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문제 정의
- 마지막으로, 유전자가 미세 주입된 난자와 초기 배아는 체외 배양하면서 유전자의 기능을 유관적으로 확인할 수 있다. 본 연구는 이와 같이 유용한 RNAi 기작을 이용하여 난자 내의 Obox4의 활성을 효과적으로 억제함으로써, 난자 성숙 동안에 Obox4가 어떠한 역할을 하고 있는지 알아보고자 수행하였다.
- 본 연구에서 Obox family의 mRNA의 발현 양상을 생쥐 난소의 발달 단계별로 확인하는 과정에서 Obox4의 발현을 2주령의 난소에서 확인할 수 있었고, 또한 정소와 난자 성숙과정 동안에 Obox4를 동정할 수 있었기에, 난자 성숙 동안에 Obox4의 기능이 무엇인지 알아보기 위해 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구진은 선행연구를 통하여 난자 성숙과정의 조절 기작을 규명하기 위하여 Annealing Control Primer (ACP)-PCR System을 이용하여 생쥐의 GV 난자와 Mn 난자에서 차이 나게 발현하는 유전자의 목록을 보유하고 있다.# 이들 유전자 중에서 Obox family의 member인 Oboxl, 3, 5가 존재함을 관찰하여 본 연구를 시작하게 되었다.
가설 설정
- 0 μg/μl dsRNA followed by in vitro maturation. A. Control oocytes showing typical chromosomal configuration during in vitro maturation. B.
- MII oocytes cultured in plain M16 medium for 16 h after Obox4 RNAi. C. Oocytes cultured in M16 medium supplemented with 0.2 mM IBMX for 24 h after Obox4 RNAi. (d)-(f), GV; (g)-(i), MI; (j)-(l), MII
제안 방법
- 고정이 된 난자들은 얇게 뽑은 pasteaur pipette을 이용하여 slide 중앙에 얹은 후 난자가 마르지 않게 바로 cover glass로 덮었다. Aceto-orcein (1% orcein, 45% acetic acid)를 slide와 cover glass 틈새로 흘려주어 5분간 염색 후, 현미경 (Coolscope, Nikon, Japan)을 이용하여 염색체를 관찰하였다.
- Dynabeads mRNA DIRECT kit (Dynal)를 이용하여 회수한 mRNA로부터의 cDNA 합성은 mRNA에 0.5 μg oligo(dT)12~i8 primer를 넣고 70℃에서 10분간 가열한 후 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KC1, 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP mix를 포함하는 10 mM DTT를 최종 양이 20 ㎕이 되게 첨가한 후 42℃ 에서 5분간 데웠다. 그 후 200 U의 역전사효소 (MMLV reverse transcriptase, Promega)를 넣고 42℃ 에서 60분, 94℃에서 2분간 반응시켜 cDNA를 준비하였다.
- 어냈다. Germinal vesicle breakdown (GVBD)를 억제하는 0.2 mM IBMX (17018, Sigma)가 첨가된 M2 (M7167, Sigma) 배양액에 난소를 모은 후 인슐린 주사기를 이용하여 난소를 터뜨려 GV 난자-난구세포 복합체 (cumulus-enclosed oocyte complexes, COCs)를 모았다. 난자 크기에 맞는 미세유리관 파이펫을 통해 난자 주위에 둘러 쌓여있는 난구세포를 물리적으로 제거하여 난자만을 얻었다.
- 난자 크기에 맞는 미세유리관 파이펫을 통해 난자 주위에 둘러 쌓여있는 난구세포를 물리적으로 제거하여 난자만을 얻었다. MII 난자를 얻기 위해서는 5 IU의 PMSG를 주사한 후 48시 간에 human chorionic gonadotrophin(hCG; Chomlon, Intervet) 주사하여 16시간 후 수란관으로부터 MⅡ난자를 얻었다.
- Obox4 dsRNA를 미 세주입 한 후, 3% BSA (Sigma) 가 첨가된 M16 배지에서 배양하거나, 또는 3% BSA가 첨가된 M16 배지에 0.2 mM의 IBMX를 첨가한 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 16시간 또는 24시간 동안 배양하였다.
- Obox4 dsRNA를 이용하여 RNAi를 한 후 histone Hl 유전자 발현 양에 대한 상대적인 발현 양을 확인하였다. Obox4의 knock-down 확인을 위한 primer 와 결과물의 위치 및 크기는 Table 1과 Figure 2에 나타내었다.
- PCR 반응 조건은 94℃ 에서 40초, 60℃ 에서 40초, 72℃에서 40초로 35 cycle을 수행하여 최종산물은 240 bp이었다. Obox4의 증폭산물을 pGEM T-easy vector (Pro- mega)에 삽입하고 DH5a competent cell에 형질 전환시켜 다량의 재조합 된 clone을 얻었다. 그런 후 삽입된 유전자가 antisense 또는 sense로 삽입되었는지를 PCR을 통해 확인하고 in vitro transcription 을 위해 T7 또는 SP6를 promotorS 반응할 수 있게 Spe I으로 linearization시키고, MEGAscript RNAi Kit (Ambion, Austin, TX)의 T7 RNA polymerase를 이용하여 single stranded RNA를 합성하였다.
- 조직에서 Trizol (Invitrogen)를 이용하여 회수한 total RNA로 부터의 cDNA 합성에는 DNasel이 첨가된다. PCRe 0.2 mM dNTPs, 25 pM의 각 primer, 2.5 U of Taq DNA polymerase (Promega)와 함께 3차 증류수를 이용하여 전체 반응 용액이 20 ㎕가 되도록 하여 수행하여 각 유전자의 발현 양상을 확인하였다. glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 Internal control로 사용되었으며, globin을 spike로 사용하여 난자로부터의 적은 양의 mRNA 회수가 정확히 되었는지를 확인하였다.
- dsRNA sample 내에 single-strand cRNAs의 오염을 피하기 위해 1 μg/mL RNase A (Ambion)를 첨가해 37℃ 에서 30분 처리하였다. Phenol-chloroform 주줄법으로 dsRNA를 준비하였고 Gel 전기 영동으로 확인하였다.
- Total RNA는 생쥐의 발달 단계별 난소 (생후 1, 5, 14, 21, 28, 49일자)와 발달 단계별 정소 (생후 1, 5, 14, 21, 42, 49일자)에 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 용액을 넣고 균질화 시킨 후 상온에서 5분간 두었다가 15분 후 4℃ 에서 12,000 g로 20분간 원심분리한 뒤, RNA를 포함하는 무색의 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 동일한 양의 isopropanol를 첨가하여 상온에서 10분간 두었다가 4℃에서 10분간 8, 000 g로 원심분리하여, RNA 침전물을 공기 중에서 건조시킨 후 DEPC 처리된 증류수로 용해시켜 사용 전까지 -70℃ 에 보관하였다.
- 5 U of Taq DNA polymerase (Promega)와 함께 3차 증류수를 이용하여 전체 반응 용액이 20 ㎕가 되도록 하여 수행하여 각 유전자의 발현 양상을 확인하였다. glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 Internal control로 사용되었으며, globin을 spike로 사용하여 난자로부터의 적은 양의 mRNA 회수가 정확히 되었는지를 확인하였다. RT-PCR에 사용된 primer는 Table 1과 Figure 2에 정리하였다.
- 같은 개수의 GV 난자와 MⅡ 난자로부터 Dyna-beads mRNA DIRECT kit (Dynal, Oslo, Norway)를 사용하여 mRNA를 분리하였다. 먼저 난자들이 있는 각 튜브에 300 ㎕ lysis/binding buffer(100 mM Tris- HCL pH 7.
- Obox4의 증폭산물을 pGEM T-easy vector (Pro- mega)에 삽입하고 DH5a competent cell에 형질 전환시켜 다량의 재조합 된 clone을 얻었다. 그런 후 삽입된 유전자가 antisense 또는 sense로 삽입되었는지를 PCR을 통해 확인하고 in vitro transcription 을 위해 T7 또는 SP6를 promotorS 반응할 수 있게 Spe I으로 linearization시키고, MEGAscript RNAi Kit (Ambion, Austin, TX)의 T7 RNA polymerase를 이용하여 single stranded RNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 각 complementary RNAs는 75℃ 에서 5분간 반응한 후 실온에서 3시간 식혔다.
- 배양 조건은 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 16시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 극체가 방출된 난자를 MU 난자로 공시하였으며, 핵이 보이지 않으며 극체 또한 보이지 않는 난자는 MI 난자로 공시하였다.
- 2 mM IBMX (17018, Sigma)가 첨가된 M2 (M7167, Sigma) 배양액에 난소를 모은 후 인슐린 주사기를 이용하여 난소를 터뜨려 GV 난자-난구세포 복합체 (cumulus-enclosed oocyte complexes, COCs)를 모았다. 난자 크기에 맞는 미세유리관 파이펫을 통해 난자 주위에 둘러 쌓여있는 난구세포를 물리적으로 제거하여 난자만을 얻었다. MII 난자를 얻기 위해서는 5 IU의 PMSG를 주사한 후 48시 간에 human chorionic gonadotrophin(hCG; Chomlon, Intervet) 주사하여 16시간 후 수란관으로부터 MⅡ난자를 얻었다.
- 대조군은 아무것도 처리하지 않은 난자들이며, 비 교군은 Obox4 dsRNA를 녹였던 elution buffer만을 미세주입한 난자, Obox4 RNAi군은 Obox4 dsRNA를 미세주입한 난자들이다. Plain M16에서 배지에서 배양할 경우, 대조군 (100%), 비교군 (96.
- 또한, Obox fMnⅡy의 mRNA는 난자 성숙과정 동안 발현 양에 차이를 보였다. 본 연구로 Obox family가 난포생성뿐만 아니라 난자 성숙에도 관여하고 있을 것이라 생각하였으며, Obox family 중 Obox4에 초점을 맞추어 실험을 수행하게 되었다. Obox4의 기능을 알고자 시행한 RNAi 기술은 dsRNA를 이용하여 특정 유전자만을 억제하는 방법이다.
- 본 연구에서는 dsRNA를 용해한 Elution buffer를 대조군으로 사용하였다. 유전자에 대한 primer를 두 set 작성하여 한 set는 dsRNA를 제작하는데 사용하였으며, 또 다른 set는 RNAi 후 mRNA 발현 차이를 확인하기 위해 RT-PCR에 이용하였다 (Table 1).
- 생쥐 2주령 난소로부터 Trizol (Invitrogen)을 이용하여 total RNA를 추출하고, MMLV reverse transcriptase (Promega)으로 역전사 반응을 수행하였다. 사용된 primer와 결과물의 위치 및 크기는 Table 1과 Figure 2에 나타내었다.
- 또한, 정소에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 Obox4에 대해서도 2주령 난소에서의 발현을 확인할 수 있었다 (Figure 1A). 이것은 현재까지 알려져 있는 정보와 상반되는 현상이기에, Obox4의 mRNA 발현 양상을 좀더 확실하게 확인하기 위해 PCR cycle 수를 35 cycle로 조정하여 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, Obox4의 mRNA는, 생후 1일자 난소에서 처음으로 발현이 확인되며, 점차 증가하여 2주령의 난소에서 가장 높게 발현하고 이후 점자 줄어드는 양상을 확인하였다.
- 사용된 primer와 결과물의 위치 및 크기는 Table 1과 Figure 2에 나타내었다. 합성된 cDNA를 가지고 Obox4 primer를 이용해 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 94℃ 에서 40초, 60℃ 에서 40초, 72℃에서 40초로 35 cycle을 수행하여 최종산물은 240 bp이었다.
대상 데이터
- Obox4의 knock-down 확인을 위한 primer 와 결과물의 위치 및 크기는 Table 1과 Figure 2에 나타내었다. 대조군의 난자들은 in vitro 성숙에 의해 얻어진 난자들이며, 배양을 위한 난자들의 회수직후의 GV 난자 (0 h)와 8시간 동안 배양한 MI 난자, 16시간 동안 배양한 MⅡ 난자가 사용되었다. 대조군과 비교하여, Obox4 RNAi 후 난자 성숙이 진행된 MI 난자와 MII 난자에서 Obox4의 발현이 확인되지 않았으며 GV 상태에 정지되어 있는 Obox4 RNAi군에서도 Obox4의 발현 양이 현저하게 감소한 것을 확인하였다.
- 생후 3주령된 ICR 생쥐에 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Folligon, Intervet) 5 lU/ml를 주사하여 44~48시간째에 생쥐를 도살하고 난소만을 떼 어냈다. Germinal vesicle breakdown (GVBD)를 억제하는 0.
이론/모형
- 사용하였다. 유전자에 대한 primer를 두 set 작성하여 한 set는 dsRNA를 제작하는데 사용하였으며, 또 다른 set는 RNAi 후 mRNA 발현 차이를 확인하기 위해 RT-PCR에 이용하였다 (Table 1).
성능/효과
- 응축된 염색체가 방출된 극체에만 존재하는 경우와 (Figure 5Ba), 세포질과 극체에 각각 존재하는 경우 (Figure 5Bb), 또는 일반적인 정상 Mn 난자의 염색체의 형태를 보이는 경우도 있었다 (Figure 5Bc). 0.2 mM의 IBMX가 첨가된 M16배지에 24시간 동안 배양한 Obox4 RNAi군에서는전체적으로 M16 배지에서 16시간 동안 배양한 난자에서 보다 더 강한 염색체 응축현상을 확인할 수 있었다 (Figure 5Cd-l). 현미경 하에서 인과 핵막의 존재를 확인한 GV 난자에서도 일반적인 GV 난자의 염색체와 비교하여 응축현상이 있음을 확인할 수 있었다 (Figure 5Cd-f).
- 12,13 그러나, 대부분의 포유류 세포에서는 30 bp 이상의 긴 dsRNA가 PKR, interforon과 Z, 5'-AS 경로를 활성화 시키게 되고, 이들의 활성은 세포의 죽음을 초래한다.14 두 번째, 미세 주입법은 난자 내로 유전자를 운반하는 매우 유용한 방법이며, 특히 200~300 bp의 dsRNA를 넣어 주는 것은 많은 수의 siRNA가 만들어지는 유리한 조건이 된다. 마지막으로, 유전자가 미세 주입된 난자와 초기 배아는 체외 배양하면서 유전자의 기능을 유관적으로 확인할 수 있다.
- 이들 Obox family 유전자는 1번부터 6번까지 존재하는데, 모두 생쥐의 염색체 7번 상에 위치하고 있으며, mRNA 발현 양상을 확인하였을 때 Obox4만을 제외하고 모두 난소에서 선택적으로 높게 발현한다고 보고되어 있다.4 Oboxl, 6의 mRNA 발현 양상을 in situ hybridization을 이용하여 난소 조직 내에서 확인하였을 때 원시난포에서는 발현하지 않았으며 일차난포 (primary follicle)부터 난포강 난포 (antral follicle)까지 발현하고 있음을 확인하였다.4 이 발현 양상은 난포 발달과정과 난자 발생과정 동안에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있는 growth differentiation factor-9 (GDF9)와 bone morphogenetic protein-15 (BMP15)의 발현 양상과 비슷하다? 이와 같은 결과를 바탕으로 Obox family는 난포 발달과정과 난자 발생과정 동안에 중요한 역할을 할 것으로 생각되어지고 있다.
- 4 이 발현 양상은 난포 발달과정과 난자 발생과정 동안에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있는 growth differentiation factor-9 (GDF9)와 bone morphogenetic protein-15 (BMP15)의 발현 양상과 비슷하다? 이와 같은 결과를 바탕으로 Obox family는 난포 발달과정과 난자 발생과정 동안에 중요한 역할을 할 것으로 생각되어지고 있다.4 그러나 Obox6에 대한 돌연변이 생쥐에서는 정상적인 난자의 성숙과 수정능력, 더 나아가 정상적인 배아발달이 진행됨으로 인해 Obox6는 난자 성숙과 배아발달에 중요한 역할을 하지 않고 있다고 보고되어 있고, 이때 Obox6의 mRNA 발현이 사라지면서 다른 Obox member 들의 발현이 증가됨을 확인함으로써 Obox family 유전자들의 상호보안적인 기능을 예측하였다.6
- 6개의 Obox 유전자를 대상으로 RT-PCR을 수행하였고, GAPDH 유전자 발현에 대한 상대적인 발현 양상을 보정하여 관찰하였을 때, Obox6을 제외하고 모든 Obox 유전자가 2주령의 생쥐의 난소에서 상대적으로 높게 발현하며 이후 점차 감소하는 양상을 보였다. 또한, 정소에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 Obox4에 대해서도 2주령 난소에서의 발현을 확인할 수 있었다 (Figure 1A).
- 따라서 Obox4가 다른 Obox family들과의 관계에서 단독 기능을 할 가능성과, 난자 성숙단계에서와 초기 배아 발생단계에서의 Obox family들의 상관관계에 차이가 있을 것이라 생각한다. Obox4 RNAi 실험 결과에서는, Obox4와 IBMX의 연관성을 생각할수 있었다. 16시간 동안 M16배지에서 배양하였을 때의 Obox4 RNAi군의 난자 성숙률은 대조군, 비교군과 비교했을 때 차이를 보이지 않았다.
- 이것은 현재까지 알려져 있는 정보와 상반되는 현상이기에, Obox4의 mRNA 발현 양상을 좀더 확실하게 확인하기 위해 PCR cycle 수를 35 cycle로 조정하여 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, Obox4의 mRNA는, 생후 1일자 난소에서 처음으로 발현이 확인되며, 점차 증가하여 2주령의 난소에서 가장 높게 발현하고 이후 점자 줄어드는 양상을 확인하였다. 또한, 정소의 모든 발달과정에서 발현하고 있으며 특히 생후 1일자와 2주령의 정소에서 높게 발현하고 있었다.
- 16시간 동안 M16배지에서 배양하였을 때의 Obox4 RNAi군의 난자 성숙률은 대조군, 비교군과 비교했을 때 차이를 보이지 않았다. 그러나 매우 흥미롭게도, 난자 성숙 억제를 위한 0.2 mM의 IBMX가 첨가된 M16 배지에서의 GV 상태의 대조군과 비교군과 비교하여 Obox4 RNAi군에서는 MI, MⅡ 시기로의 난자 성숙을 확인할 수 있었다. 정상적인 난자 성숙은 PED (phosphodiesterases) 억제제와 cAMP 등에 의해 억제된다.
- 높은 cAMP가 존재함에도 불구하고 Obox4 RNAi군에서의 난자 성숙은, Obox4가 cAMP dependent한 유전자일 가능성을 보여준다. 난자 성숙률을 확인한 후 orcein 염색법을 통해 염색체들을 확인할 결과, 성숙된 난자들에서는 하나 이상의 응축된 염색체를 확인할 수 있었다. 더욱이 MII 난자에서는 세포질과 극체로 분리되어지지 못하고 응축되어 한쪽에만 존재하는 염색체를 확인할 수 있었다.
- 대조군의 난자들은 in vitro 성숙에 의해 얻어진 난자들이며, 배양을 위한 난자들의 회수직후의 GV 난자 (0 h)와 8시간 동안 배양한 MI 난자, 16시간 동안 배양한 MⅡ 난자가 사용되었다. 대조군과 비교하여, Obox4 RNAi 후 난자 성숙이 진행된 MI 난자와 MII 난자에서 Obox4의 발현이 확인되지 않았으며 GV 상태에 정지되어 있는 Obox4 RNAi군에서도 Obox4의 발현 양이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 그러나 Obox family 중 Obox4와 염기서열의 유사성이 높은 Obox3, 5의 발현 양은 Obox4 RNAi 에의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인할 수 있었다 (Figure 3).
- 14 두 번째, 미세 주입법은 난자 내로 유전자를 운반하는 매우 유용한 방법이며, 특히 200~300 bp의 dsRNA를 넣어 주는 것은 많은 수의 siRNA가 만들어지는 유리한 조건이 된다. 마지막으로, 유전자가 미세 주입된 난자와 초기 배아는 체외 배양하면서 유전자의 기능을 유관적으로 확인할 수 있다. 본 연구는 이와 같이 유용한 RNAi 기작을 이용하여 난자 내의 Obox4의 활성을 효과적으로 억제함으로써, 난자 성숙 동안에 Obox4가 어떠한 역할을 하고 있는지 알아보고자 수행하였다.
- 발달 단계별 난소에서 Obox6을 제외한 Obox family의 mRNA는 생쥐 난소의 발달 단계 중 2주령의 난소에서 가장 높게 발현하였으며, Obox family 가 활발하게 기능을 수행할 것으로 생각되는 2주령의 난소에서 Obox4의 발현 또한 확인할 수 있었다. 정소에서 특이적으로 발현한다고 알려져 있는 Obox4의 난소에서의 발현은 매우 흥미로운 결과였다.
- 본 연구결과, Obox4의 난자에서의 기능적 연구는 최초로 보고되는 것이며, 매우 흥미로운 결과를 보여주고 있다. Obox4의 하위 유전자를 알기 위한 DNA chip 실험과, RNAi를 통한 knock-down이 아닌 과발현 방법 및 단백질 단계에서의 실험 등이 추후 진행된다면, 본 연구에서 보고한 결과에 따른 예측과 함께 좀더 확실한 Obox4의 기능을 알 수 있을 것이다.
- 본 연구에서, 7주령에서의 난소와 정소의 Obox4의 발현을 살펴보면 정소에서 더 높게 발현하는 것을 확인할 수 있고, 앞서 Obox family에 대하여 보고된 논문에서 7주령 난소와 정소에서 30 cycle 을 기준으로 발현 양상을 본 것을 감안하면,4 지금까지 Obox4의 발현이 정소 특이적이라고 한 이유를 설명할 수 있을 것이다.
- 현미경 하에서 인과 핵막의 존재를 확인한 GV 난자에서도 일반적인 GV 난자의 염색체와 비교하여 응축현상이 있음을 확인할 수 있었다 (Figure 5Cd-f). 성숙된 MI, MⅡ 난자에서는 거의 모든 염색체가 한 개 또는 몇 개의점의 형태로 완벽하게 응축된 염색체로 존재하는것을 확인하였다. MⅡ 난자에서는 응축된 염색체가세포질에만 존재하는 난자도 관찰되었다 (Figure 5Cj).
- 시료 내의 genomic DNA의 오염을 확인하기 위하여, Obox4에 대하여 intron 부분을 포함하도록 primer를 디자인하여, Intron을 포함하는 결과물은 1454 bp, exon만을 포함하는 결과물은 877 bp 위치에 band가 나타나도록 제작하여 RT-PCR을 수행한 결과, 877 bp 외의 다른 band가 나타나지 않았으므로, 시료 내에 genomic DNA의 오염이 없었음을 확인할 수 있었다 (Figure ID).
- 첫째, 난자와 초기 배아에서는 PKR (dsRNA activated protein kinase R) 에의해 유도되는 interferon과 2', 5'-oligoadenylate synthetase (2',5-OAS)의 경로 활성이 나타나지 않는다.12,13 그러나, 대부분의 포유류 세포에서는 30 bp 이상의 긴 dsRNA가 PKR, interforon과 Z, 5'-AS 경로를 활성화 시키게 되고, 이들의 활성은 세포의 죽음을 초래한다.
- Obox family의 mRNA는 전체적으로 MU 난자보다 GV 난자에서 높게 발현하고 있었다. 특히, Oboxl, 2, 3, 5와 비교하여 Obox4, 6의 mRNA의 발현 양은 GV 난자에서 높게 발현하다가 MⅡ 난자에서 현저하게 감소하는 것을 관찰하였다 (Figure 1C).
후속연구
- Metaphase에서 anaphase로 진행되면서 Separase의 활성이 시작되게 되며, cohesion complex의 절단이 유도되어 염색체가 분리되어지게 된다.18,19 본 연구에서 Obox4 RNAi 후 응죽되어진 염색체들에서 Obox4와 cohesin com-plex와 관련성을 생각해 볼 수 있었으며 추후 실험이 진행되어야 할 것이다.
- 있다. Obox4의 하위 유전자를 알기 위한 DNA chip 실험과, RNAi를 통한 knock-down이 아닌 과발현 방법 및 단백질 단계에서의 실험 등이 추후 진행된다면, 본 연구에서 보고한 결과에 따른 예측과 함께 좀더 확실한 Obox4의 기능을 알 수 있을 것이다.
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