Objective The objective of this study was to investigate the antioxidative effects of Puerariae Radix extract. Method Total antioxidant capacity (TAC), Total antioxidant response (TAR), Total phenolic content, Reactive oxygen species (ROS), 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavengin...
Objective The objective of this study was to investigate the antioxidative effects of Puerariae Radix extract. Method Total antioxidant capacity (TAC), Total antioxidant response (TAR), Total phenolic content, Reactive oxygen species (ROS), 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activities, lipid peroxidation were examined. Result Total antioxidant status was examined by total antioxidant capacity(TAC) and total antioxidant response(TAR) against potent free radical reactions. TAC and TAR of Puerariae Radix extract at the concentration of 5 mg/ml were 2.02 and 1.50 mM Trolox equivalents, respectively. Total phenolic content of Puerariae Radix extract at the concentration of 5 mg/ml was 2.29 mM gallic acid equivalent. Concentration of Puerariae Radix extract at which DPPH radical scavenging activity was inhibited by 50% was 5.91 mg/ml as compared to 100% by pyrogallol solution as a reference. The inhibitory effect of the extract on lipid peroxidation was examined using rat liver mitochondria induced by FeSO4/ascorbic acid. Puerariae Radix extract at the concentration of 1 mg/ml slightly but significantly decreased TBARS concentration. The extract further prevented lipid peroxidation in a dose-dependent manner. The effect of Puerariae Radix extract on reactive oxygen species (ROS) generation was examined using cell-free system induced by hydrogen peroxide/FeSO4. Addition of 1 mg/ml of Puerariae Radix extract significantly reduced dichloroflurescein (DCF) fluorescence. The extract caused concentration-dependent attenuation of the increase in DCF fluorescence, indicating that the extract significantly prevented ROS generation in vitro. Thus antioxidant effects of Puerariae Radix extract seem to be due to, at least in part, the prevention from free radicals-induced oxidation, followed by inhibition of lipid peroxidation. Conclusion As a result, Puerariae Radix seems to have antioxitative effect and antioxidant compount.
Objective The objective of this study was to investigate the antioxidative effects of Puerariae Radix extract. Method Total antioxidant capacity (TAC), Total antioxidant response (TAR), Total phenolic content, Reactive oxygen species (ROS), 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activities, lipid peroxidation were examined. Result Total antioxidant status was examined by total antioxidant capacity(TAC) and total antioxidant response(TAR) against potent free radical reactions. TAC and TAR of Puerariae Radix extract at the concentration of 5 mg/ml were 2.02 and 1.50 mM Trolox equivalents, respectively. Total phenolic content of Puerariae Radix extract at the concentration of 5 mg/ml was 2.29 mM gallic acid equivalent. Concentration of Puerariae Radix extract at which DPPH radical scavenging activity was inhibited by 50% was 5.91 mg/ml as compared to 100% by pyrogallol solution as a reference. The inhibitory effect of the extract on lipid peroxidation was examined using rat liver mitochondria induced by FeSO4/ascorbic acid. Puerariae Radix extract at the concentration of 1 mg/ml slightly but significantly decreased TBARS concentration. The extract further prevented lipid peroxidation in a dose-dependent manner. The effect of Puerariae Radix extract on reactive oxygen species (ROS) generation was examined using cell-free system induced by hydrogen peroxide/FeSO4. Addition of 1 mg/ml of Puerariae Radix extract significantly reduced dichloroflurescein (DCF) fluorescence. The extract caused concentration-dependent attenuation of the increase in DCF fluorescence, indicating that the extract significantly prevented ROS generation in vitro. Thus antioxidant effects of Puerariae Radix extract seem to be due to, at least in part, the prevention from free radicals-induced oxidation, followed by inhibition of lipid peroxidation. Conclusion As a result, Puerariae Radix seems to have antioxitative effect and antioxidant compount.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 갈근 추출물의 항산화작용을 규명하기 위해 free radical의 소거능력을 검증하는 방법 중에서 다용되고 있는 총 항산화능(TAC), 총 항산화 반응 (TAR), DPPH 자유유리기 소거작용에 대한 실험 및 직접적 인 항산화능력 측정방법으로 TBARS 분석을 통한 갈근의 지질과산화 억제효과 및 활성산소종 억제효과를 살펴보고, 그 외 천연물 항산화물질인 페놀성 화합물의 함량을측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
미토콘드리아는 과산화 연구에 주요한 모델로 사용되고있으며, 본 연구에서는 랫드 간 미토콘드리아(0.5 mg 단백질/M)를 이용하여 추출물의 지질과산화에 미치는 영향을조사하였다. 지질과산화는 hydroxyl radical을 생성하는 FeSO4/ascorbic acid로 유발시켰으며, TBARS 농도를측정함으로써 결정하였다.
Rat liver mitochondria were incubated with FeSO4/ascorbic acid in the absence or presence of various concentrations of Puerariae Radix extract. Lipid peroxidation was determined by measuring the release of TBARS. Each bar represents the mean±SEM of duplicate determinations.
TBARS 농도 측정을 위해 0, 16.2, 8.1, 4.05, 2.025, 1.013 및 0.506 uM의 1, 1, 3, 3, -tetraethoxypropane을표준시 약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
oxidant capacity(TAC), Total antioxidant response(TAR) 등을 측정하고, 기존의 연구에서 시행되었던 1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 소거활성, 지질과산화 억제효과 및 Reactive oxygen species(ROS) 억제효과를 측정하고 천연물 항산화물질인페놀성 화합물(Total phenolic content)의 함량을 측정하였으며 그 결과는 다음과 같다.
갈근의 항산화 효능에 대한 주요 연구방법으로 대부분효소계의 활성을 측정한 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSH-px), catalase, glutathione reductase의 활성 측정방법을 사용하였다. 이는 직접적인 free radical의 소거능력을 측정하는 것은아니다.
+는 탈색되며, 이러한 색 변화반응의 결과는 660 rnn에서의 흡광도로 조사하였다. 시료 추출물의 TAC 측정을 위해 0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.5, 2.25 및 3 mM의 Trolox를 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
이러한 반응은 444 nm에서의 흡광도로 조사하였다. 시료 추출물의 TAR 측정을 위해 0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.5, 2.25 및 3 mM의 Trolox를 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다. TAR 활성은 mM Trolox equivalent로 표기하였다.
시료 추출물의 총 phenolic 함량 측정을 위해 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 1.67 및 2.5 mM의 gallic acid를 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
5 mg 단백질/M)를 이용하여 추출물의 지질과산화에 미치는 영향을조사하였다. 지질과산화는 hydroxyl radical을 생성하는 FeSO4/ascorbic acid로 유발시켰으며, TBARS 농도를측정함으로써 결정하였다.
추출물의 지질과산화 억제 효과는 간 미토콘드리아 배양액의 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 농도를 측정함으로써 결정하였다. 간 미토콘드리아(0.
특히 연구방법이 대부분 효소계의 활성을 측정한 superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, glutathione reductase의 활성 측정방법을 사용하였다. 그러나 이 방법은 항산화와 관련된 효소를 통해항산화 능력을 측정하는 방법으로 비효소적 반응을 통한 free radical의 소거능력을 검증하기에는 부족하였다.
대상 데이터
(주)대한바이오링크로부터 구입한 6주령 수컷 Sprague-Dawley 랫드를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고, 1주일의 적응기간을 거친 다음 간을 절제한 후 Hovius 등34)의 방법에 따라 미토콘드리아를 분리하였다.
葛根(Puerariae Radix)은 정선된 제품을 경원대학교부속한방병원에서 구입하여 본 연구의 시료로 사용하였다. 100g의 갈근을 수침한 후 분쇄한 시료 99.
데이터처리
추출물 농도별 TBARS 농도와 DCF의 형광도는 일원분산분석을 사용하여 조사하였으며, 농도별 평균값의 차이는 Duncan's multiple range test를 사용하여 p<0.05에서 유의성을 조사하였다.
이론/모형
미토콘드리아 배양액의 지질과산화는 Stacey와 Klaassen, "의 방법에 따라 excitation 파장 530 nm와 emission 파장 590 nm에서 형광도를 측정함으로써 결정하였다.
Cell-free system에서 1 uM H2O2와 10 uM FeSO4에의해 ROS를 생성하였다. DCF 형성에 따른 형광도 증가는 LeBel 등 )의 방법에 따라 excitation 파장 488 nm와 emission 파장 525 nm에서 2분 간격으로 10분간 측정하였다. 형광도 감소는 추출물 내 항산화물질에 의한 ROS 생성 억제를 나타낸다.
DPPH free radical 소거활성은 Malterud 등40)의 방법에 따라 측정하였다. DPPH 용액(45 ug/m methanol)을추출물과 혼합한 다음 515 nm에서 흡광도의 감소를 30초간격으로 5분간 측정하였다.
Free radical 반응에 대한 총 항산화능은 ferric reducing/antioxidant power assay(FRAP) 방법37)을 수정한 Erel38)의 방법에 따라 TAR을 측정함으로써 결정하였다. 산성 pH에서 무색의 환원형 o-dianisidinee Fenton 반응에 의해 생성된 hydroxyl radical(OH.
Total antioxidant status(총 항산화능)는 Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) 방법35)의 방법을 수정한 Erel36)의 방법에 따라 TAC를 측정하였다. 산성 pH에서 무색의 환원형 2, 2'-azinobis(3-ethylbenzo- thiazoline-6-sulfonate, ABTS)는 H2O2에 의해 청록색의 ABTS.
단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준시약으로 사용하여 Lowry 등43)의 방법에 따라 측정하였다.
랫드를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고, 1주일의 적응기간을 거친 다음 간을 절제한 후 Hovius 등34)의 방법에 따라 미토콘드리아를 분리하였다.
추출물 내 총 phenolic 함량은 gallic acid를 표준시약으로 사용하여, Singleton과 Orthofer의 방법39)에 따라 760 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
성능/효과
0.1 m/M 농도의 갈근 추출물의 TARe 0.4 mM Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 TAR도 비례적으로 증가하여 1, 5, 10 및 50 m/M 농도에서는 각각 0.69, 1.50, 2.33 및 3.04 mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 갈근 추출물은 농도 의존적으로 dianisidyl radical 소거활성을 나타내었다(Fig.
0.1 ㎎/㎖ 농도의 갈근 추출물의 총 phenolic 함량은 0.14 mM gallic acid equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 총 phenolic 함량도 비례적으로 증가하여 1, 2.5, 5 및 10 mg/㎖ 농도에서는 각각 0.73, 1.37, 2.29 및 3.21 mM gallic acid equivalent를 나타내었다(Fig. 3).
0.1 및 1 mg/M 농도의 갈근 추출물의 TARe 각각 0.69 및 0.4 mM Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 TAR도 비례적으로 증가하여 5, 10 및 50 mg/M 농도에서는 긱-각 1.50, 2.33 및 3.04 mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 갈근 추출물은 농도 의존적으로 dianisidyl radical 소거활성을 나타내었다(Fig.
0.1 및 1 ㎎/㎖ 농도의 갈근 추출물의 TAC는 0.13 및 0.63 mM Trolox equivalent이며 , 추출물 농도가 증가함에 따라 TAC도 비례적으로 증가하여 5, 10 및 50 mg/iM 농도에서는 각각 2.02, 2.76 및 3.81 mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 갈근 추출물은 농도 의존적으로 ABTS radical 소거활성을 나타내었다(Fig.
0.1, 1 mg/M 농도의 갈근 추출물의 TAC는 각각 0.13, 0.63 mM Trolox equivalent으로, 추출물 농도가 증가함에 따라 TAC도 비례적으로 증가하여 5, 10 및 50 mg/M 농도에서는 각각 2.02, 2.76 및 3.81 mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 갈근 추출물은 농도 의존적으로 ABTS radical 소거활성을 나타내었다(Fig.
추출물의 ROS 생성 억제에 미치는 효과는 1 mg/M 농도의 갈근 추출물 첨가에 따른 DCF 형광도가 0 및10분에 각각 395.7 및 484.4를 나타내어, 무첨가에 비해 DCF 형광도가 10분에서 유의적(p<0.05)으로 감소되었다.
갈근 추출물의 ROS 생성 억제에 미치는 효과는 1 mg/M 농도의 갈근 추출물 첨가에 따른 DCF 형광도가 0 및10분에 각각 395.7 및 484.4를 나타내어, 무첨가에 비해 DCF 형광도가 10분에서 유의적(p<0.05)으로 감소되었다.
이상의 실험결과 갈근은 유의한 항산화작용이 있는 것으로볼 수 있다.
15 g을 80% ethanol(HPLC-grade) 700 ㎖로 2번 추출한 뒤 evaporation시켰다. 최종적으로 동결건조기에서 회수된 19.75 g의 ethanol 추출물을 얻었으며, 회수율은 19.9% 로 나타났다. 확보된 갈근 추출물은 50 ㎎/㎖의 농도로 dH/O에 녹여 4℃에서 보관하면서 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
추출물 농도 1 ㎎/㎖의 radical 소거활성은 12.0%이었고, 농도가 증가할수록 소거활성도 증가하여 5 및 10, 50 mg/iM의 농도에서 radical 소거활성은 각각 42.3 및 82.3, 93.68 %로 관찰되었다. 추출물 농도와 free radical 소거활성 간의 회귀분석 결과 50%의 radical 소거활성에 필요한 갈근 추출물의 농도는 5.
추출물 농도가 증가함에 따라 TBARS 농도도 유의적으로 감소하여, 10 및 20 m/M 농도의 추출물 첨가는 지질과산화를 30.8(7.79 uM) 및 99% 정도(0.10 uM) 억제하였다(Fig. 5).
05)으로 감소시켰다. 추출물 농도가 증가함에 따라 TBARS 농도도 유의적으로 감소하여, 10 및 20 mg/M 농도의 추출물 첨가는 지질과산화를 30.8(7.79 uM) 및 99% 정도(0.10 uM) 억제하였다(Fig. 5).
68%로 관찰되었다. 추출물 농도와 free radical 소거활성 간의 회귀분석 결과 50%의 radical 소거활성 에 필요한 갈근 추출물의 농도는 5.91 mg/M으로 나타났다(Fig. 4).
68 %로 관찰되었다. 추출물 농도와 free radical 소거활성 간의 회귀분석 결과 50%의 radical 소거활성에 필요한 갈근 추출물의 농도는 5.91 ㎎/㎖으로 나타났다(Fig. 4).
추출물 첨가 농도가 증가함에 따라 DCF 형광도는 감소하였고, 10 mg/iM 농도의 추출물 첨가는 무첨가에 비해 0 및 10분에 각각 333.6 및 414.9로 감소되어 20 및 30%의 ROS 생성 억제를 나타내었다.
추출물 첨가 농도가 증가함에 따라 DCF 형광도는 감소하였고, 10 mg/iM 농도의 추출물 첨가는 무첨가에 비해 0 및 10분에 각각 333.6 및 414.9로 감소되어 20 및 30%의 ROS 생성 억제를 나타내었다.
후속연구
항산화 효과가 있음을 알 수 있다. 갈근은 항산화 효과뿐만 아니라 인체의 질병과 노화에 대한 다양한 효과가 있으므로 향후 지속적인 연구 및 개발이 필요할 것으로 사료된다.
참고문헌 (55)
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