[논문]낮은 농도의 Hypoxanthine과 FSH가 미성숙난자의 체외성숙에 미치는 영향

한혁동; 임창교; 염현식; 현나영; 이지향; 홍미

낮은 농도의 Hypoxanthine과 FSH가 미성숙난자의 체외성숙에 미치는 영향
The Effect of Low Concentrated Hypoxanthine and FSH in 10% FBS Supplemented Medium on Immature Oocyte in vitro Maturatio 원문보기

대한생식의학회지= The Korean journal of reproductive medicine, v.36 no.3, 2009년, pp.175 - 186

한혁동 (연세대학교 원주의과대학 산부인과학교실) , 임창교 (21세기 산부인과) , 염현식 (연세대학교 원주의과대학 산부인과학교실) , 현나영 (연세대학교 원주의과대학 산부인과학교실) , 이지향 (연세대학교 원주의과대학 산부인과학교실) , 홍미 (연세대학교 원주의과대학 산부인과학교실)

초록
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목 적: Hypoxanthine (Hx)과 FSH가 미성숙난자의 배양에 미치는 영향을 관찰하기 위해 미성숙난자를 배양하여 GVBD, MII기 발생률을 비교 관찰하였다. 연구방법: 단순배양액인 BSAL-XI-HTF 배양액을 사용하여 (1) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF (0.3% BSA 배양액), (2) 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF (FSH 0.3% BSA 배양액), (3) 10% FBS mBASAL-XI-HTF (10% FBS 배양액), (4) 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 10% FBS mBASAL-XI-HTF (FSH 10% FBS 배양액)의 4종류의 배양액을 만들었고, 각 종류의 배양액에서 생쥐 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자의 성숙을 3, 6, 18시간별로 비교 관찰하였다. 각 배양액에 1 mM, 2 mM, 4 mM 농도의 미성숙난자성숙억제제인 Hx을 섞어 난자의 성숙억제양상을 관찰하였고 GVBD와 MII기 발생률을 비교 관찰하였다. 결 과: Hx을 첨가하지 않은 4종류의 배양액에서 미성숙난자의 자연성숙은 3시간 내에 대부분 GVBD가 발생하였고 MII기로의 발육은 6시간 이후 발생하였다. 18시간 후 각 군의 배양에서 모두 유사한 GVBD 발생률을 보였다. 1 mM, 2 mM, 4 mM Hx 농도의 0.3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액에서 난자의 성숙억제양상을 비교해 보면 4 mM 농도의 Hx 배양액에서 18시간 동안 완전한 성숙억제를 보였다. 2 mM 농도의 Hx 배양액에서도 18시간 배양까지 억제를 보였으나 4 mM 농도의 Hx 배양액보다 작은 난자성숙억제양상을 보였다. 1 mM 농도의 Hx 배양액에서는 모두 난자성숙억제를 보이지 못했다. FSH를 첨가한 배양액에서는 2 mM 농도의 Hx 뿐만 아니라 1 mM 농도의 Hx 첨가에서도 초기 3시간까지 GVBD 성숙이 억제되었다. 또 같은 농도의 Hx을 함유하고 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 비해 FSH를 첨가한 배양액에서 3시간, 6시간 동안 GVBD 발생을 더 억제하였다. 그러나 18시간 배양 후 난자성숙이 회복됨을 보였다. 이 결과로 FSH가 배양초기에 난자성숙을 억제하나 후기에는 성숙을 촉진함을 알 수 있었다. 18시간 후 MII기발육은 4 mM 농도의 Hx을 함유한 모든 배양액에서 낮은 발생률을 보였고, FSH를 함유한 10% FBS 배양액에 1 mM, 2 mM의 낮은 농도의 Hx을 첨가한 배양액은 다른 배양액에 비해 통계학적으로 높은 MII기 발생률을 보였다. 결 론: 본 실험에서 낮은 농도의 Hx과 FSH는 FBS를 함유한 배양액에서 미성숙난자의 초기배양 동안 성숙을 억제한 후 MII기 성숙을 촉진함을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Objective: We examined the effect of different culture media on oocyte maturation. Methods: Four groups of media, (1) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF, (2) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF with FSH, (3) 10% FBS mBASAL-XI-HTF and (4) 10% FBS mBASAL-XI-HTF with FSH were prepared. Mouse cumulus enclosed oocytes (CEOs) were incubated in each group of medium. Hypoxanthine (Hx) was mixed to each group of medium in increasing concentrations of 1 mM, 2 mM and 4 mM. CEOs were incubated and assessed for GVBD and MII development at 3, 6, 18 hours. Results: CEOs maturation to GVBD was seen in all four groups during 3 hours of culture, however MII stage of oocytes was seen after 6 hours. Complete arrest of GV stage in 4 mM Hx media without FSH and partial arrest in 2 mM Hx media without FSH were seen during 18 hours of culture but development was not suppressed in 1 mM Hx media without FSH. More prominent GVBD suppression was noted at early 3, 6 hours culture in 1 mM, 2 mM Hx media with FSH compared to media without FSH. But the suppression was recovered at 18 hours. This result suggests that low concentrated Hx and FSH supplemented media can suppress CEOs maturation during early culture period but recovery is resumed or even stimulated at late period. 1 mM, 2 mM Hx 10% FBS medium with FSH had significantly higher rates of MII development (71.7%, 66.7%) at 18 hours compared to other media. Conclusion: Our results show that low concentrated Hx and FSH supplemented 10% FBS media may stimulate MII development after an initial inhibitory effect.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 미성숙난자의 배양방법을 개선하기 위하여 단순배양액인 mBASAL-HTF 배양액에서 생쥐 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자 (CEOs)의 자연성숙을 시간별로 관찰하였고 배양액내에 단백질 공급을 위한 BSA (bovine serum albumin), 단백질 외에 다양한 복합물질을 포함하고 있는 FBS (fetal bovine serum), 난포자극호르몬 (FSH; follicle stimulating hormone)을 첨가하여 난자성숙에 미치는 영향을 관찰하였으며, 미성숙난자의 자연성숙을 억제하는 물질인 Hx을 사용하여 농도에 따른 난자성숙 억제양상을 관찰하고 FBS, BSA 배양액에서 난포자극호르몬과 Hx이 미성숙난자의 성숙 (GVBD, MII) 에 미치는 영향을 비교 관찰하여 보다 나은 배양 방법을 제시하고자 본 연구를 시행하였다.

제안 방법

12 미성숙난자의 배양은 ① 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF 배양액 (0.3% BSA 배양액), ② 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF 배양액에 0.1 IU/ml FSH (Gonal-F®, Merck Serno, Geneva, Switzerland)를 첨가한 배양액 (FSH 0.3% BSA 배양액), ③ 10% FBS (Gibco, Gland Island, NY, USA) mBASAL-XI-HTF 배양액 (10% FBS 배양액), ④ 10% FBS mBASAL-XI-HTF에 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 배양액 (FSH 10% FBS 배양액)의 4개 종류의 배양액에 나누어 배양하였으며 각군의 배양액에서 미성숙난자의 자연성숙을 배양 3시간, 6시간 18시간에 관찰하였다.
1 IU/ml FSH를 첨가한 배양액 (FSH 10% FBS 배양액)의 4개 종류의 배양액에 나누어 배양하였으며 각군의 배양액에서 미성숙난자의 자연성숙을 배양 3시간, 6시간 18시간에 관찰하였다. 4종류의 각 배양액에 Hx을 섞어 1 mM, 2 mM, 4 mM 농도의 Hx을 함유한 배양액을 만들었고 난자의 성숙억제양상을 3시간, 6시간, 18시간에 관찰하였다. 미성숙난자의 배양은 배양접시 (Falcon^®, Becton Dickinson, NJ, USA)를 사용하였으며 각 배양접시에는 배양액 1 ml를 넣고 그 위에 1 ml의 mineral oil을 덮은 후 하룻밤 동안 5.
FSH 10% FBS 배양액에 2 mM Hx을 첨가한 배양액 (2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액)에서 난구세포를 제거한 미성숙난자 (DO)의 배양에서는 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자와 같은 초기 3, 6시간 배양 동안 성숙이 억제되지 않았다 (10개의 미성숙난자를 5회 배양하여 총 50개의 미성숙난자를 배양, 3시간 배양; 80±11.0%, 6시간 배양; 82±9.8%, 18시간 배양; 82±9.8% GVBD 발생률) (Figure 3-D).
0% CO₂ 배양기에서 평형시킨 후 사용하였다. 각 배양접시에는 완전히 난구로 둘러싸인 10개의 미성숙난자를 넣어 배양하였고 배양 3, 6, 18시간 후 핵막이 소실된 GVBD와 GVBD 중 극체 (polar body)가 보이는 MII기 발생을 관찰하여 백분율 (%)로 표시하였다. 한 배양접시에서 10개의 미성숙난자를 18시간 배양 관찰한 실험을 1회 배양으로 하였고 각 배양은 5회 이상 (5~10회) 실시하였다.
본 연구에서 난포로부터 획득한 미성숙난자를 Hx이 없는 배양액에 배양함으로써 미성숙난자의 자연성숙을 발생시켰다. 실험에 사용된 4종류의 배양액 0.
생쥐난자의 체내성숙의 유도는 PMSG 5 IU를 복강내 주사한 후 48시간 뒤 hCG 5 IU를 복강내 주입하고 18시간 뒤 도살하여 난관에서 배란된 난자의 난구세포를 hyaluronidase로 처리한 후 GVBD, MII기 발생률 (%)을 관찰하였다.
암컷 생쥐를 임의로 추출하여 발정주기에 관계없이 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Sigma, St. Louis, MO, USA) 5 IU를 복강내 주사한 후 48시간 뒤 경추 탈구법으로 도살하여 양측 난소를 회수한 다음 50 mg/ml bovine serum albumin (BSA, Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 Dubecco's phosphate buffered saline (D-PBS, Gibco, Gland Island, NY, USA)이 담긴 배양접시에서 난소를 세척하고 4 mM Hypoxanthine (Hx, Sigma, St. Louis, MO, USA)이 들어있는 Hepes (13 mM)-modified Basal-XI-HTF 배양액에서 28 gauge 주사침으로 난소에 있는 난포를 조심스럽게 천자하여 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자를 회수하였다.
각 배양접시에는 완전히 난구로 둘러싸인 10개의 미성숙난자를 넣어 배양하였고 배양 3, 6, 18시간 후 핵막이 소실된 GVBD와 GVBD 중 극체 (polar body)가 보이는 MII기 발생을 관찰하여 백분율 (%)로 표시하였다. 한 배양접시에서 10개의 미성숙난자를 18시간 배양 관찰한 실험을 1회 배양으로 하였고 각 배양은 5회 이상 (5~10회) 실시하였다.

대상 데이터

미성숙난자 획득 및 성숙배양액은 Quinn 등이 사용한 BASAL-XI-HTF 배양액의 KCl 4.7 mM, MgSO4 · 7H2O 0.2 mM, CaCl2 · 2H2O 2.04 mM의 무기염 (inorganic salt)을 기본으로 하고 NaHCO3 25 mM, Glucose 2.8 mM, Na pyruvate 0.33 mM, Na lactate 21.4 mM, Glutamine 1.0 mM, Taurine 0.1 mM, EDTA 0.01 mM, Na-citrate 0.0005 mM, 필수아미노산, 비필수아미노산, streptomycin, penicillin 및 phenol red를 첨가한 modified Basal-XI-HTF를 사용하였다.
본 실험에서는 생쥐 1대 잡종 B6DBAF1 (C57BL×DBA)의 생후 5~7주령의 암컷을 사용하였으며 사용된 생쥐는 10시간/14시간 광주기를 유지하며 사육하였다.
본 연구에서 난포로부터 획득한 미성숙난자를 Hx이 없는 배양액에 배양함으로써 미성숙난자의 자연성숙을 발생시켰다. 실험에 사용된 4종류의 배양액 0.3% BSA 배양액, FSH를 첨가한 0.3% BSA 배양액, 10% FBS 배양액, FSH를 첨가한 10% FBS 배양액 모두에서 3시간 내에 대부분 GVBD가 발생하였다. MII기의 발생은 6시간 이후에 발생되었으며 배양 18시간 후 각 배양액에서 GVBD 발생률이 88.
회수된 난자는 modified BasalXI-HTF (mBASAL XI)에서 세척 후 준비된 난자성숙배양액에 넣어 배양하였다. 실험에 사용된 미성숙난자는 완전히 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자를 선택하여 사용하였고, 난구세포를 제거한 미성숙난자 (DO; denuded oocyte)는 hyaluronidase를 이용하여 미성숙난자의 난구세포를 모두 제거한 후 사용하였다.

데이터처리

통계학적 검정은 PRISM software (GraphPad)를 이용한 unpaired student T-test로 유의성을 검정하였고 결과는 평균 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 표시하였으며 p 값 0.05 이하를 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.

성능/효과

0.3% BSA 배양액, 10% FBS 배양액, FSH 0.3% BSA 배양액, FSH 10% FBS 배양액에서 GVBD 발생은 3시간 배양 후 76.0%, 74.0%, 64.0%, 70.0%, 6시간 배양 후 82.0%, 79.0%, 88.0%, 77.1%, 18시간 배양 후 88.0%, 86.0%, 92.0%, 87.1%의 발생률을 보여 배양 3시간 내에 대부분의 GVBD가 발생하였고 18시간 동안 4군의 배양액간 GVBD 발생률의 차이는 보이지 않았다 (Table 1, Figure 1). MII기로의 발생은 4군 배양액에서 배양 6시간까지 모두 MII기로 발생되지 않았으며 배양 18시간 후 관찰에서 0.
0.3% BSA 배양액에서 Hx 농도가 증가함에 따라 난자의 성숙억제가 뚜렷하게 보였다. 4 mM Hx 0.
그러나 4 mM Hx 배양액과 같이 심한 억제의 결과를 보이지는 않았다. 1 mM Hx 배양액에서는 대조군에 비해 난자의 성숙이 억제되지 않았다.
18시간 배양 후 MII기 성숙은 4 mM Hx을 함유한 0.3% BSA 배양액, FSH 0.3% BSA 배양액, 10% FBS 배양액, FSH 10% FBS 배양액의 4종류 배양액에서 모두 Hx을 포함하지 않은 대조군에 비해 유의하게 낮은 MII기 성숙을 보였다 (0.3% BSA 배양액 vs. 4 mM Hx 0.3% BSA 배양액; 30.0% vs. 14.0%, FSH 0.3% BSA 배양액 vs. 4 mM Hx FSH 0.3% BSA 배양액; 44.0% vs. 12.0%, 10% FBS 배양액 vs. 4 mM Hx 10% FBS 배양액; 50.0% vs. 6.2%, FSH 10% FBS 배양액 vs. 4 mM FSH 10% FBS 배양액; 38.6% vs. 10.0%, p<0.05).
3% BSA 배양액에서 Hx 농도가 증가함에 따라 난자의 성숙억제가 뚜렷하게 보였다. 4 mM Hx 0.3% BSA 배양액에서는 전 배양구간에서 Hx을 넣지 않은 0.3% BSA 배양액 (대조군)에 비해 GVBD 발생이 억제됨을 볼 수 있었고, 2 mM Hx 배양액에서도 대조군에 비해 18시간까지 억제되었다. 그러나 4 mM Hx 배양액과 같이 심한 억제의 결과를 보이지는 않았다.
5마리 생쥐의 복강내 hCG를 주입한 후 18시간 뒤 난관에서 획득한 난자 (총 119개 난자, 한 마리 당 13~39개, 평균 24개)의 GVBD, MII기를 관찰한 결과 100% GVBD, 76.8±11.4%의 MII기 발생률을 보였으며 이것은 1 mM, 2 mM 농도의 Hx과 FSH를 첨가한 10% FBS 배양액 (1 mM Hx FSH 10% FBS 배양액, 2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액)에서 보인 71.7%, 66.7%의 MII기 발생률과 유사한 발생률을 보임을 알 수 있었고 0.3% BSA, FSH 0.3% BSA, 10% FBS, FSH 10% FBS 배양액의 MII기 발생률과 비교할 때 유의하게 높은 발생률을 보임을 알 수 있었다.
Eppig 등 (1994년)은 생쥐에서 MI기 상태로 정지되어 있는 난자에서도 정자의 수정에 의해 난자를 MII기로 성숙시키고 2세포기, 포배기로 발생시킬 수 있으나 포배기로 발생된 대부분의 배아 (76%)는 염색체 이상인 삼배수체임을 발표했다.⁷ 본 실험에서 각 배양액 중 FSH를 함유한 10% FBS 배양액에 1 mM, 2 mM Hx을 첨가한 배양액에서 18시간 배양 후 GVBD로 91.7%, 73.3%가 발생되고 GVBD로 발생된 난자 중 78%, 91% (전체미성숙난자의 71.7%, 66.7%)가 MII기로 발육되어 다른 배양액에 비해 유의하게 높은 MII기 발생률을 보였다. 이 결과는 생체내 난자 MII기 발생률 76.
FSH 0.3% BSA 배양액과 FSH 10% FBS 배양액에 1 mM Hx을 첨가한 배양액에서는 Hx을 첨가하지 않은 대조군 (0.3% BSA, 10% FBS 배양액)에 비해 초기 3시간 배양 동안 GVBD 발생이 억제되었고 (0.3% BSA 배양액 vs. 1 mM Hx FSH 0.3% BSA 배양액; 76.0% vs. 28.3%, p<0.0001, 10% FBS 배양액 vs. 1 mM Hx FSH 10% FBS 배양액; 74.0% vs. 36.7%, p<0.0001) 또한 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 1 mM Hx을 첨가한 배양액보다 더 GVBD 발생이 억제되었다 (1 mM Hx 0.3% BSA 배양액 vs. 1 mM Hx FSH 0.3% BSA 배양액; 71.7% vs. 28.3%, p<0.0001, 1 mM Hx 10% FBS 배양액 vs. 1 mM Hx FSH 10% FBS 배양액; 62.2% vs. 36.7%, p=0.0006).
FSH 0.3% BSA 배양액에 2 mM Hx을 첨가한 배양액에서도 FSH를 첨가하지 않은 0.3% BSA 배양액에 2 mM Hx을 첨가한 배양액과 같이 초기 3시간, 6시간 배양에서 대조군 (0.3% BSA 배양액)에 비해 난자성숙이 억제됨을 알 수 있었다 (3시간 배양; 76.0% vs. 4.0%, p<0.0001, 6시간 배양; 82.0% vs. 36.0%, p=0.0103).
FSH 10% FBS 배양액에 2 mM Hx 첨가한 배양액에서는 대조군 (10% FBS 배양액)과 FSH를 첨가하지 않은 2 mM Hx 10% FBS 배양액에 비해 초기 3시간, 6시간 배양에서 유의하게 GVBD가 억제되는 것을 확인하였다 (3시간 배양 10% FBS 배양액 vs. 2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액; 74.0% vs. 5.0%, p<0.0001, 3시간 배양 2 mM Hx 10% FBS 배양액 vs. 2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액; 53.3% vs. 5.0%, p<0.0001, 6시간 배양 10% FBS 배양액 vs. 2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액; 79.0% vs. 33.3%, p<0.0001, 6시간 배양 2 mM Hx 10% FBS 배양액 vs. 2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액; 64.4% vs. 33.3%, p<0.0001) (Table 1, Figure 3-D).
FSH를 첨가하지 않은 배양액과 같이 FSH를 첨가한 FSH 0.3% BSA 배양액과 FSH 10% FBS 배양액에 4 mM Hx을 첨가한 배양액에서도 배양 3시간, 6시간 동안 GVBD 발생은 완전히 억제되었으며 (3시간 배양; 4 mM Hx FSH 0.3% BSA 배양액 0% GVBD, 4 mM Hx FSH 10% FBS 배양액 1.7% GVBD, 6시간 배양; 4 mM Hx FSH 0.3% BSA 배양액 0% GVBD, 4 mM Hx FSH 10% FBS 배양액 5.0% GVBD) 배양 18시간 후 FSH 0.3% BSA 배양액에 4 mM Hx을 첨가한 배양액에서는 62.0%의 GVBD 발생을 보여 GVBD 발생억제가 회복됨을 알 수 있었다. 그러나 FSH 10% FBS 배양액에 4 mM Hx을 첨가한 배양액에서는 배양 18시간 후에도 10.
MII기로의 발생은 4군 배양액에서 배양 6시간까지 모두 MII기로 발생되지 않았으며 배양 18시간 후 관찰에서 0.3% BSA 배양액, 10% FBS 배양액, FSH 0.3% BSA 배양액, FSH 10% FBS 배양액에서 30.0%, 50.0%, 44.0%, 38.6%를 보여 10% FBS 배양액이 0.3% BSA 배양액보다 유의하게 높은 MII기 발생률을 보였다 (30% vs. 50%, p<0.05).
3% BSA 배양액, 10% FBS 배양액, FSH를 첨가한 10% FBS 배양액 모두에서 3시간 내에 대부분 GVBD가 발생하였다. MII기의 발생은 6시간 이후에 발생되었으며 배양 18시간 후 각 배양액에서 GVBD 발생률이 88.0%, 92.0%, 86.0%, 87.1%, MII기 발생률이 30.0%, 44.0%, 50.0%, 38.6%로 나왔다. 이 결과는 GVBD 중 65.
결론으로 본 실험에서 낮은 농도의 Hx과 FSH가 함유된 10% FBS 배양액은 초기배양에서는 미성숙난자의 발생을 억제하나 후기에서는 GVBD 발생을 촉진하고 미성숙난자를 수정가능한 MII기로의 성숙을 촉진함을 알 수 있었고 이것은 미성숙난자의 초기배양 중 GVBD 발생이 억제되고 핵막이 소실되기 전 FSH와 FBS의해 난구세포에서 만들어진 감수분열에 영향을 주는 물질을 난자에 공급하여 보다 나은 난자성숙을 유도하기 때문으로 생각된다.
05). 그러나 0.3% BSA 배양액과 FSH를 첨가한 0.3% BSA 배양액에서 MII기 발생률의 비교와 10% FBS 배양액과 FSH를 첨가한 10% FBS 배양액에서 MII기 발생률의 비교는 모두 유의한 차이가 없었다 (Table 2, Figure 1).
그러나 1 mM, 2 mM 농도의 Hx과 FSH를 첨가한 10% FBS 배양액 (1 mM Hx FSH 10% FBS 배양액, 2 mM Hx FSH 10% FBS 배양액)에서는 71.7%, 66.7%의 발생률을 보여 다른 모든 배양액보다 오히려 유의하게 높은 MII기 발생률을 보였다 (p<0.05) (Table 2).
1849). 그러나 18시간 배양 후 84.0%의 GVBD 발생률을 보여 초기배양기간 동안에는 GVBD 발생이 억제되었지만 배양후기에서는 GVBD 발생이 촉진(회복)됨을 알 수 있었다 (Table 1, Figure 3-C).
0%의 GVBD 발생을 보여 GVBD 발생억제가 회복됨을 알 수 있었다. 그러나 FSH 10% FBS 배양액에 4 mM Hx을 첨가한 배양액에서는 배양 18시간 후에도 10.0%의 GVBD 발생을 보여 GVBD 발생이 계속 억제되고 있음을 알 수 있었다 (Table 1).
3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액에서 미성숙난자의 성숙을 억제하지 못했다. 그러나 FSH를 첨가한 배양액의 경우 0.3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액 모두에서 2 mM Hx이 초기배양 3시간, 6시간에서 GVBD를 억제할 뿐 아니라 FSH를 첨가한 배양액에서는 1 mM 농도의 Hx 배양액에서도 초기 3시간 배양에서 GVBD 발생을 억제함을 볼 수 있었다. 또 같은 농도의 Hx을 함유한 배양액과의 비교에서 FSH를 첨가한 배양액에서 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 비해 초기배양기간 동안 미성숙난자의 성숙이 더 많이 억제되었다.
난구세포를 제거한 미성숙난자 (10개의 미성숙난자를 5회 배양하여 총 50개의 미성숙난자를 배양)의 2 mM Hx을 첨가한 FSH 10% FBS 배양액에서 MII기 발생률은 18시간 배양 후 48.0±8.39%의 발생률을 보여 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자와 같이 높은 MII기 발생률의 증가양상은 보이지 않았다.
낮은 농도 (1, 2 mM)의 Hx을 함유한 배양액에서 난자성숙억제는, 2 mM Hx 0.3% BSA 배양액과 2 mM Hx 10% FBS 배양액에서는 난자성숙억제를 보였으나 1 mM Hx의 첨가는 0.3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액에서 미성숙난자의 성숙을 억제하지 못했다. 그러나 FSH를 첨가한 배양액의 경우 0.
0%의 GVBD가 유도되었고 10% FBS군에 FSH 첨가는 GVBD를 유도하지 못했다. 또 4 mM Hx을 함유한 0.3% BSA, 10% FBS 배양액 모두에서 낮은 MII기의 발생률을 보였다. 이것은 4 mM 농도의 Hx은 난자에 유해할 수 있고¹⁶4 mM의 Hx 배양액에 FSH를 첨가하여 난자성숙을 유도하는 체외성숙 배양방법은 사용하기에 부적합함을 시사한다.
0103). 또 FSH를 첨가하지 않은 0.3% BSA 배양액에 2 mM Hx을 첨가한 배양액 (2 mM Hx 0.3% BSA)보다 더 미성숙난자의 배양초기 3시간까지 GVBD 발생이 억제되었다 (3시간 배양, 2 mM Hx 0.3% BSA 배양액 vs. 2 mM Hx FSH 0.3% BSA 배양액; 42.0% vs. 4.0%, p=0.⁰⁰¹²⁾. 6시간 배양에서는 FSH 0.
3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액 모두에서 2 mM Hx이 초기배양 3시간, 6시간에서 GVBD를 억제할 뿐 아니라 FSH를 첨가한 배양액에서는 1 mM 농도의 Hx 배양액에서도 초기 3시간 배양에서 GVBD 발생을 억제함을 볼 수 있었다. 또 같은 농도의 Hx을 함유한 배양액과의 비교에서 FSH를 첨가한 배양액에서 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 비해 초기배양기간 동안 미성숙난자의 성숙이 더 많이 억제되었다. 이것으로 FSH가 미성숙난자의 초기배양기간 동안 Hx의 성숙억제를 항진시킴을 알 수 있었다.
1%의 많은 난자가 MI기 상태로 있음을 보이고 있다. 또 이 결과는 본 실험에서 생쥐 복강 내 PMSG를 주사한 후 48시간 뒤 hCG로 배란 유도한 생쥐의 18시간 뒤 난관에서 획득한 CEOs 중 76.8%가 MI기 상태이고 23.2%가 MII기 상태의 난자임과 비교할 때 생체내 성숙에 비해 난자성숙배양액에서 난자의 자연성숙은 더 많은 난자가 MI기 상태로 발육이 정지 혹은 지연되어 있음을 알 수 있었다.
¹⁴ 또 배란된 난자가 난관으로 이동되면 난포액내의 성숙억제물질인 Hx으로부터 분리될 수 있다. 본 실험에서 생쥐 복강내 hCG 주입 후 난자 난구세포의 성숙 관찰에서 hCG 복강내 주입 후 6~9시간 사이에 난자가 난관으로 배란되었으며 미성숙난자는 배란되기 전 난포액내 Hx 농도의 감소가 있고 배란 후에는 난포액과 다른 농도의 난관액에서 발생되고 있음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 체내난자성숙은 유도성숙기전과 함께 난자성숙억제물질의 감소가 함께 작용할 수 있음을 말하고 있다.
6%로 나왔다. 이 결과는 GVBD 중 65.9%, 52.2%, 41.9%, 55.1%의 많은 난자가 MI기 상태로 있음을 보이고 있다. 또 이 결과는 본 실험에서 생쥐 복강 내 PMSG를 주사한 후 48시간 뒤 hCG로 배란 유도한 생쥐의 18시간 뒤 난관에서 획득한 CEOs 중 76.
7%)가 MII기로 발육되어 다른 배양액에 비해 유의하게 높은 MII기 발생률을 보였다. 이 결과는 생체내 난자 MII기 발생률 76.8%와 유사하며 낮은 농도의 Hx과 FSH를 첨가한 10% FBS 배양액이 미성숙난자의 체외성숙배양액으로 적합함을 말하고 있다.
또 같은 농도의 Hx을 함유한 배양액과의 비교에서 FSH를 첨가한 배양액에서 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 비해 초기배양기간 동안 미성숙난자의 성숙이 더 많이 억제되었다. 이것으로 FSH가 미성숙난자의 초기배양기간 동안 Hx의 성숙억제를 항진시킴을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 Down 등 (2008년)이 낮은 농도의 dbcAMP로 난자성숙을 정지시킨 후 FSH로 난자를 성숙을 유도할 때 FSH가 초기에 난자성숙을 억제하고 후기에 난자성숙을 촉진함과 유사한 결과라고 할 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	난자의 성숙은 무엇에 의해 조절되는가?	이 과정을 난자의 성숙 (oocyte maturation)이라 한다. 난자의 성숙은 protein kinase와 protein phosphatase에 의한 단백질의 인산화 (phosphorylation), 탈인산화 (dephosphorylation)에 의해 조절되고, 성숙촉진인자 (MPF; maturation promoting factor)가 조절의 중추 역할을 맡고 있다. 또 성숙촉진인자와 함께 최근 MAPK 경로 (mitogen-activated protein kinase cascade)가 난자성숙에 중요한 역할을 함이 알려져 있다.
	배소낭 상태의 난자란 무엇인가?	난자는 포유동물 세포 중 가장 오래 사는 세포로 오랜 기간 동안 1차 감수분열의 중복염색체기 (diploten stage)에서 휴지상태로 유지되고 있다가 월경주기 중 배란기 LH surge 후 감수분열이 재개된다. 1차 감수분열 휴지기의 난자를 배소낭 (GV; germinal vesicle) 상태의 난자라고 한다. 감수분열이 재개되면 배소낭 파괴 (GVBD; germinal vesicle breakdown)가 일어나고 염색질이 응축 (chromatin condensation)되고 미세소관이 재구성 (microtubule reorganization)되어 중기 방추 (metaphase spindle)를 형성하고 1차 감수분열을 마친 후 2차 감수분열의 중기 난자 (MII stage oocyte; metaphase II stage oocyte)로 성숙되어 정자와 수정될 수 있는 능력을 가진다.
	난자의 성숙이란 무엇인가?	1차 감수분열 휴지기의 난자를 배소낭 (GV; germinal vesicle) 상태의 난자라고 한다. 감수분열이 재개되면 배소낭 파괴 (GVBD; germinal vesicle breakdown)가 일어나고 염색질이 응축 (chromatin condensation)되고 미세소관이 재구성 (microtubule reorganization)되어 중기 방추 (metaphase spindle)를 형성하고 1차 감수분열을 마친 후 2차 감수분열의 중기 난자 (MII stage oocyte; metaphase II stage oocyte)로 성숙되어 정자와 수정될 수 있는 능력을 가진다. 이 과정을 난자의 성숙 (oocyte maturation)이라 한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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