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문제 정의
- 따라서, Fig. 2에서는 시험물질에 의한 대식세포의 TNF-α의 분비에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보았다.
- 본 연구는 Spragye-Dawely 계통의 암컷 랫드에서 종합비타민의 반복경구투여 독성평가와 대식세포 Raw 264.7세포의 NO 및 TNF-α assay를 통한 면역 활성을 평가하기 위해서 실시하였다.
- 본 연구에서는 시험물질에 의한 대식세포의 활성을 평가 하기 위하여 NO 및 TNF-α assay를 실시하였다.
- 이에 본 실험에서는 종합비타민을 사용하여 랫드의 여러 장기에 미치는 영향에 대하여 확인하였다. 종합비타민을 각각 투여한 랫드의 몸무게, 사료섭취량, 혈청생화학적 검사 및 조직학적 검사를 통해 종합비타민의 독성유무를 판단하였고 macrophage를 이용한 nitric oxide (NO) 및 TNF-α assay를 통한 결과를 바탕으로 면역증강 효능이 있는지 확인하였다.
제안 방법
- )를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite 검량선으로부터 세포가 분비하는 nitric oxide를 계산하였다.
- 간기능 검사를 하기 위해 간세포에서 생산되는 효소를 포함, 다양한 종류의 단백질과 이와 관련된 물질들을 측정하였다. ALT, AST는 간세포의 손상을 반영하는 지표로서 시험물질의 투여가 간 기능의 증진을 유도하는 것으로 판단된다.
- 사육환경 모니터링을 위하여 온도, 습도는 주기적으로 측정하였으며 기타 환경은 정기적으로 점검하여 일정한 표준치를 유지하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, 사육상자에는 시험유형, 시험번호, 시험물질, 군번호, 개체번호, 성별, 투여 용량, 실험기간 및 실험책임자를 기재한 개체식별카드를 부착하였다. 모든 실험동물은 매일 일정한 시간에 실험동물용 고형사료(Samtako Co.
- 따라서 Fig. 1에서는 시험물질을 50, 100 µg/mL 의 농도로 24시간 동안 처리한 후 대식세포의 활성화 단계에 따라 NO 분비의 발현이 어떻게 변화하는지 확인해 보았다.
- 7세포를 활성화시키는 것으로 사료된다. 또한 랫드에서 종합비타민의 독성평가를 위하여 랫드에 종합비타민을 0.24 g/kg, 1 g/kg 그리고 2 g/kg을 4주 동안 경구투여를 하였다. 종합비타민의 안전성을 확인하기 위해 다음과 같은 관찰 및 검사를 하였다.
- 일반증상 관찰은 모든 실험동물에 대하여 시험기간 중 1일 1회 실시하였고, 일반 임상증상 항목으로써 anorexia, salivation, diarrhea, vomiting, polyuria, anuria, fecal change 의 정도를 기록하였다. 또한 안과학적 검사는 랫드에서 투 여기간 중 각 군당 5마리씩의 동물에 대하여 육안 및 검안경을 이용한 안과학적 검사를 실시하였다.
- 모든 동물에 대하여 시험개시일로부터 시험종료일까지 매주 1회 체중을 측정하였다. 사육상자별로 당일 급여 및 급수총량과 익일 잔량의 차를 시험개시 후 매주 1회 측정 하여 일일 사료섭취량 및 음수섭취량으로 하였다.
- 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, 사육상자에는 시험유형, 시험번호, 시험물질, 군번호, 개체번호, 성별, 투여 용량, 실험기간 및 실험책임자를 기재한 개체식별카드를 부착하였다. 모든 실험동물은 매일 일정한 시간에 실험동물용 고형사료(Samtako Co., O San, Korea)와 음수를 급여하여 자유 섭취토록 하였다.
- 부검 전에 모든 실험동물에 대하여 채혈을 실시하였다. 혈청 생화학적 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심분리(3000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 혈청자동분석기(BS-400, MINDRAY, China) 를 이용하여 총 단백(total protein), 총 빌리루빈(total bilirubin), 혈액뇨소질소(Blood urea nitrogen ; BUN), CRE (creatinine), 아스파르테이트 아미노전이효소(aspartate transaminase ; AST), 알라닌 아미노전이효소(alanine transaminase; ALT), 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphate ; ALP), 총 콜레스테롤(total cholesterol)을 측정하였다.
- 모든 동물에 대하여 시험개시일로부터 시험종료일까지 매주 1회 체중을 측정하였다. 사육상자별로 당일 급여 및 급수총량과 익일 잔량의 차를 시험개시 후 매주 1회 측정 하여 일일 사료섭취량 및 음수섭취량으로 하였다.
- 실험기간 중 사육실 환경조건은 실내온도 24 ± 3oC, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소등), 조도는 150~200 Lux로 유지하였다. 사육환경 모니터링을 위하여 온도, 습도는 주기적으로 측정하였으며 기타 환경은 정기적으로 점검하여 일정한 표준치를 유지하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, 사육상자에는 시험유형, 시험번호, 시험물질, 군번호, 개체번호, 성별, 투여 용량, 실험기간 및 실험책임자를 기재한 개체식별카드를 부착하였다.
- (Seongnam, Gyeonggi do, Korea) 에서 구입하여 2주간에 걸쳐 환경적응을 위한 예비사육을 실시하였으며, 예비사육기간동안 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하여 20마리를 선별하였다. 선별된 동물의 난괴법(randomized block design)에 의해 각 군별로 5마리씩 구성하였으며, 군분리시 군평균 체중 및 군표준편차를 계산하여 균등성 여부를 확인하였다. 실험기간 중 사육실 환경조건은 실내온도 24 ± 3oC, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소등), 조도는 150~200 Lux로 유지하였다.
- 시험군의 구성은 동물전용 반려동물 전문영양제 펫튼 헬스케어7을 distilled water에 용해시켜 저용량군(0.24 g/kg), 중간용량군(1 g/kg), 고용량군(2 g/kg)의 용량으로 암컷 SD rat에 경구투여하였고, 용매 대조군에서는 D.W를 통일하게 투여하였다. 시험물질의 제조는 랫드의 하루 사료섭취량을 기초로 계산하여 체중칙량 직전에 제조하여 투여하였다.
- W를 통일하게 투여하였다. 시험물질의 제조는 랫드의 하루 사료섭취량을 기초로 계산하여 체중칙량 직전에 제조하여 투여하였다. 시험물질의 투여는 4주 동안 주 5회(월~금) 일정한 시간에 (10:00) 경구투여하였다.
- 시험물질의 제조는 랫드의 하루 사료섭취량을 기초로 계산하여 체중칙량 직전에 제조하여 투여하였다. 시험물질의 투여는 4주 동안 주 5회(월~금) 일정한 시간에 (10:00) 경구투여하였다.
- 일반증상 관찰은 모든 실험동물에 대하여 시험기간 중 1일 1회 실시하였고, 일반 임상증상 항목으로써 anorexia, salivation, diarrhea, vomiting, polyuria, anuria, fecal change 의 정도를 기록하였다. 또한 안과학적 검사는 랫드에서 투 여기간 중 각 군당 5마리씩의 동물에 대하여 육안 및 검안경을 이용한 안과학적 검사를 실시하였다.
- 장기 무게를 조사하기 위하여 실험 종료시 모든 시험동물을 해부하여 간, 신장(좌,우), 폐, 비장, 심장, 부신(좌,우), 난소(좌,우), 뇌를 적출하여 ice-cold physiological saline (0.9% NaCl)에 혈액과 체액을 거즈로 제거한 후 실물 중량을 측정하였다.
- 장기중량 측정이 끝난 모든 장기를 10% 중성 포르말린액에 고정시켰고 2주간 충분한 고정을 거친 모든 장기조직은 파라핀 포매기(Shandon Inc, USA)에 포매하여 마이크로톰(Shacon Inc, USA)으로 5 µm 절편을 만들어 hematoxylin & Eosin 염색을 하여 광학현 미경(× 200)으로 관찰하였다.
- 전해질자동분석 장치(EAE electrolyres, Medica, USA)를 이용하여 sodium (Na+ ), potassium (K+ ), chloride (Cl−) 농도를 측정하였다.
- 종합비타민을 각각 투여한 랫드의 몸무게, 사료섭취량, 혈청생화학적 검사 및 조직학적 검사를 통해 종합비타민의 독성유무를 판단하였고 macrophage를 이용한 nitric oxide (NO) 및 TNF-α assay를 통한 결과를 바탕으로 면역증강 효능이 있는지 확인하였다.
- 종합비타민을 대식세포의 활성능을 측정하기 위해 Raw 264.7 세포에서 NO와 TNF-α의 생성을 측정하였다.
- 부검 전에 모든 실험동물에 대하여 채혈을 실시하였다. 혈청 생화학적 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심분리(3000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 혈청자동분석기(BS-400, MINDRAY, China) 를 이용하여 총 단백(total protein), 총 빌리루빈(total bilirubin), 혈액뇨소질소(Blood urea nitrogen ; BUN), CRE (creatinine), 아스파르테이트 아미노전이효소(aspartate transaminase ; AST), 알라닌 아미노전이효소(alanine transaminase; ALT), 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphate ; ALP), 총 콜레스테롤(total cholesterol)을 측정하였다. 전해질자동분석 장치(EAE electrolyres, Medica, USA)를 이용하여 sodium (Na+ ), potassium (K+ ), chloride (Cl−) 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- 7 세포주를 사용하였다. Raw 264.7대식세포는 DMEM (Hyclone Leboratoris Inc., Logan, UT, USA)에 10% fetal bovine serum, 1% streptomycin/penicillin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 사용하여 37o C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 본 연구에서는 (주)우리가제약에서 제공한 종합비타민을 시험에 사용하였다. 원료약품 및 분량으로는 본제 1정(300 mg) 중 비타민 A (Vitamin A)가 500 IU, 비타민 D3 (Cholecalciferol)가 100 IU, 비타민 E (Tochopherol acetate) 는 0.
- 본 연구에서는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받은 RAW 264.7 세포주를 사용하였다. Raw 264.
- 실험동물로는 4주령의 Sprague-Dawely계통의 암컷 랫드 25마리를 Orient-Bio Inc. (Seongnam, Gyeonggi do, Korea) 에서 구입하여 2주간에 걸쳐 환경적응을 위한 예비사육을 실시하였으며, 예비사육기간동안 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하여 20마리를 선별하였다. 선별된 동물의 난괴법(randomized block design)에 의해 각 군별로 5마리씩 구성하였으며, 군분리시 군평균 체중 및 군표준편차를 계산하여 균등성 여부를 확인하였다.
데이터처리
- 4주간 반복 투여시험에서 얻은 측정치의 통계학적 분석은 통계처리 computer program인 SAS (Statistical Analysis System)를 이용하여 등분산 검정 후 one-way ANOVA에서 유의한 F값이 관찰되는 항목에 대하여 대조군과 각 투여군 사이에 유의수준 p < 0.05로 Dunnett’s t-test를 이용 하여 비교하였다.
- 또한, 병리조직학적으로 관찰된 병변의 발생빈도는 χ2 (Chi-square)검정을 하였다.
- 모든 실험결과는 평균치와 표준오차(mean ± SE)를 사용 하여 나타내고 각 군간 비교는 one-way ANOVA에 이은 t-test 분석을 실시하였다.
이론/모형
- NO assay는 CAYMAN (Denver, CO, USA)의 NO kit를 사용하였다. Raw 264.
- TNF-α assay는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)의 TNFα kit를 사용하였다.
- 전해질자동분석 장치(EAE electrolyres, Medica, USA)를 이용하여 sodium (Na+ ), potassium (K+ ), chloride (Cl−) 농도를 측정하였다. 혈청생화학적 검사는 ㈜ 네오딘벳랩에 의뢰하여 측정하였다.
성능/효과
- 4주간 반복투여독성시험을 진행하는 동안 대조군 및 투여군 모두에서 시험물질에 의한 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 3). 투여 전 군분리 결과 체중은 대조군 133.
- 식품의약품안전청의 독성시험기준을 참고하여 암컷 랫 드에서의 반복 투여독성시험에서 전 시험기간동안 매일 일회씩 임상증상을 관찰한 결과 모든 투여군에서 대조군과 비교하였을 때 시험물질 투여로 인한 임상증상은 관찰 되지 않았다(data not shown). 5주간의 실험기간 동안 대조군을 포함한 모든 투여군에서 별다른 임상증상은 관찰 되지 않았고 폐사개체도 없었다.
- 부검시 적출한 랫드의 내부장기의 중량을 측정한 결과, 상대장기중량비에 있어서 투여군과 대조군을 비교하였을때 일부 장기에서 유의적인 차이를 나타냈다(Table 2). Liver는 고용량군에서 유의적인 차이를 보였고 spleen은 중간용량과 고용량에서 유의적인 차이를 보였으며 heart도 모든 시험물질 투여군에서 대조군에 비하여 통계학적으로 유의적인 차이를 보였으나, 모두 정상 범위 내에서의 변화를 보였다. Ovary (L,R), kidney (L,R) 또한 시험물질 투여군에서 유의적인 차이를 보였으나 용량의존성을 보이지 않았으므로 시험물질에 기인된 변화는 아닌 것으로 사료된다.
- 1에서는 시험물질을 50, 100 µg/mL 의 농도로 24시간 동안 처리한 후 대식세포의 활성화 단계에 따라 NO 분비의 발현이 어떻게 변화하는지 확인해 보았다. NO의 분비는 농도의존적으로 증가하였으며, 시험물질 처치군에서 모두 유의적인 차이를 나타내었다. 이는 종합비타민 처치가 NO 생성량 증가에 영향을 끼칠 수 있다고 사료된다.
- 종합비타민의 안전성을 확인하기 위해 다음과 같은 관찰 및 검사를 하였다. 검사항목으로는 체중과 사료 섭취량, 임상증상, 혈청생화학적 검사를 관찰한 결과 대조군과 투여군을 비교 시 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 따라서 종합비타민은 생리대사에 무해하며 면역증강의 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 시험물질 저용량군에서는 Cl에서 유의 적인 차이를 보였으며, 중간용량에서는 T-protein, AST, ALP, Na, K, Cl에서 유의적인 차이를 보였다. 고용량군에서는 T-protein, AST, Na, K, Cl에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다. ALP는 중간용량군에서는 대조군에 비하여 유의적인 차이를 보였지만 다른 시험물질 투여군에서 용량의존성이 인정되지 않아 시험물질 투여로 인한 현상으로는 여겨지지 않는다.
- 검사항목으로는 체중과 사료 섭취량, 임상증상, 혈청생화학적 검사를 관찰한 결과 대조군과 투여군을 비교 시 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 따라서 종합비타민은 생리대사에 무해하며 면역증강의 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 부검시 적출한 랫드의 내부장기의 중량을 측정한 결과, 상대장기중량비에 있어서 투여군과 대조군을 비교하였을때 일부 장기에서 유의적인 차이를 나타냈다(Table 2). Liver는 고용량군에서 유의적인 차이를 보였고 spleen은 중간용량과 고용량에서 유의적인 차이를 보였으며 heart도 모든 시험물질 투여군에서 대조군에 비하여 통계학적으로 유의적인 차이를 보였으나, 모두 정상 범위 내에서의 변화를 보였다.
- 시험 마지막 주인 4주차 체중은 대조군 175.50 ±4.09 g, 저용량군 179.00 ± 5.96 g, 중간용량군 178.00 ± 2.86 g 그리고 고용량군 181.75 ± 5.07 g으로 군에 따른 체중 증가량이 크게 차이나지 않고 거의 유사한 증가량을 보이는 것을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 4). 시험결과에 있어서 모든 시험군 및 대조군에서 별다른 임상증상과 체중변화 그리고 사료섭취량은 관찰되지 않았 으며, 폐사 및 빈사 동물은 시험 전기간을 통하여 관찰되지 않았다.
- 시험기간 중 시험물질 대조군, 저용량군, 중간용량군, 고용량군의 동물 당 평균 일일 사료 섭취량은 16.11 ± 0.74 g, 16.10 ± 0.62 g, 15.74 ±0.69 g, 16.73 ± 0.72 g이었다(data not shown).
- 부검시의 혈청생화학적 검사에 있어서 일부의 항목에서 시험물질 투여군은 대조군에 비하여 유의성 있는 변화를나타냈다(Table 1). 시험물질 저용량군에서는 Cl에서 유의 적인 차이를 보였으며, 중간용량에서는 T-protein, AST, ALP, Na, K, Cl에서 유의적인 차이를 보였다. 고용량군에서는 T-protein, AST, Na, K, Cl에서 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였다.
- 시험종료 후 부검하여 모든 생존동물의 장기를 육안 검사한 결과 모든 시험군에서 시험물질 투여에 기인한 이상 소견은 관찰되지 않았다.
- 식품의약품안전청의 독성시험기준을 참고하여 암컷 랫 드에서의 반복 투여독성시험에서 전 시험기간동안 매일 일회씩 임상증상을 관찰한 결과 모든 투여군에서 대조군과 비교하였을 때 시험물질 투여로 인한 임상증상은 관찰 되지 않았다(data not shown). 5주간의 실험기간 동안 대조군을 포함한 모든 투여군에서 별다른 임상증상은 관찰 되지 않았고 폐사개체도 없었다.
- 종합비타민을 대식세포에 24시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 NO와 TNF-α가 유의적으로 상승하였다. 이 결과 종합비타민이 대식세포인 Raw 264.7세포를 활성화시키는 것으로 사료된다. 또한 랫드에서 종합비타민의 독성평가를 위하여 랫드에 종합비타민을 0.
- 이상의 결과로부터 동물전용 반려동물 전문영양제 펫튼 헬스케어는 0.24 g/kg, 1 g/kg, 2 g/kg 수준으로 4주간 경구 투여 시 유의할만한 독성이 유발되지 않았다.
- 일부 혈청 생화학적인 수치에서 유의차가 인정되었으며 T-protein의 증가는 간세포의 손상이나 자가 면역성 질환을 의심할 수 있으며 K는 당을 에너지로 전환하며 세포내 삼투질 농도를 조절하고 수소이온과 세포교환을 통해 산-염기 균형 유지에 도움을 주는 전해질로써 시험물질 투여군에서 용량에 따라 K이 감소하고 T-protein이 증가하는 경향을 보였으나 이는 정상 범위 내에서의 변화로써 시험 물질에 의한 영향을 아닌 것으로 사료된다.
- 종합비타민을 대식세포에 24시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 NO와 TNF-α가 유의적으로 상승하였다.
- 투여 전 군분리 결과 체중은 대조군 133.25 ± 1.80, 저용량군 133.00 ± 1.58 g, 중간용량군 132.50 ± 1.66 g, 고용량군 132.00 ± 1.47 g으로 크게 차이가 나지 않았다.
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