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문제 정의
- 본 연구는 실험적으로 중대뇌동맥을 폐쇄시켜유발된 허혈성 유발 백서모델을 대상으로 환경 강화와 말초신경 전기자극이 신경영양인자인 BDNF 와 Trk-B 수용기 발현에 미치는 영향을 시기에 따라 분석.관찰한 결과 환경의 차이와 말초 자극이신 경영 양인 자의 변화를 유발함을 확인할 수가 있었다.
- 그러므로 백서를 대상으로 하여 실험적인 국소 뇌허혈을 일으킨 후 자발적인 운동을 유발시킬 수 있는 환경 강화와 신경에 직접 자극을 주기 위하여 좌골신경에 전극을 대어 전기자극을 실시하였다. 운동기능회복에 영향을 미치는 신경영양인자인 BDNF와 Trk-B의 발현을 피질과 척수 후각에서의 확인하여 운동기능 회복을 이끄는 것에 대한 기전의 일부를 규명하는데 기여하고자 한다.
제안 방법
- 따라 중대뇌동맥페쇄 수술을 실시하였다. 70% N2O와 28.5% 02 가스에 1.5% enflurane을 혼합한 마취가스로 전신마취 후 수술을 실시하였다. 백서 목의 중앙선을 따라 절개한 다음 왼쪽 총경동맥을 미주신경과 분리하고 노출시켰다.
- 모든 슬라이드에 mounting media를 이용하여 cover 읺ass에 올렸다. BDNF와 Trk-B의 발현 정도는 면역조직화학 법으로 처리한 조직절편을 광학현미경으로 관찰하였다.
- 01M PBS로 세척한 후 남아있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 1% normal blocking serum 으로 1시간 처리하였다. 과산화수소 용액에 20분간 처리 후, 다시0.01M PBS로 여러 번 세척한 후 Novostain Super ABC Kit(Novocastra Lab, Benton Lane, UK.)를 사용하여 20분간 반응시키고, 각각 anti-BDNF(l:200, Chemicon, U.S.A.)와 anti-Trk-B(Santa cruz, U.S.A.)로 4 ℃에서 24시간 처리한 후 0.01M PBS로 수세하고’ 이후 anti-rabbit IgG (Vector, Chemicon, USA.) 로 합성시킨 후 0.1% Trition X-100으로 90 분 동안 반응시켰다. 다시 절편을 0.
- 관찰 부위는 뇌손상 부위의 조직 손실로 관찰이 불가능하여 손상 인접 조직을 관찰하였다. 대조염색 결과 BDNF는 세포체와 긴 세포 돌기 모양이 진한 갈색으로 관찰되었다.
- 관찰 부위는 척수후각 부위를 관찰하였다. 대조염색 결과 BDNF와 Trk-B는 세포체와 긴 세포 돌기 모양이 진한 갈색으로 관찰되었다.
- 그러므로 백서를 대상으로 하여 실험적인 국소 뇌허혈을 일으킨 후 자발적인 운동을 유발시킬 수 있는 환경 강화와 신경에 직접 자극을 주기 위하여 좌골신경에 전극을 대어 전기자극을 실시하였다. 운동기능회복에 영향을 미치는 신경영양인자인 BDNF와 Trk-B의 발현을 피질과 척수 후각에서의 확인하여 운동기능 회복을 이끄는 것에 대한 기전의 일부를 규명하는데 기여하고자 한다.
- 1% Trition X-100으로 90 분 동안 반응시켰다. 다시 절편을 0.01M PBS로 10분씩 3회 수세한 후 PBS 로 희석한 ABC Kit(Vector, U.S.A.)로 60분간 반응시켰으며, 0.01M PBS 로 수세과정을 거쳐 10분간 DAB03-Diaminobenzidine, ZYMED Lab, Germany) 으로 발색을 실시하였다. 최종적 보존적 조직검사를 위해 Hematoxylin(MHS-32, Sigma, U.
- 수술이 끝난 후 수술 부위를 봉합, 소독하였다. 면역조직학적 평가를 확인하기 위하여 허혈성 뇌졸중 유발 후 1, 3, 7, 14일에 각 군당 5마리씩 할당하여 조사하였다.
- 본 연구는 뇌졸중 모델에서 전기자극과 환경 강화를 통하여 뇌와 척수 조직에서 신경성장인자인 BDNF와 Trk-B의 발현을 면역조직화학법으로 관찰, 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서도 운동행동학적 변화와 관련하여 신경세포의 생존과 성장에 관여하는 BDNF 와 Trk-B의 발현 정도를 뇌조직과 척수 조직에서 관찰하였다. 뇌허혈 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 II군에서는 BDNF와 Trk-B가 3일과 7일에는 낮은 면역 양성 세포 반응을 보이다가, 14일째에 명확하게 증가된 면역 반응 양성 세포가 나타났으나, 말초신경 전기자극을 적용한 Ⅲ군과 환경 강화를 적용한 IV군에서는 BDNF와 Trk-B가 7일째부터 명확하게 증가된 면역반응 양성세포가 나타났을 뿐만 아니라 14일에는 양성세포의 수가 더욱 증가됨을 보였다.
- 체외로 노출된 전선은 전기자극기에 연결하여 전기자극을 실시하였다. 이때 전기자극은 빈도는 1 Hz, 강도는 가시수축이 일어나는 시점으로 하고, 맥동 폭은 200 ㎲로 하였으며, 마취 후 주 5회 30분씩 적용하였다.
- 실시하였다. 조직절편을 완충액 0.01M PBS로 세척한 후 남아있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 1% normal blocking serum 으로 1시간 처리하였다. 과산화수소 용액에 20분간 처리 후, 다시0.
- 중앙에는 두께 20 mm의 로프를 현수 시키고, 바닥에는 지름 50 mm, 길이 100 mm정도의 T자 모형의 터널을 설치하였다. 중대뇌동맥폐쇄로 허혈성 뇌졸중을 유발한 직후부터 환경 강화 사육장에서 생활 하도록 하였다.
- 고정된 전선은 피하를 통해 백서의 경부까지 유도하고 체외로 노출시킨 후 고정하였다. 체외로 노출된 전선은 전기자극기에 연결하여 전기자극을 실시하였다. 이때 전기자극은 빈도는 1 Hz, 강도는 가시수축이 일어나는 시점으로 하고, 맥동 폭은 200 ㎲로 하였으며, 마취 후 주 5회 30분씩 적용하였다.
- 백서 목의 중앙선을 따라 절개한 다음 왼쪽 총경동맥을 미주신경과 분리하고 노출시켰다. 총경 동맥으로부터 외경동맥과 내경동맥을 주변 신경과 분리해내고, 총경동맥과 외경동맥을 실로결찰한 후 내경동맥 분지의 기시부를 절개하여 1.5 cm 길이의 4-0 나일론 수술용 봉합사에 실리콘(Xantopren, Bayer Dental, Germany)으로 16 mm 길이로 코팅하여 만든 프로브를 내경동맥 쪽으로 밀어 넣고 내경동맥을 실을 묶어 프로브를 고정하고 미세클립을 제거하였다. 수술이 끝난 후 수술 부위를 봉합, 소독하였다.
- 01M PBS 로 수세과정을 거쳐 10분간 DAB03-Diaminobenzidine, ZYMED Lab, Germany) 으로 발색을 실시하였다. 최종적 보존적 조직검사를 위해 Hematoxylin(MHS-32, Sigma, U.S.A.)로 3분간 염색한 후 흐르는 물에서 수세하고 탈수 하였다. 모든 슬라이드에 mounting media를 이용하여 cover 읺ass에 올렸다.
- 파라핀 포매를 하여 5 ㎛ 두께로 박절한 관상 절편에서 면역조직화학 반응 검사를 실시하였다. 조직절편을 완충액 0.
- 허혈성 뇌졸중 유발 백서의 손상 측 좌골신경에 전기자극을 실시하기 위하여 Ridding 등(2000) 의 연구를 수정한 방법을 사용하였다. 좌골신경에 직경 0.
대상 데이터
- Ohlsson과 Johansson(1995)의 연구에서 사용된 환경을 수정하여 환경 적응 훈련을 위해 사육장을 900 X 600 X 600mm 크기의 철재로 제작하였다. 바닥에는 아크릴판을 깔고 그 위에 밀짚을 깔았으며, 내부에는 폭 50 mm, 길이 1,000 iml의 긴 막대를 200 mm 높이로 수평하게 설치하였다.
- 본 실험에서는 생후 10주령의 체중 250 ± 20 g 의 Sprague-Dawley 계 백서(웅성, 중앙실험동물) 100마리를 각 군당 20마리씩 5군으로 분류하여 사용하였다. 사육실의 온도는 25 ±1 ℃, 습도 55 ± 10%를 유지 하였으며, 명암은 12시간 주기로 하였다.
- 사육장의 한쪽 면에 500 X 300 urn의 난간을 설치하고 먹이와 물을 두었으며, 체인은 약 60°로 약간 쳐지게 설치하였다. 중앙에는 두께 20 mm의 로프를 현수 시키고, 바닥에는 지름 50 mm, 길이 100 mm정도의 T자 모형의 터널을 설치하였다. 중대뇌동맥폐쇄로 허혈성 뇌졸중을 유발한 직후부터 환경 강화 사육장에서 생활 하도록 하였다.
이론/모형
- 뇌허혈 모델을 제작하기 위해 Bland 등(2001)의 방법에 따라 중대뇌동맥페쇄 수술을 실시하였다. 70% N2O와 28.
성능/효과
- 대조염색 결과 BDNF와 Trk-B는 세포체와 긴 세포 돌기 모양이 진한 갈색으로 관찰되었다. I군은 BDNF(Table 4, Figure 3), Trk-B(Table 5, Figure 4) 발현이 전혀 보이지 않았으며, II군은 3일과 7일에 낮은 면역 반응이 관찰되었고, 14일에는 면역반응이 증가됨을 보였다. Ⅲ과 IV군은 1일과 3일에 낮은 면역 양성 반응을 보이다가 7일부터 증가되어 14일에는 많은 면역 반응을 보였다.
- 나타났다. m, IV, V군에서는 신경세포의 변성과 파괴, 연화반웅 등이 호전되었으며, 그 중 V군이 I 군과 비슷한 뇌조직의 형태가 관찰되었다.
- 분석.관찰한 결과 환경의 차이와 말초 자극이신 경영 양인 자의 변화를 유발함을 확인할 수가 있었다. 그러나 본 연구에서의 얻어진 결과들은 실험 동물을 대상으로 실시하였고, 운동 기능향상의원인 이 되는 기전의 일부를 신경전달물질에 국한되어 변화를 관찰한 것이므로, 실제 뇌 손상 환자들의 치료의 환경과 운동기능 향상 결과를 뇌의 조직학적 및 화학적 변화와 함께 말초의 자극이 뇌에 끼치는 영향을 설명할 수 있는 임상적 연구 등이 다각적으로 이루어져야 할 것이다.
- 뇌의 피질과 척수 조직에서의 신경인자인 BDNF와 Trk-B를 관찰한 결과 II군에서는 14일째에 진하고, 증가된 면역 반응 양성 세포가 나타났고, DI, IV군에서 BDNF와 Trk-B는 7일서부터 진하고, 증가된 면역반응 양성세포가 나타났으며, V군에서의 BDNF와 Trk-B는 3일부터 진한 면역반응 양성세포가 나타났으며, 7일과 14일에는 점차 증가하여 H, DI, IV군에 비하여 가장 진하고 많은 면역반응 양성세포를 보였다.
- 뇌의 형태학적 관찰결과 허혈성 뇌졸중 유발 8 주 후 IV군을 제외한 모든 실험군에서 뇌 조직의 신경세포 파괴와 감소, 변형, 연화반응 등의 소견이 관찰되었으며, 특히 H 군에서 가장 심한 소견이 나타났다. m, IV, V군에서는 신경세포의 변성과 파괴, 연화반웅 등이 호전되었으며, 그 중 V군이 I 군과 비슷한 뇌조직의 형태가 관찰되었다.
- 뇌허혈 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 II군에서는 BDNF와 Trk-B가 3일과 7일에는 낮은 면역 양성 세포 반응을 보이다가, 14일째에 명확하게 증가된 면역 반응 양성 세포가 나타났으나, 말초신경 전기자극을 적용한 Ⅲ군과 환경 강화를 적용한 IV군에서는 BDNF와 Trk-B가 7일째부터 명확하게 증가된 면역반응 양성세포가 나타났을 뿐만 아니라 14일에는 양성세포의 수가 더욱 증가됨을 보였다. 하지만 환경강화와 말초신경 전기자극을 함께 적용한 V군에서는 BDNF 와 Trk-B가 3일부터 명확한 면역반응 양성 세포가 나타났으며, 시간이 지날수록 점차 증가하여 Ⅱ, Ⅲ, IV군에 비하여 더 선명하고 많은 면역반응양성 세포를 보였다.
- 하지만 환경강화와 말초신경 전기자극을 함께 적용한 V군에서는 BDNF 와 Trk-B가 3일부터 명확한 면역반응 양성 세포가 나타났으며, 시간이 지날수록 점차 증가하여 Ⅱ, Ⅲ, IV군에 비하여 더 선명하고 많은 면역반응양성 세포를 보였다. 뇌허혈 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 Ⅱ군에 비해 환경강화를 적용하거나 말초신경 전기자극은 적용한 군들은 초기에서부터 BDNF와 Trk-B의 발현 증가를 확인할 수 있었다.
- 대조염색 결과 BDNF는 세포체와 긴 세포 돌기 모양이 진한 갈색으로 관찰되었다. I군에서는 BDNF 발현이 전혀 보이지 않았으며, II군은 3, 7 일에 낮은 면역 반응이 관찰되었고, 14일에는 면역 반응이 증가됨을 보였다.
- 대조염색 결과 BDNF와 Trk-B는 세포체와 긴 세포 돌기 모양이 진한 갈색으로 관찰되었다. I군은 BDNF(Table 4, Figure 3), Trk-B(Table 5, Figure 4) 발현이 전혀 보이지 않았으며, II군은 3일과 7일에 낮은 면역 반응이 관찰되었고, 14일에는 면역반응이 증가됨을 보였다.
- 대조염색 결과 Trk-B는 세포체와 긴 세포 돌기 모양이 진한 갈색으로 관찰되었다. I군에서는 Trk-B 발현이 전혀 보이지 않았으며, II군은 3일과 7일에 낮은 면역 반응이 관찰되었고, 14일에는 면역 반응이 증가됨을 보였다.
- 본 연구에서도 환경강화와 말초신경 전기자극을 하였을 경우 실험대조군에 비하여 피질의 손상회복의 정도와 신경원의 크기와 밀도, 신경연접의 수 및 크기, 조직 부피의 증가를 일으켜 선행연구와 유사한 결과가 나와 환경강화와 말초신경 전기자극이 조직학적 발달을 유발함을 확인할 수 있었다. Cotman과 Berchtold(2002)는 BDNF가 glutamatergic neurons 을 포함한 많은 neuronal subtype의 생존과 성장에 관여하고 시냅스 효율성과 신경학적 연결, 사용-의존 가소성의 주된 조절인자라고 정의 하였다.
- 뇌허혈 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 II군에서는 BDNF와 Trk-B가 3일과 7일에는 낮은 면역 양성 세포 반응을 보이다가, 14일째에 명확하게 증가된 면역 반응 양성 세포가 나타났으나, 말초신경 전기자극을 적용한 Ⅲ군과 환경 강화를 적용한 IV군에서는 BDNF와 Trk-B가 7일째부터 명확하게 증가된 면역반응 양성세포가 나타났을 뿐만 아니라 14일에는 양성세포의 수가 더욱 증가됨을 보였다. 하지만 환경강화와 말초신경 전기자극을 함께 적용한 V군에서는 BDNF 와 Trk-B가 3일부터 명확한 면역반응 양성 세포가 나타났으며, 시간이 지날수록 점차 증가하여 Ⅱ, Ⅲ, IV군에 비하여 더 선명하고 많은 면역반응양성 세포를 보였다. 뇌허혈 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 Ⅱ군에 비해 환경강화를 적용하거나 말초신경 전기자극은 적용한 군들은 초기에서부터 BDNF와 Trk-B의 발현 증가를 확인할 수 있었다.
후속연구
- 관찰한 결과 환경의 차이와 말초 자극이신 경영 양인 자의 변화를 유발함을 확인할 수가 있었다. 그러나 본 연구에서의 얻어진 결과들은 실험 동물을 대상으로 실시하였고, 운동 기능향상의원인 이 되는 기전의 일부를 신경전달물질에 국한되어 변화를 관찰한 것이므로, 실제 뇌 손상 환자들의 치료의 환경과 운동기능 향상 결과를 뇌의 조직학적 및 화학적 변화와 함께 말초의 자극이 뇌에 끼치는 영향을 설명할 수 있는 임상적 연구 등이 다각적으로 이루어져야 할 것이다.
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