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문제 정의
- 이에 본 연구는 paraquat 중독 환자에서 항산화 치료에 대한 기초 자료로서 사람의 말초 혈액에서 paraquat 독성에 대한 세포 파괴 정도(cytotoxicity)를 측정하였다. 또한 이 세포독성에 대하여 vitamin C와 deferoxamine의 항산화 효과를 평가하고자 자유라디칼(free radical) 생성 양과 비례하는 지질과산화의 최종 산물인 malondialde- hyde(이하 MDA)를 측정하였으며, 자유라디칼의 제거에 관여하는 항산화계에 대하여 생체 내에서 자유라디칼을 불활성화시키는데 중요한 항산화효소인 superoxide dismutase(이하 SOD)활성도와 비 효소계 항산화물질로 총 항산화제 (total antioxidant status, 이하 TAS) 의 양을 측정하였다.
제안 방법
- RPMI 1640 배지에 FBS (fetal Bovine serum)를 10% 를 첨가하여 사용하였다.
- SOD의 활성도 측정은 상품화된 RANSOD® kit (Randox Lab. Ltd, UK)를 이용하여 측정하였다. SOD는 체내 산화 에너지 과정에서 발생된 독성을 지닌 과산화 라 디칼(toxic superoxide radical, 02)을 과산화수소로 전환시켜 불활성화를 촉진하는 역할을 한다'
- 세포 현탁액 50 를 기준으로 처 리하여 96-well에 분주하여 18시간 동안 5% CO2, 37℃ 세포배 양기 에서 배 양 한 다음 15 의 dye solution (Promega, Cat# G4, 000) 을 넣어준 뒤 4시간 동안 5% CO2, 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 100 의 stop solution (Promega, Cat.#G4, 000)을 넣고 1시간 동안 방치한 다음 각 군 당 4개의 well에 분주되어 배양된 세포의 흡광도를 micro plate reader를 이용하여 wavelength 570 nm에서 측정한 후 평균값을 계산하였다.
- 이에 본 연구는 paraquat 중독 환자에서 항산화 치료에 대한 기초 자료로서 사람의 말초 혈액에서 paraquat 독성에 대한 세포 파괴 정도(cytotoxicity)를 측정하였다. 또한 이 세포독성에 대하여 vitamin C와 deferoxamine의 항산화 효과를 평가하고자 자유라디칼(free radical) 생성 양과 비례하는 지질과산화의 최종 산물인 malondialde- hyde(이하 MDA)를 측정하였으며, 자유라디칼의 제거에 관여하는 항산화계에 대하여 생체 내에서 자유라디칼을 불활성화시키는데 중요한 항산화효소인 superoxide dismutase(이하 SOD)활성도와 비 효소계 항산화물질로 총 항산화제 (total antioxidant status, 이하 TAS) 의 양을 측정하였다.
- 전혈 1 ml를 10% RPMI 1640 배지 5 ml에 분주하여 각 군에 해당하는 시약 처리를 한 뒤 5% CO2, 37℃ 세포배 양기에서 배양한 다음 각 군의 항산화 효과에 대한 분석을 다음의 방법으로 실시하였다.
- 지질과산화의 정도를 알아보기 위한 MDA의 측정은 상품화 된 BIOXYTECH® kit (MDA-586™, OXIS International Inc, USA)를 이용하여 측정하였다가
대상 데이터
- 건강한 성인 10 명(남자 5명, 여자 5명)을 대상으로 하여 동의서를 작성한 후 Sodium-Heparin tube 에 말초혈액 20 ml를 채취하여 10 ml는 세포독성 측정에 이용하고 나머지 10 mle 항산화 효과 측정에 이용하였다.
- 실험군을 다음과 같이 총 6개의 군으로 나누어 각 군마 다 10개씩 말초혈액을 배정하여 실험에 이용하였다.
데이터처리
- 0을 이용하여 범주 형 자료인 비연속형 변수의 분석은 카이제곱 검정을 시행하였으며, 연속형 변수들의 비교는 paired t-test 또는 Wilcoxon signed rank test와 일원분산분석 (one-way ANOVA)및 Tukey 교차 검정을 시행하였다. 각 측정치의 값은 평균 土 표준편차로 표시하였으며 p값이 0.05 미만인 경우를 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
- 통계학적 검증은 SPSS 프로그램 11.0을 이용하여 범주 형 자료인 비연속형 변수의 분석은 카이제곱 검정을 시행하였으며, 연속형 변수들의 비교는 paired t-test 또는 Wilcoxon signed rank test와 일원분산분석 (one-way ANOVA)및 Tukey 교차 검정을 시행하였다. 각 측정치의 값은 평균 土 표준편차로 표시하였으며 p값이 0.
이론/모형
- CellTker 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega Corp, USA)를 이용하여 각 군에서 배양된 세포의 세포독성을 Microculture Tetrazolium 법 (MTT assay) 에 의해 micro plate reader로 흡광도를 wavelength 570 nm에서 측정하였다(1).
- 총 항산화능에 대한 측정은 상품화된 TAS kit® (ABTS®, Randox Lab. Ltd, UK)를 사용하였으며 ABTS®(2, 2 Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]) 억제법을 이용하여여 Hitachi® 917 (Hitachi Ltd, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
성능/효과
- Paraquat의 세포독성에 대한 vitamin C와 deferoxam- ine의 항산화 효과를 측정한 결과 세포활성도에 있어서는 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여한 군에서 가장 좋은 결과를 나타냈다. MDA 측정을 제외한 나머지 SOD 활성도 및 총 항산화능 지표 측정에 있어서 항산화 효과는 deferoxamine을 먼저 투여하고 vita- min C를 나중에 투여한 군에서 가장 좋은 결과를 나타냈으며 SOD의 경우 항산화제의 단독 투여 및 병합 투여와 그 활성도는 무관하였으나 총 항산화능의 경우 두 가지 항산화제를 병합하여 투여했을 때 더 좋은 효과를 나타냈다. 마찬가지로 MDA 측정에서도 한 가지 항산화제만 투여하였을 때보다 두 가지를 병합하여 투여한 경우에 더 좋은 항산화 효과를 나타냈으나 항산화제의 투여 순서와는 무관하였다.
- Paraquat의 세포독성에 대한 vitamin C와 deferoxam- ine의 항산화 효과를 측정한 결과 세포활성도에 있어서는 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여한 군에서 가장 좋은 결과를 나타냈다. MDA 측정을 제외한 나머지 SOD 활성도 및 총 항산화능 지표 측정에 있어서 항산화 효과는 deferoxamine을 먼저 투여하고 vita- min C를 나중에 투여한 군에서 가장 좋은 결과를 나타냈으며 SOD의 경우 항산화제의 단독 투여 및 병합 투여와 그 활성도는 무관하였으나 총 항산화능의 경우 두 가지 항산화제를 병합하여 투여했을 때 더 좋은 효과를 나타냈다.
- 2). Vitamin C (PV 군)와 deferoxamine (PD 군)을 단독으로 투여한 두 군 사이에는 통계적으로 차이가 없었으나 두 가지 항산 화제를 함께 투여한 군에서 단독 투여군에 비해 통계적으로 유의하게 세포활성도가 증가하였다(PV 군-PDV 군; p=0.020, PD군-PDV 군; p=0.032). 또한 두 가지 항산화 제의 투여 순서를 달리한 경우 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여하였던 PDV군(1.
- 각 군에서 측정된 MDA 양은 C 군 5.71 + 1.41 /zmol/L 에서 paraquat 투여 후 6.78 + 0.93 ㎛ol/L (P 군)로 통 계적으로 유의하게 증가하였다(p=0.003, Fig. 3). 각각의 항산화제를 투여 한 후 PV 군 3.
- 각 군에서 측정된 세포활성도는 C군에서 0.878±0.139 이었으며, P군에서 0.771 ±0.143 (p〈0.0001)로 세포활성 도가 감소했다가 각각 PV 군 0.902±0.216 (p=0.001), PD 군 0.896±0.153 (p=0.019), PVD 군 0.888±0.152 (p <0.0001), PDV 군 1.077±0.121 (p=0.002)로 항산화제를 투여한 군에서 paraquat만 투여한 군에 비해 통계적으로 유의하게 세포활성도가 증가하였다(Fig. 2). Vitamin C (PV 군)와 deferoxamine (PD 군)을 단독으로 투여한 두 군 사이에는 통계적으로 차이가 없었으나 두 가지 항산 화제를 함께 투여한 군에서 단독 투여군에 비해 통계적으로 유의하게 세포활성도가 증가하였다(PV 군-PDV 군; p=0.
- 각 군에서 측정된 혈액 내 SOD양은 각각 C군에서 1259.9+171.7 zemol/L, P 군 1419.9±265.9 /emol/L, PV 군 1369.9+145.7 mol/L, PD 군 1431.9±451.8 mol/L, PVD 군 1299.8±264.8 /mol/L, PDV 군 1176.4 ±238.9 nol/L로 paraquat 투여 후 대조군에 비해 SOD 활성도가 증가하였다가 항산화제 투여 후 감소하는 양상을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 4). 항산화제를 투여한 군과의 비교에서는 P 군(1419.
- 3). 각각의 항산화제를 투여 한 후 PV 군 3.96±0.98 ㎛ol/L (p <0.0001), PD 군 4.92±1.50 emol/L (p=0.012), PVD 군 3.22±0.83 zemol/L (p<0.0001), PDV 군 3.42±0.95 zmol/L (p〈0.0001)로 모든 군에서 통계적으로 유의하게 MDA 양이 감소하였으나 사후 검정 결과 PVD 군에서 가장 좋은 결과를 나타냈다(p <0.0001). 두 가지 항산화제를 함께 투여한 군에서 단독 투여군에 비해 통계적으로 유의 하게 MDA 양이 감소하였으나(p=0.
- 0001). 두 가지 항산화제를 함께 투여한 군에서 단독 투여군에 비해 통계적으로 유의 하게 MDA 양이 감소하였으나(p=0.007), deferoxamine 과 vitamin C의 투여 순서에 따른 MDA양의 변화에는 통 계적 유의성이 없었다.
- 마찬가지로 MDA 측정에서도 한 가지 항산화제만 투여하였을 때보다 두 가지를 병합하여 투여한 경우에 더 좋은 항산화 효과를 나타냈으나 항산화제의 투여 순서와는 무관하였다. 따라서 이러한 결과로 paraquat에 의해 유발된 세포독성에 있어서 deferoxamine과 vitamin C가 효과적인 항산화제임을 알 수 있었으며, 또한 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여하는 방법을 사용 함으로써 이들 항산화제의 효과를 더욱 상승시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 032). 또한 두 가지 항산화 제의 투여 순서를 달리한 경우 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여하였던 PDV군(1.077±0.121)에서 vitamin C를 먼저 투여하고 deferoxamine을 나중에 투여하였던 PVD 군(0.888±0.152)에 비해 통계 적으로 유의하게 세포활성도가 증가하였다(p=0.018).
- 각 실험군에서 모든 조건을 동일하게 적용시켰음에도 불구하고 각 군의 항산화 효과를 측정하는 지표들 간의 결과가 일치되지 않는 것은 이것이 시험관내(in vitro) 연구이므로 생체 내와 같은 조건이 아니기 때문이라 추정된다. 또한 예비실험을 거쳐 각 시약의 용량 및 배양 시간 등을 결정하였으나, 이 예비실험은 배양된 림프구를 대상으로 세포독성을 측정하는 것으로 진행하였으므로 전혈을 대상으로 측정하는 총 MDA 양, SOD 활성도 및 총 항산화 능에 대한 결과 가운데 일부에서 상이한 결과가 도출됐을 것으로 사료된다. 한 예로 총 항산화능의 경우 대조군인 C 군(0.
- 05 ol/L) 사이에 총 항산화능의 차이가 없어 paraquat 100에 의해 혈액 내의 독성 유발이 잘 안된 결과라고 추정하였다. 마친가지로 vitamin C에 비해 deferoxamine의 항산화 효과가 훨씬 두드러지게 나타났 으며 단독 투여군에서 뿐만 아니라 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여하였던 PDV 군에서 그 효과나 가장 뛰어났고 deferoxamine을 단독 또는 vitamin C와 병용하여 투여한 군에서 다른 군과 비교해 볼 때 최대 약 10배 정도의 총 항산화능 증가가 나타났다. 또한 SOD는 세포 내에서 초기에 반응하여 paraquat와 같은 산화제의 공격 때 발생한 과산화 라디칼을 과산화수 소로 전환시켜 불활성화를 촉진하는 효소이며 MDA는 세포막의 지질 과산화 정도를 나타내는 지표인 반면 TAS는 혈중에 존재하는 항산화물질 전체에 대한 상태를 평가하는 지표이다.
- 본 연구에서 세포독성 정도는 항산화제의 단독 및 병합 투여에는 영향을 받지 않았으나 항산화제 투여 순서에는 영향을 받았으며 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여한 PDV 군(0.923±0.339)에서 PVD 군(1.112±0.458)보다 통계적으로 유의하게 세포활성도 가 증가함을 알 수 있었다. SOD의 활성도는 투여된 항산 화제의 종류 및 수와는 무관하였으나 투여 순서에 있어서 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C를 나중에 투여한 PDV 군(1176.
- 005) 로 모든 군에서 통계적으로 유의하게 총 항산화능이 증가 하였다. 사후 검정 결과 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C 를 나중에 투여하였던 PDV 군에서 가장 높은 총 항산화능을 나타냈다(p〈0.0001).
- Park 등 은 paraquat 중독을 치료하기 위해 deferoxamine을 하루에 3, 000 mg씩 7일간 투여한 환자에서 가역적인 시력 저하가 발생한 예를 보고하였다. 이러한 합병증은 deferoxamine 투여 중단 후 시력, 시야 및 시각유발전위 모두에서 호전되는 양상을 보였다. 이처 럼 deferoxaminee paraquat 중독 시에 효과적인 킬레이트화 제제로 사용될 수 있으나 시력저하를 초래할 수 있으므로 그 적절한 용량 을 결정하는데 어려움이 남아있다.
- 이것은 조건은 좀 다르지만 Jeong 등의 연구에서 고용량 의 vitamin C와 deferoxamine을 병합 투여했을 때 MDA 양 및 SOD 활성도 측정 에서 가장 좋은 효과를 보였던 결과와 비슷한 결과이다. 총 항산화능의 경우도 SOD 활성 도와 마찬가지로 PDV군에서 가장 좋은 총 항산화능을 나 타냈으며 두 가지 항산화제 가운데 deferoxamine의 효과가 더욱 큰 것으로 나타났다.
- 5). 항산화제를 투여한 군과의 비교에서 P 군에 비해 각각 PV 군 1.00±0.03 *mol/L(p=0.005), PD 군 9.01 ±0.24 * mol/L(p = 0.005), PVD 군 4.64± 3.98 n mol/L(p=0.005), PDV 군 9.41 ±0.2 emol/L(p=0.005) 로 모든 군에서 통계적으로 유의하게 총 항산화능이 증가 하였다. 사후 검정 결과 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C 를 나중에 투여하였던 PDV 군에서 가장 높은 총 항산화능을 나타냈다(p〈0.
- 4). 항산화제를 투여한 군과의 비교에서는 P 군(1419.9±265.9 mol/L) 에 비해 deferoxamine을 먼저 투여하고 vitamin C 를 나중에 투여하였던 PDV 군(1176.4±238.9 * mol/L)에서만 유일하게 통계적으로 유의하게 SOD 활성 도가 감소하였다 (p=0.017).
후속연구
- 이처 럼 deferoxaminee paraquat 중독 시에 효과적인 킬레이트화 제제로 사용될 수 있으나 시력저하를 초래할 수 있으므로 그 적절한 용량 을 결정하는데 어려움이 남아있다. 따라서 환자의 생존율 을 높이면서 이러한 합병증을 줄이기 위한 장기적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 앞서 살펴본바와 같이 deferoxamine0] vitamin C와 함께 paraquat 세포 독성에 대한 방어 효과가 있다면 앞으로 더 나아가 생체 조건(in vivo)에서의 연구를 통하여 각 장기의 세포독성 정도 측정과 함께 다른 여러가지 항산화제의 적정 용량 및 투여시기 결정, 부작용에 대한 연구가진 행되어야 할 것이다. 또한 paraquat 중독 환자의 경과와 항산화 요법 등의 치료 효과 및 예후 판정에 있어 말초혈액을 이용할 수 있는 방법을 모색할 수 있는 연구가 병행되어야 하겠다. 본 연구의 제한점으로는 시험관내(in vitro) 연구이므로 각 장기에 미치는 세포 독성에 대한 평가는 불가능하였으며 위에 언급한 바와 같이 항산화제의 적정 용량에 대한 모호성 등을 들 수 있겠다.
- 지금까지 보고된 여러 문헌 가운데 본 연구처럼 paraquat의 독성이 유발된 상태에서 세포독성 기전을 차 단할 목적으로 vitamin C와 deferoxamine을 함께 투여한 연구들은 있었지만 투여 순서를 달리하여 항산화 효과를 측정했던 경우는 없었다. 또한 여러 연구들에서 vitamin C의 전처치가 여러 손상에서 항산화 효과를 높일 수 있다고 그 효능을 입증하여 보고하고 있으나 임상에서 접하게 되는 paraquat 중독 환자에 경우는 vitamin C의 전 처치라는 상황을 적용시킬 수 없으므로 앞으로의 연구도 paraquat 중독이 유발된 상황에서 세포독성을 차단할 수 있는 방법을 개발하는 것으로 진행되어야 할 것이다. 앞서 살펴본바와 같이 deferoxamine0] vitamin C와 함께 paraquat 세포 독성에 대한 방어 효과가 있다면 앞으로 더 나아가 생체 조건(in vivo)에서의 연구를 통하여 각 장기의 세포독성 정도 측정과 함께 다른 여러가지 항산화제의 적정 용량 및 투여시기 결정, 부작용에 대한 연구가진 행되어야 할 것이다.
- 또한 paraquat 중독 환자의 경과와 항산화 요법 등의 치료 효과 및 예후 판정에 있어 말초혈액을 이용할 수 있는 방법을 모색할 수 있는 연구가 병행되어야 하겠다. 본 연구의 제한점으로는 시험관내(in vitro) 연구이므로 각 장기에 미치는 세포 독성에 대한 평가는 불가능하였으며 위에 언급한 바와 같이 항산화제의 적정 용량에 대한 모호성 등을 들 수 있겠다.
- 또한 여러 연구들에서 vitamin C의 전처치가 여러 손상에서 항산화 효과를 높일 수 있다고 그 효능을 입증하여 보고하고 있으나 임상에서 접하게 되는 paraquat 중독 환자에 경우는 vitamin C의 전 처치라는 상황을 적용시킬 수 없으므로 앞으로의 연구도 paraquat 중독이 유발된 상황에서 세포독성을 차단할 수 있는 방법을 개발하는 것으로 진행되어야 할 것이다. 앞서 살펴본바와 같이 deferoxamine0] vitamin C와 함께 paraquat 세포 독성에 대한 방어 효과가 있다면 앞으로 더 나아가 생체 조건(in vivo)에서의 연구를 통하여 각 장기의 세포독성 정도 측정과 함께 다른 여러가지 항산화제의 적정 용량 및 투여시기 결정, 부작용에 대한 연구가진 행되어야 할 것이다. 또한 paraquat 중독 환자의 경과와 항산화 요법 등의 치료 효과 및 예후 판정에 있어 말초혈액을 이용할 수 있는 방법을 모색할 수 있는 연구가 병행되어야 하겠다.
- 실제 임상에서 현재 paraquat 중독 시 뚜렷한 해독제나 치료제가 없는 실정이다. 이런 이유로 Paraquat 중독에서 vitamin C의 항산화 효과에 대한 연구는 많이 진행되어 왔으나 위에서 언급한 기전으로 인하여 deferoxamine 에 관한 연구가 함께 이루어져야만할 것이다.
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