), rhEGF 15μg/day 구강 내 처치군(4.7 g)의 사료섭취율이 급격하게 감소하였다. 하지만 rhEGF 30"g/day 구강 내 처치군은 상대적으로 높은 17.
- 본 시험 결과, 5일 및 8일 사이에 rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군의 평균 사료섭취량은 무처치군과 부형제군에 비하여 높았으며, rhEGF 15 또는 3(%g/day 구강 내 처치군의 Rat의 사망 시점은 무처치군 및 부형제 처치군에 비하여 현저히 지연되었다. 또한, rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군과 무처치군 및 부형제 처치군간에 생존율의 명확한 차이를 보였다.
- 부형제 처치군에서는 방사선 조사 8일째에 3마리, 9일째에 2마리 그리고 10일째에 남은 1마리가 사망하여 0% (0/6)의 생존율을 보였다. 이에 비해 rhEGF 15μg/day 구강 내 처치군에서는 방사선 조사 11일째에 2마리, 13일째에 1마리, 그리고 14일째에 1마리가 사망하였고, 실험종료 18일까지 더 이상 사망하는 개체가 발생하지 않아 33% (2/6)의 생존율을 보였다. rhEGF 30 μg/day 구강 내 처치군에서는 방사선 조사 10일째에 .
- 체중은 회복 초기에 사료섭취율에 비례해 빠르게 회복되었고, 16일째부터는 정상시험군과 유사한 체중 증가를 관찰할 수 있었다. 체중 변화에서도 방사선 조사를 받은 시험군들의 체중이 감소하는 시점인 2일 및 3일째부터 rhEGF 15/zg/day 구강 내 처치군에서 무처치군 및 부형제 처치군에 비하여 체중이 더 무거웠으며, 체중 감소가 확연한 5일 및 7일째에는 rhEGF 15 또는 30μg/day 구강 내 처치군 모두에서 통계학적으로 유의한 체중 차이를 보였다. 이 사실로 rhEGF의 구내염에 대한 치유 효과가 방사선 조사를 받은 후 초기부터 작용하였다고 판단되었다.
후속연구
- 임상에서 구내염의 악화로 인하여 환자의 식이섭취가 불량해지고, 이로 인하여 전신상태의 악화되어 방사선 치료를 중단하는 경우가 발생 되기 때문에 본 실험의 결과를 기초로 rhEGF를 임상적인 치료제로써 고려해 볼 수 있다. 하지만 이런 결과들로 rhEGF의 구내염에 대한 효과가 구내염 발생 전에 예방적인 작용을 나타내었는지, 아니면 치유 효과만을 나타낸 것인지 본 실험으로는 증명할 수 없었기 때문에, 차후 이에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
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