목 적: 본 연구에서는 생리혈에 존재하는 탈락된 자궁내막조직에서의 자궁내막증 관련 유전자들의 발현 양상과 자궁내막증 병태생리와의 관련성을 살펴보고자 하였다. 연구방법: 자궁내막증으로 확진된 환자 (n=16)와 정상 대조군 (n=26)에서 생리주기 2$\sim$3일째 Wallace catheter로 채취한 생리혈로부터 탈락된 자궁내막조직을 분리하였다. 기존의 연구들에서 보고된 12종류의 자궁내막증 관련 유전자들의 mRNA 발현 양상을 semi-quantitative RT-PCR 방법으로 비교, 분석하였다. 결 과: 생리혈에서 분리한 탈락된 자궁내막조직은 조직학적 관찰을 통해 자궁내막조직임을 확인하였다. 총 12가지 종류의 자궁내막증 관련 유전자에 대한 RT-PCR 분석에서 telomerase, c-kit, aromatase등의 mRNA 발현이 관찰되지 않았다. 세포사멸 (apoptosis)과 관련성이 있는 fas, fas ligand, bcl-2, bax 유전자와 stem cell factor, ER-$\alpha$/$\beta$, endometriosis protein-I, secretory leukocyteprotease inhibitor 등의 mRNA 발현 양상은 자궁내막증으로 확진된 환자군과 대조군에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 결 론: 결론적으로 자궁내막증과 관련된 다양한 유전자들의 발현 양상을 생리혈에 존재하는 탈락된 자궁내막조직에서 분석하였지만 의미성이 있는 유전자를 동정하지는 못하였다. 이는 자궁내막조직의 생리학적 특징인 생리주기에 따른 유전자 발현의 역동적인 변화와 관련이 있을 것으로 생각된다.
목 적: 본 연구에서는 생리혈에 존재하는 탈락된 자궁내막조직에서의 자궁내막증 관련 유전자들의 발현 양상과 자궁내막증 병태생리와의 관련성을 살펴보고자 하였다. 연구방법: 자궁내막증으로 확진된 환자 (n=16)와 정상 대조군 (n=26)에서 생리주기 2$\sim$3일째 Wallace catheter로 채취한 생리혈로부터 탈락된 자궁내막조직을 분리하였다. 기존의 연구들에서 보고된 12종류의 자궁내막증 관련 유전자들의 mRNA 발현 양상을 semi-quantitative RT-PCR 방법으로 비교, 분석하였다. 결 과: 생리혈에서 분리한 탈락된 자궁내막조직은 조직학적 관찰을 통해 자궁내막조직임을 확인하였다. 총 12가지 종류의 자궁내막증 관련 유전자에 대한 RT-PCR 분석에서 telomerase, c-kit, aromatase등의 mRNA 발현이 관찰되지 않았다. 세포사멸 (apoptosis)과 관련성이 있는 fas, fas ligand, bcl-2, bax 유전자와 stem cell factor, ER-$\alpha$/$\beta$, endometriosis protein-I, secretory leukocyte protease inhibitor 등의 mRNA 발현 양상은 자궁내막증으로 확진된 환자군과 대조군에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 결 론: 결론적으로 자궁내막증과 관련된 다양한 유전자들의 발현 양상을 생리혈에 존재하는 탈락된 자궁내막조직에서 분석하였지만 의미성이 있는 유전자를 동정하지는 못하였다. 이는 자궁내막조직의 생리학적 특징인 생리주기에 따른 유전자 발현의 역동적인 변화와 관련이 있을 것으로 생각된다.
Objective: This study was performed to investigate the expressions of endometriosis related genes in shed endometrial tissues from menstrual blood of patients with or without endometriosis. Methods: The shed endometrial tissues were collected on 2$^{nd}$ or 3$^{rd}$ day of mens...
Objective: This study was performed to investigate the expressions of endometriosis related genes in shed endometrial tissues from menstrual blood of patients with or without endometriosis. Methods: The shed endometrial tissues were collected on 2$^{nd}$ or 3$^{rd}$ day of menstrual cycle with Wallace catheter in patients with endometriosis (n=16) and without endometriosis (n=26). The mRNA expressions of twelve kinds of endometriosis related genes were compared between two groups using semi-quantitative RT-PCR. Results: The collected shed endometrium was confirmed by histological observation. Expressions of telomerase, c-kit and aromatase mRNA were not detected by RT-PCR in shed endometrial tissues. The mRNA expressions of apoptosis related genes (fas, fas ligand, bcl-2, bax), stem cell factor, estrogen receptor-$\alpha$/$\alpha$, endometriosis protein-I and secretory leukocyte protease inhibitor gene were similar between shed endometrial tissues with endometriosis and without endometriosis. Conclusion: We could not find the difference of mRNA expressions of tested endometriosis related genes between shed endometrial tissues with or without endometriosis by semi-quantitative RT-PCR analysis. It may be related to the dynamical changes of gene expressions in the endometrium with menstrual cycle.
Objective: This study was performed to investigate the expressions of endometriosis related genes in shed endometrial tissues from menstrual blood of patients with or without endometriosis. Methods: The shed endometrial tissues were collected on 2$^{nd}$ or 3$^{rd}$ day of menstrual cycle with Wallace catheter in patients with endometriosis (n=16) and without endometriosis (n=26). The mRNA expressions of twelve kinds of endometriosis related genes were compared between two groups using semi-quantitative RT-PCR. Results: The collected shed endometrium was confirmed by histological observation. Expressions of telomerase, c-kit and aromatase mRNA were not detected by RT-PCR in shed endometrial tissues. The mRNA expressions of apoptosis related genes (fas, fas ligand, bcl-2, bax), stem cell factor, estrogen receptor-$\alpha$/$\alpha$, endometriosis protein-I and secretory leukocyte protease inhibitor gene were similar between shed endometrial tissues with endometriosis and without endometriosis. Conclusion: We could not find the difference of mRNA expressions of tested endometriosis related genes between shed endometrial tissues with or without endometriosis by semi-quantitative RT-PCR analysis. It may be related to the dynamical changes of gene expressions in the endometrium with menstrual cycle.
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문제 정의
본 연구에서는 생리혈에 존재하는 자궁내막조직에서 세포사멸, 세포증식 및 스테로이드 호르몬 관련 유전자와 자궁내막증 특이 유전자로 알려진 Endo-I과 SLPI 등의 발현 양상을 mRNA 수준에서 살펴보았으며, 이들 유전자의 발현을 정상 대조군과 비교하여 비침습적으로 자궁내막증을 진단하는데 있어 진단적 가치가 있는 유전자를 찾아보고자 하였다.
가설 설정
본 연구에서 저자들은 생리혈에 존재하는 자궁내막조직의 유전자 발현 양상이 자궁내막증의 병태생리와 관련성이 있을 것이라는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 증명하기 위해 자궁내막증으로 확진된 환자와 정상 대조군의 생리혈에 존재하는 탈락된 자궁내막조직에서 자궁내막증 관련 유전자의 발현 양상을 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법으로 비교, 분석하였다.
제안 방법
자궁내막증 관련 유전자들의 목록과 사용한 primers에 대한 '정보는 Table 1에 나타내었다. PCR 반응 조건은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 200 |iM dNTPs, 10 pmol primers, 1 U Taq polymerase (Boehringer Mannheim, Germany) 등이 포함된 25 uL의 반응액을 각각의 유전자에 대한 annealing temperature에서 30~35회의 중합반응을 실시하였다. 각각의 유전자에 대한 RT-PCR 후 10 jiL의 증폭 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 image analyzer (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 optical density를 즉정하였다.
5 mM MgCl2, 200 |iM dNTPs, 10 pmol primers, 1 U Taq polymerase (Boehringer Mannheim, Germany) 등이 포함된 25 uL의 반응액을 각각의 유전자에 대한 annealing temperature에서 30~35회의 중합반응을 실시하였다. 각각의 유전자에 대한 RT-PCR 후 10 jiL의 증폭 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 image analyzer (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 optical density를 즉정하였다. 유전자 발현 양상은 GAPDH를 internal control로 이용한 semi-quantitative 분석을 통해 비교하였다.
3. 자궁내막증 관련 유전자 발현 분석
분리한 total RNA의 양은 spectrophotometer를 이용하여 측정하였으며, 2 ug의 total RNA를 역전사 (reverse transcription, RT) 반응에 사용하였다. cDNA 를 합성하기 위한 역전사 반응의 조건은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 5 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 pmol oligo(dT)i2, 40 U RNAsin, 400 IU AMV reverse transcripase (Boehringer Mannheim, Germany) 등이 포함된 50 |iL의 반응액을 42℃에서 60분 동안 반응시키고, 95 ℃ 에서 10분 동안 효소를 불활성화시킨 후 4℃ 상태를 유지하였다.
생리 혈의 자궁내막조직에서 분리한 total mRNA 의 농도를 10 μg/mL로 일차적으로 보정하고, RT- PCR 후 GAPDH 발현양에 대하여 자궁내막증 관련 유전자들의 mRNA 발현 양상을 상대정량적인 semi-quantitative 방법으로 분석을 실시하였다. 전체적인 분석 결과는 Table 2에 나타내었다.
분리된 자궁내막조직은 phosphate-buffered saline (Gibco BRL, Grand Island, NY)로 세척한 후 1 mL의 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 침지하여 실험에 사용할 때까지 -70℃에서 냉동보관하였다. 시료의 일부를 분리하여 일반적인 조직학적 관찰을 통해 자궁내막조직 임을 확인하였다.
각각의 유전자에 대한 RT-PCR 후 10 jiL의 증폭 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 image analyzer (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 optical density를 즉정하였다. 유전자 발현 양상은 GAPDH를 internal control로 이용한 semi-quantitative 분석을 통해 비교하였다. 통계적인 분석은 Student's t-test를 이용하여 p 값이 0.
세웠다. 이러한 가설을 증명하기 위해 자궁내막증으로 확진된 환자와 정상 대조군의 생리혈에 존재하는 탈락된 자궁내막조직에서 자궁내막증 관련 유전자의 발현 양상을 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법으로 비교, 분석하였다.
진단복강경 검사에서 자궁내막증에 대한 병기는 revised American Society for Reproductive Medicine (1996) 분류를 이용하여 판정하였다. 자궁내막 시료는 생리 2~3일째 Wallace catheter로 자궁강에서 채취한 생리혈에서, 100 pm2 직경의 nylon mesh (Falcon 2360, Becton Dickinson, NJ)를 이용하여 생리혈 내에 존재하는 탈락된 자궁내막조직을 분리하였다. 분리된 자궁내막조직은 phosphate-buffered saline (Gibco BRL, Grand Island, NY)로 세척한 후 1 mL의 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 침지하여 실험에 사용할 때까지 -70℃에서 냉동보관하였다.
cDNA 를 합성하기 위한 역전사 반응의 조건은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 5 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 pmol oligo(dT)i2, 40 U RNAsin, 400 IU AMV reverse transcripase (Boehringer Mannheim, Germany) 등이 포함된 50 |iL의 반응액을 42℃에서 60분 동안 반응시키고, 95 ℃ 에서 10분 동안 효소를 불활성화시킨 후 4℃ 상태를 유지하였다. 합성된 cDNA 2 μL를이용하여 자궁내막증 관련 유전자들 (endometriosis related genes)에 대한 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 자궁내막증 관련 유전자들의 목록과 사용한 primers에 대한 '정보는 Table 1에 나타내었다.
대상 데이터
본 연구는 제일병원에 불임증을 주소로 내원하여 진단복강경을 시행한 환자들 가운데 자궁내막증으로 확진된 환자군 (n=16)과 자궁내막증을 동반하지 않은 대조군 (n=26)을 대상으로 수행하였다. 진단복강경 검사에서 자궁내막증에 대한 병기는 revised American Society for Reproductive Medicine (1996) 분류를 이용하여 판정하였다.
데이터처리
유전자 발현 양상은 GAPDH를 internal control로 이용한 semi-quantitative 분석을 통해 비교하였다. 통계적인 분석은 Student's t-test를 이용하여 p 값이 0.05 보다 작은 경우에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
수행하였다. 진단복강경 검사에서 자궁내막증에 대한 병기는 revised American Society for Reproductive Medicine (1996) 분류를 이용하여 판정하였다. 자궁내막 시료는 생리 2~3일째 Wallace catheter로 자궁강에서 채취한 생리혈에서, 100 pm2 직경의 nylon mesh (Falcon 2360, Becton Dickinson, NJ)를 이용하여 생리혈 내에 존재하는 탈락된 자궁내막조직을 분리하였다.
성능/효과
세포의 생존력에 영향을 주는 c-ldt ligand인 stem cell factor mRNA의 발현은 다소 낮게 관찰되었으나, 자궁내막증 환자군과 대조군에서 발현 양상이 유사하였다 (Table 2, Figure 2). 스테로이드 호르몬 관련 유전자인 #-a의 mRNA는 발현양의 차이는 다소 있었지만 모든 시료에서 발현이 관찰되었으나, ER-&는 71.4% (30/42)의 시료에서만 발현이 확인되었다. 자궁내막증 환자군의 75.
전체적인 분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 총 12가지 종류의 자궁내막증 관련 유전자에 대한 RT-PCR 분석에서 telomerase, c-kit, aromatase 등의 mRNA 발현이 관찰되지 않았다.
환자군과 대조군에서 생리 2~3일째 자궁 강으로부터 Wallace c* atheter 이용하여 72.4% (42/58)에서 성공적으로 생리혈을 채취하였으며, 생리혈의 양은 0.4-2.0 mL로 평균 0.8 mL이었다. 이러한 생리혈에서 분리한 자궁내막조직의 양은 0.
후속연구
또한, mRNA 수준에서의 특정 유전자 발현 양상의 차이를 semi-quantitative analysis 방법으로 확인하는 것은 쉽지 않을 것으로 생각된다. 따라서 이와 같은 mRNA 수준의 유전자 발현 양상에 대한 연구는 민감도가 우수한 real time RT-PCR 방법과 광범위한 유전자의 발현 양상을 비교할 수 있는 microarray 를 이용한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 상기 연구들과 더불어 생리혈에 존재하는 자궁내막조직이 복강 내로 유입된 후 나타나는 변화와 이러한 변화를 유발하는 복강 내의 환경적인 요인에 대한 연구가 병행되면 자궁내막증의 병인을 보다 명확하게 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
있다. 본 연구에서도 기존에 보고되어 있는 자궁내막증과 관련된 다양한 유전자의 발현 양상을 생리 혈에 존재하는 자궁내막조직에서 분석하였지만 의미있는 유전자를 동정하지는 못하였다. 이는 자궁내막조직의 생리학적 특징인 생리주기 증식기, 분비기 및 생리기에 따른 자궁내막의 변화와 각 시기에 유전자 발현의 차이가 있음을 고려해 볼 때, 생리 기의 탈락된 자궁내막조직 에서는 생리 과정에 필요한 유전자들의 발현이 높아지게 된다.
따라서 이와 같은 mRNA 수준의 유전자 발현 양상에 대한 연구는 민감도가 우수한 real time RT-PCR 방법과 광범위한 유전자의 발현 양상을 비교할 수 있는 microarray 를 이용한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 상기 연구들과 더불어 생리혈에 존재하는 자궁내막조직이 복강 내로 유입된 후 나타나는 변화와 이러한 변화를 유발하는 복강 내의 환경적인 요인에 대한 연구가 병행되면 자궁내막증의 병인을 보다 명확하게 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
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