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문제 정의
- 본 연구에서는 지리산권 지역에 재배되는 생약재 중에 항고혈압 약리작용이 있을 것으로 예상되는 두충의 기능성 식품으로서 이용 가능성을 평가하기 위하여, 두충의 항고혈압 활성 물질을 분리 및 확인하였고, 각 부위별(잎, 껍질, 줄기)추출물의 활성 관련물질의 함량 및 ACE 저해활성을 조사하였다.
- 본 실험에서도 볶음 공정을 통하여 두충 잎은 PDG 함량이 약간 감소현상을 나타내었는데, 두충 껍질과 줄기의 경우는 잎에 비하여 열처리에 의하여 그 함량이 오히려 증가되었다. 이는 잎과 줄기 및 껍질의 목질부 조직 특성과 열처리에 의한 불용성 고분자 화합물로부터 유리형 화합물로 전환 등에 차이로 생각되지만(35), 추후 두충 부위별 전 처리 공정에 따른 주요 성분들의 변화를 구체적으로 조사하고자 한다.
가설 설정
- 3)Means in the same column followed by different letters are significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 그 중에서 Fr. G를 다시 AcCN/water＝9/1～0/10의 용매조합으로 silica gel column chromatography를 실시한 후 TLC로서 확인하여 8개의 분획(G-1～G-8)을 얻었다. 다시 분획 G-8을 AcCN/water＝9/1의 용매로 reverse phase column chromatography를 실시하여 22개의 소분획(G-8-1～G-8-22)으로 분리하였으며, 이를 TLC로서 확인하여 G-8-4～G-8-8을 따로 모아 감압 농축하여 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)로 추정되는 물질을 확인하여 8A라고 명명하였다(Fig.
- 고혈압치료에 이용하는 자연 건조한 두충 껍질에 10배 정도의 물을 가하고 1시간 동안 열수 추출하여 3회 반복한 전체 추출액을 감압 농축하여 58.75 g의 water extract를 얻은 후, silica gel column chromatography, thin layer chromatography(TLC), reverse phase column chromatography를 순차적으로 실시하여 각각의 소 분획으로 분리ㆍ확인과정을 통하여 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)로 추정되는 물질 약 16 mg을 분리ㆍ정제하였다(실험방법 참조).
- 다시 분획 G-8을 AcCN/water＝9/1의 용매로 reverse phase column chromatography를 실시하여 22개의 소분획(G-8-1～G-8-22)으로 분리하였으며, 이를 TLC로서 확인하여 G-8-4～G-8-8을 따로 모아 감압 농축하여 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)로 추정되는 물질을 확인하여 8A라고 명명하였다(Fig. 1).
- 대조구는 추출물 대신에 추출용매를 50 μL 가해 실험하였으며, ACE 저해활성효과는 다음의 계산식을 이용하여 산출하였다.
- 두충의 기능성 식품으로서 이용 가능성을 평가하기 위하여, 두충의 항고혈압 활성 물질을 분리 및 확인하였고, 각 부위별(잎, 껍질, 줄기) 추출물의 관련물질의 함량 및 ACE 저해활성을 조사하였다. 두충에서 분리한 항고혈압성 물질로 추정되는 8A는 순도 95.
- 두충의 부위별 항고혈압 활성물질의 함량을 정량하기 위하여 Fig. 1과 같이 분리 및 정제를 실시하였다. 즉 두충의 항고혈압 활성물질로 알려져 있는 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)를 분리하기 위하여 우선 한방에서 두 충을 고혈압치료에 주로 이용하고 있는 자연 건조한 껍질(raw bark) 1 kg에 10 L의 물을 가하고 1시간 동안 끓여서 3회 반복하여 추출하였으며, 추출액을 따로 모아 감압 농축하여 58.
- 자연 건조된 두충의 잎, 껍질, 줄기 등을 각각 10 kg씩을 공급받아 그 중에서 5 kg씩은 200℃의 오븐에서 볶은 후에 실험에 사용하였다. 시료는 잎(LW, raw leaf; LT, roasted leaf), 껍질(BW, raw bark; BT, roasted bark) 및 줄기(SW, raw stem; ST, roasted stem)로 구분하였다.
- 두충의 부위별로 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside 함량을 분석하기 위한 방법은 다음과 같다. 우선 두충 시료각 10 g씩을 정확히 칭량하여 100 mL의 물을 가하여 90～95℃에서 2시간 가열한 후 추출액을 모았다. 이 과정은 3회 반복하여 실시하였으며 모은 추출액을 rotary vacuum evaporator로서 완전히 농축하고 나서 10 mL의 3차 증류수에 녹였으며, 이를 0.
- 5 mL을 가해 15초 동안 교반한 후 원심분리(3,000 rpm, 5 min, 4 ℃)하여 상등액 1 mL을 얻었다. 이 상등액을 완전히 건조시켜 증류수 3 mL을 넣은 후에 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 대조구는 추출물 대신에 추출용매를 50 μL 가해 실험하였으며, ACE 저해활성효과는 다음의 계산식을 이용하여 산출하였다.
- 대조구는 추출물 대신에 추출용매를 50 μL 가해 실험하였으며, ACE 저해활성효과는 다음의 계산식을 이용하여 산출하였다. 이 실험에 사용한 positive control은 현재 병원에서 고혈압 환자에게 투약하고 있는 CaptoprilⓇ(보령제약)과 EnalaprilⓇ(보령제약)을 구입하여 시료와 그 활성을 비교하였으며 모든 실험은 3회 반복하여 시행하였다.
- 75 g의 water extract를 얻었다. 이것을 CHCl3/MeOH/water=8/2/0.2～7/3/0.5의 용매조합으로 silica gel column chromatography를 실시한 후 thin layer chromatography(TLC)로서 확인하여 7개의 분획(Fr. A～Fr. G)을 얻었다. 그 중에서 Fr.
- 즉 두충의 항고혈압 활성물질로 알려져 있는 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)를 분리하기 위하여 우선 한방에서 두 충을 고혈압치료에 주로 이용하고 있는 자연 건조한 껍질(raw bark) 1 kg에 10 L의 물을 가하고 1시간 동안 끓여서 3회 반복하여 추출하였으며, 추출액을 따로 모아 감압 농축하여 58.75 g의 water extract를 얻었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 시약은 모두 특급(GR) 및 1급 시약을 사용하였으며, column chromatography는 silica gel(70～230 mesh, Merck), Lichro-prep RP-18(40～63 μm, Merck)를 사용하였으며 preparative TLC는 Kiesel gel 60 F plate(0.5 mm, Merck)를 사용하였다.
- 실험에 사용한 두충(Eucommia ulmoides Oliver)은 산청군 두충재배 농장으로부터 공급받아 사용하였다. 자연 건조된 두충의 잎, 껍질, 줄기 등을 각각 10 kg씩을 공급받아 그 중에서 5 kg씩은 200℃의 오븐에서 볶은 후에 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 두충(Eucommia ulmoides Oliver)은 산청군 두충재배 농장으로부터 공급받아 사용하였다. 자연 건조된 두충의 잎, 껍질, 줄기 등을 각각 10 kg씩을 공급받아 그 중에서 5 kg씩은 200℃의 오븐에서 볶은 후에 실험에 사용하였다. 시료는 잎(LW, raw leaf; LT, roasted leaf), 껍질(BW, raw bark; BT, roasted bark) 및 줄기(SW, raw stem; ST, roasted stem)로 구분하였다.
이론/모형
- 두충의 부위별 추출물과 이로부터 분리한 pinoresinol4,4'-di-O-β-D-glucoside의 항고혈압 활성은 angiotensin converting enzyme(ACE)의 활성을 억제하는 효능을 검색하는 방법(이하 ACE assay)으로 측정하였다. ACE assay는 Cushman과 Cheung(34) 및 Kim 등(18)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉 ACE 저해활성은 0.
- 두충의 부위별 추출물과 이로부터 분리한 pinoresinol4,4'-di-O-β-D-glucoside의 항고혈압 활성은 angiotensin converting enzyme(ACE)의 활성을 억제하는 효능을 검색하는 방법(이하 ACE assay)으로 측정하였다.
성능/효과
- 75 g의 water extract를 얻은 후, silica gel column chromatography, thin layer chromatography(TLC), reverse phase column chromatography를 순차적으로 실시하여 각각의 소 분획으로 분리ㆍ확인과정을 통하여 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)로 추정되는 물질 약 16 mg을 분리ㆍ정제하였다(실험방법 참조). 그 결과로 Fig. 2의 HPLC chromatogram에 나타낸 바와 같이 두충에서 분리한 항고혈압 활성을 갖는 8A 물질의 순도는 95.64%로서 상당히 순수한 상태까지 분리ㆍ정제되었음을 알 수 있었다.
- 4에 나타내었다. 동일한 농도를 처리하였을 때 혈압강하 활성을 비교하여 보면, 1 mg/mL 처리에서 분리물질 8A의 활성은 91.87%로서 EnalaprilⓇ의 97.24%보다는 조금 낮았지만, CaptoprilⓇ의 90.32%보다 약간 높은 항고혈압 활성을 나타내었다. 그리고 8A 성분의 농도를 0.
- 73%로 높은 활성을 나타내었으며, 줄기는 상당히 낮게 나타났다. 두충에서 분리한 PDG를 1 mg/mL 처리할 때, ACE 저해활성은 91.87%로서 EnalaprilⓇ의 97.06%보다는 조금 낮았지만, CaptoprilⓇ의 90.32% 보다는 약간 높은 항고혈압 활성을 나타내었다.
- 두충에서 분리한 항고혈압성 물질로 추정되는 8A는 순도 95.64%의 pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucoside(PDG)로서 자연건조 및 볶은 껍질에서 가장 높았으며, 각각 135.13 mg%와 163.67 mg%였다.
- 19%로서 비교적 낮은 저해활성을 나타내었다. 또한 5 mg/mL 처리하였을 때에는 잎과 줄기에서는 큰 변화가 없었으나, 껍질에서는 항고혈압 활성(자연건조 껍질 45.62%, 볶은 껍질 12.09%)이 10 mg/mL에서보다 각각 60.25, 15.98%까지 저하되었으며, 1 mg/mL 처리하였을 때 모든 시료의 저해활성 평균은 28.05%로서, 그 저해활성 범위가 낮은 볶은 껍질 4.68%에서 높은 볶은 잎 52.23% 범위로 다른 부위에 비하여 추출물 농도 저하에 따라 활성이 현저하게 떨어지는 것을 알 수 있었다.
- 67 mg%였다. 또한 두충 추출물의 ACE 저해활성은 10 mg/mL 농도로 처리하였을 때 볶은 잎, 자연건조 껍질 및 볶은 껍질에서 각각 77.56%, 75.73%, 75.73%로 높은 활성을 나타내었으며, 줄기는 상당히 낮게 나타났다. 두충에서 분리한 PDG를 1 mg/mL 처리할 때, ACE 저해활성은 91.
- 또한 두충의 부위별로 PDG 함량은 자연건조 상태의 껍질 및 볶은 껍질에서 각각 135.13 mg%, 163.67 mg%로서 잎과 줄기에 비하여 껍질에서 가장 높은 함량을 나타내었으며, 이는 자연건조 두충 껍질이 그 잎 85.14 mg%와 줄기 70.49 mg%에 비하여 각각 1.59배, 2.17배 높은 함량이었고, 볶은 두충 껍질은 그 잎 69.72 mg%와 줄기 106.37 mg%에 비하여 각각 2.35배, 1.54배 높은 함량이었다. 특히 두충은 볶음공정을 통하여 혈압강하 효과를 나타내는 생리활성 물질인 PDG 의 함량이 껍질과 줄기에서 유의적으로 각각 1.
- 16%) 등이 많이 함유되어 있으며, 녹색 잎이 열처리한 볶은 잎보다 그 함량이 높다고 보고하였다. 본 실험에서도 볶음 공정을 통하여 두충 잎은 PDG 함량이 약간 감소현상을 나타내었는데, 두충 껍질과 줄기의 경우는 잎에 비하여 열처리에 의하여 그 함량이 오히려 증가되었다. 이는 잎과 줄기 및 껍질의 목질부 조직 특성과 열처리에 의한 불용성 고분자 화합물로부터 유리형 화합물로 전환 등에 차이로 생각되지만(35), 추후 두충 부위별 전 처리 공정에 따른 주요 성분들의 변화를 구체적으로 조사하고자 한다.
- 54배 높은 함량이었다. 특히 두충은 볶음공정을 통하여 혈압강하 효과를 나타내는 생리활성 물질인 PDG 의 함량이 껍질과 줄기에서 유의적으로 각각 1.21배, 1.51배 증가는 경향을 나타내었으나 잎은 오히려 18% 감소하였다. Takamura 등(36)은 녹색 두충 잎의 주요 천연물질로 geniposidic(2.
- 두충의 각 부위별 물 추출물의 수득율 및 PDG 함량은 Table 1과 같다. 표에서 나타난 바와 같이 두충 생시료의물 추출물 수득율은 5.02～5.36% 범위로 큰 차이가 없었으며, 그리고 볶은 두충의 경우 잎과 껍질은 각각 5.87%와 6.01%로서 줄기의 5.22%에 비하여 약간 높은 수득율을 나타내었다. 이는 가열에 의하여 불용성 고분자 화합물로부터 유리되어 각 부위별 물 추출에 약간 용이한 것으로 생각되었으며(35), 대체로 생약재는 그 구성성분들이 상당히 차이가 나타나기 때문에, 그에 따른 물 추출의 경우에도 각각의 수율이 0.
- 한편 이상의 결과에서 두충의 부위별 ACE 저해활성은 10 mg/mL 농도에서 잎과 껍질이 높았고, 줄기는 상대적으로 저해활성이 낮았는데, 두충의 대표적인 혈압강하 물질 PDG 함량과는 다소 일치하지 않은 부분이 있었다. 특히 두충 잎에는 본 연구에서 분리한 PDG 이외에 플라보노이드 화합물인 isoquercitrin을 포함한 각종 알칼로이드와 배당체 화합물 등이 함유되어 있어(37,38), 두충 잎 추출물의 경우에는 그 껍질과 줄기의 추출물에 비하여 항고혈압 활성이 다소 높게 나타난 것으로 생각된다.
후속연구
- 그러나 대부분은 두충의 추출물에 대한 활성 탐색에 관한 결과로서, 고혈압 예방에 유용한 활성물질 개발의 기초 자료로는 미비하였으며, 본 실험을 수행한 결과로 활성물질 개발의 기초자료로서 활용성이 기대된다. 또한 앞으로 활성물질에 대한 순도 확인과 실험이 수행되어야 하며, 동물모델을 이용한 효능 검증이 추가적으로 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 그러나 대부분은 두충의 추출물에 대한 활성 탐색에 관한 결과로서, 고혈압 예방에 유용한 활성물질 개발의 기초 자료로는 미비하였으며, 본 실험을 수행한 결과로 활성물질 개발의 기초자료로서 활용성이 기대된다. 또한 앞으로 활성물질에 대한 순도 확인과 실험이 수행되어야 하며, 동물모델을 이용한 효능 검증이 추가적으로 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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