β-hexosaminidase 분비 억제 및 각질형성세포 분화에 대한 두충(Eucommia ulmoides Oliver) 추출물의 효과 Effects of Eucommia ulmoides Oliver Extract on Inhibition of β-hexosaminidase and Keratinocyte Differentiation원문보기
본 연구에서는 두충 추출물이 RBL-2H3 세포의 ${\beta}$-hexosaminidase의 분비 억제와 HaCaT keratinocytes 피부장벽의 회복과 관련한 filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1), cornified cell envelope(CE)의 발현에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. ${\beta}$-hexosaminidase 방출 억제 능은 13% 효능을 확인하였고, 피부장벽기능의 회복과 관련된 인자들은 발현과 활성의 정도가 매우 우수한 것을 확인하였다. 각질형성세포의 분화를 판단할 수 있는 CE 측정에서는 두충추출물이 양성대조군보다 더 좋은 효능을 나타내기도 하였다. 따라서 두충 추출물은 ${\beta}$-hexosaminidase 분비 억제에 효과가 있으며, 손상된 피부장벽강화에 영향을 미치는 각질형성세포의 분화 촉진에 효과가 있음을 확인하였다.
본 연구에서는 두충 추출물이 RBL-2H3 세포의 ${\beta}$-hexosaminidase의 분비 억제와 HaCaT keratinocytes 피부장벽의 회복과 관련한 filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1), cornified cell envelope(CE)의 발현에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. ${\beta}$-hexosaminidase 방출 억제 능은 13% 효능을 확인하였고, 피부장벽기능의 회복과 관련된 인자들은 발현과 활성의 정도가 매우 우수한 것을 확인하였다. 각질형성세포의 분화를 판단할 수 있는 CE 측정에서는 두충추출물이 양성대조군보다 더 좋은 효능을 나타내기도 하였다. 따라서 두충 추출물은 ${\beta}$-hexosaminidase 분비 억제에 효과가 있으며, 손상된 피부장벽강화에 영향을 미치는 각질형성세포의 분화 촉진에 효과가 있음을 확인하였다.
In this study, Eucommia ulmoides Oliver extracts was studied in order to see any effects on the ${\beta}$-hexosaminidase release suppression of RBL-2H3 cells and on the expression of filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1) and cornified cell envelope (CE) related to the recovery of HaCaT ...
In this study, Eucommia ulmoides Oliver extracts was studied in order to see any effects on the ${\beta}$-hexosaminidase release suppression of RBL-2H3 cells and on the expression of filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1) and cornified cell envelope (CE) related to the recovery of HaCaT keratinocyte skin barrier. Results showed that Eucommia ulmoides Oliver extracts reduced ${\beta}$-hexosaminidase release in RBL-2H3 cells and increased the effects of Eucommia ulmoides Oliver extract on the expression of filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1) and cornified cell envelope (CE) in HaCaT keratinocytes. Taken together, these results suggested that Eucommia ulmoides Oliver extract may be applicable for keratinocyte differentiation.
In this study, Eucommia ulmoides Oliver extracts was studied in order to see any effects on the ${\beta}$-hexosaminidase release suppression of RBL-2H3 cells and on the expression of filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1) and cornified cell envelope (CE) related to the recovery of HaCaT keratinocyte skin barrier. Results showed that Eucommia ulmoides Oliver extracts reduced ${\beta}$-hexosaminidase release in RBL-2H3 cells and increased the effects of Eucommia ulmoides Oliver extract on the expression of filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1) and cornified cell envelope (CE) in HaCaT keratinocytes. Taken together, these results suggested that Eucommia ulmoides Oliver extract may be applicable for keratinocyte differentiation.
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문제 정의
본 연구에서는 두충 추출물이 민감성 피부를 완화시킬 수 있는 생리활성 효능이 있는지를 확인하기 위하여 알러지의 증상을 완화 시키는데 중요한 역할을 하는 β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다. 또한 cornified cell envelope (CE), transglutaminase-1(TGase-1) 및 filaggrin의 발현 양을 확인하여 피부 장벽기능을 보호 및 회복하는 효능을 나타내는지 확인 하여 두충이 천연물 소재의 민감성 피부 보호용 미용 제로서의 가능성을 살펴보고자 하였다.
본 연구에서는 두충 추출물이 RBL-2H3 세포의 β-hexosaminidase의 분비 억제와 HaCaT keratinocytes 피부장벽의 기능을 강화시키는 bio marker인 filaggrin, TGase-1, CE의 발현에 미치는 영향에 관하여 연구하였다.
본 연구에서는 두충 추출물이 민감성 피부를 완화시킬 수 있는 생리활성 효능이 있는지를 확인하기 위하여 알러지의 증상을 완화 시키는데 중요한 역할을 하는 β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다.
제안 방법
RBL-2H3 세포와 HaCaT 세포에 대한 두충 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다(Figure 1, Figure 2). 두충 추출물을 농도별로 처리한 결과 RBL-2H3 세포에서는 20 µg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인하였고, HaCaT cell의 경우 50 µg/mL의 농도에서 세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
1% Tween-20)로 5 min 동안 3회에 걸쳐 세척하였다. 그 다음 2차 antibody가 첨가된 용액을 넣고 마찬가지로 상온에서 1 h 교반 후 TBST (TBS containing 0.1% Tween-20)로 5 min 동안 3회에 걸쳐 세척하고 SuperSignalⓇ West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo, USA)를 이용하여 발색 시키고 x-ray 필름(AGFA, Germany)에 감광시켜 밴드를 확인 하였다. 내부 표준 단백질로는 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 사용하였다.
따라서 본 연구에서 세포에 처리하는 두충추출물의 농도를 RBL2H3 세포는 20 µg/mL, HaCaT 세포는 50 µg/mL으로 선정하여 실험을 수행하였다.
따라서 본 연구에서는 세포 외로 분비된 β-Hexosaminidase 분비량을 측정하여 두충 추출물의 항 알레르기 효능을 확인하였다(Figure 3).
물기가 없도록 잘 제거한 후에 SIGMAPASTTM OPD tablet (Sigma, USA)을 100 µL 넣고 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광 값을 측정하였다.
먼저 96-well plate에 세포를 1 × 105 cells/mL로 접종하고 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청을 포함하지 않은 배지를 이용하여 두충 추출물을 적정농도로 희석하여 well 당 처리하여 2 days 동안 배양한 후 배지를 제거하고 얼렸다 녹이기를 3회 반복하였다. 그 후 에탄올과 아세톤을 1 : 1 (v/v) 의 비율로 섞어 –20 ℃로 용액의 온도를 낮춘 후 각각의 well에 100 µL씩 넣어 4 ℃에서 30 min 처리하고 제거한 후에 약 20 min 간 plate를 건조시킨다.
그 후 Mini PROTEANⓇ Tetra cell (552BR, Bio-Rad, USA)을 이용하여 SDS-PAGE 후 Mighty small transphor (Amersham Bio Science, USA)를 이용하여 단백질을 Transfer membranes (Millipore, USA)로 전이하였다. 비특이적 단백질 결합부분은 0.1% Tween20 (Sigma, USA)과 5% 탈지분유를 포함한 Tris-Buffer saline (TBS)에 1 h 동안 반응하여 blocking하였다. 1차 antibody (Filaggrin: Santa Cruz Biotechnology, USA)는 1 :1,000 (v/v)으로 희석하여 상온에서 1 h 교반 후 TBST(TBS containing 0.
각각의 세포를 10% FBS와 1% PEST가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24-well plate에 2 × 105 cells/mL로 분주한 뒤 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 상층액 제거 후 FBS가 제외된 DMEM 배지에 각 시료를 처리하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 24 h 배양 후 상층액을 제거하고 QIAzol lysis reagent (QIAGEN sciences, USA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 RNA를 추출 하였고, M-MLV reverse transcriptase (USB corporation, USA)를 이용하여 50 ℃에서 1 h, 95 ℃에서 5 min 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실험에 사용한 PCR primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 Table 1과 같이 디자인하여 사용하였다.
연구와 관련된 단백질들의 발현 양을 알아보기 위하여 western blot 실험을 수행하였다. 각각의 세포를 10% FBS와 1% PEST가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 1 × 106 cells/mL로 6-well plate에 분주한 뒤 24 h 동안 배양하여 상층액을 제거한 후에 추출물을 처리 하여 24 h 추가 배양한 세포를 이용하였다.
추출물의 처리 농도는 세포 생존율 측정 결과에 따라 세포에 영향을 미치지 않는 최고농도인 20 µg/mL 로 처리하였다.
포유동물 표피 과립층의 각질 초자질 과립에서 전구단백질인 profilaggrin으로부터 합성되며, 보습인자 이자, TGase-1의 기질로 사용되는 단백질인 filaggrin[17-18]의 발현에 두충 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. RNA 발현 확인을 위해 수행한 RT-PCR 결과(Figure 4A) 두충 추출물을 처리하였을 경우 대조군인 0.
피부의 turn over 주기를 평가하기 위하여 transglutaminase-1의 발현 양을 측정하였다. 먼저 96-well plate에 세포를 1 × 105 cells/mL로 접종하고 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양하였다.
대상 데이터
건조된 두충(Eucommia ulmoides Oliver) 100 g을 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 두충 건조분말에 2 L의 70% 에탄올을 이용하여 실온에서 5 h 추출하였다.
내부 표준 단백질로는 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 사용하였다.
본 연구에 사용된 RBL-2H3, HaCaT 세포를 각각 10% FBS와 1% PEST가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1× 105 cells/mL의 농도로 희석하여 96-well plate에 100µL씩 분주한 뒤 24 h 배양하였다.
본 연구에서 사용한 세포 주는 비만세포인 RBL2H3과 각질형성세포인 HaCaT은 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)(HycloneⓇ, USA)과 1% penicillin-streptomycin (PEST)(HycloneⓇ, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)(HycloneⓇ, USA) 배지를 이용하여 세포배양접시에 접종한 후 37 ℃, 5% 이산화탄소를 공급하는 배양기(Forma Direct Heat CO2 Incubator, 311, Thermo, USA) 내에서 배양하였다.
상층액 제거 후 FBS가 제외된 DMEM 배지에 각 시료를 처리하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 24 h 배양 후 상층액을 제거하고 QIAzol lysis reagent (QIAGEN sciences, USA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 RNA를 추출 하였고, M-MLV reverse transcriptase (USB corporation, USA)를 이용하여 50 ℃에서 1 h, 95 ℃에서 5 min 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실험에 사용한 PCR primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 Table 1과 같이 디자인하여 사용하였다.
데이터처리
(1) Ca2+ 0.03 mM (2) Ca2+ 1.2 mM (3) Eucommia ulmoides Oliver 50 µg/mL (n = 4) ***p < 0.001, **p < 0.01 compared to control; one-way ANOVA, followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.
(n = 3) ***p < 0.001, **p< 0.01 compared to control; one-way ANOVA, followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.
(n = 3) ***p < 0.001, compared to control; one-way ANOVA, followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.
이론/모형
β-Hexosaminidase release assay는 Choi 등[15]의 방법을 이용하여 측정하였다.
각질 분화 유도능을 측정하기 위한 실험방법으로 Cornifide envelope assay를 수행하였다. HaCaT 세포를 24-well plate에 1 × 105 cells/mL로 접종하고 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양하였다.
배양을 완료한 세포의 생존율은 MTT (3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide; Sigma)(Sigma, USA) 환원 방법을 이용하여 측정[14]하였다. 본 연구에 사용된 RBL-2H3, HaCaT 세포를 각각 10% FBS와 1% PEST가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1× 105 cells/mL의 농도로 희석하여 96-well plate에 100µL씩 분주한 뒤 24 h 배양하였다.
장벽강화와 관련한 유전자의 mRNA 발현 양을 확인하기 위한 실험으로 RT-PCR을 이용하였다. 각각의 세포를 10% FBS와 1% PEST가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24-well plate에 2 × 105 cells/mL로 분주한 뒤 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양하였다.
성능/효과
포유동물 표피 과립층의 각질 초자질 과립에서 전구단백질인 profilaggrin으로부터 합성되며, 보습인자 이자, TGase-1의 기질로 사용되는 단백질인 filaggrin[17-18]의 발현에 두충 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. RNA 발현 확인을 위해 수행한 RT-PCR 결과(Figure 4A) 두충 추출물을 처리하였을 경우 대조군인 0.03 mM Ca2+ 비하여 mRNA 발현이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 마찬가지의 결과로 단백질의 발현 또한 대조군에 비하여 증가되어있음(Figure 4B)을 확인하였다.
추출물의 처리 농도는 세포 생존율 측정 결과에 따라 세포에 영향을 미치지 않는 최고농도인 20 µg/mL 로 처리하였다. 그 결과 anti-DNP만 처리한 군을 기준으로 양성대조군인 quercetin이 31%의 감소 효능을 보인데 비해 두충 추출물은 18%가 감소하는 효능을 확인하였다.
두충 추출물을 농도별로 처리한 결과 RBL-2H3 세포에서는 20 µg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인하였고, HaCaT cell의 경우 50 µg/mL의 농도에서 세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
CE의 측정은 피부장벽의 보호를 위한 최종단계인 각질형성세포의 분화를 판단할 수 있는 좋은 기준이 된다. 두충 추출물을 처리하여 CE를 측정한 결과(Figure 6) 대조군을 기준으로 보았을 때 양성대조군보다 더 높은 효능(360%)을 나타내어, 두충 추출물이 HaCaT 세포의 분화를 촉진하여 각화세포피를 형성하는데 뛰어난 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다.
따라서 두충 추출물은 β-hexosaminidase의 분비 억제에 효과가 있고, 각질형성세포의 분화에 영향을 주어 분화를 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다.
먼저 비만세포에서 알러지의 시초가 되는 물질인 β-hexosaminidase의 방출을 확인한 결과, anti-DNP 만 처리한 군을 기준으로 두충 추출물은 13%가 감소하는 효능을 확인하였다.
Transglutaminase는 각질세포 형성에 관여되는 구조단백질 사이를 연결하여 cornified cell envelop을 만드는데 관여하는 효소로서 단백질 내의 글루타민과 리신 사이를 연결하는 기능을 가지고 있는데, Transglutaminase-1은 기저층에서부터 발현이 되기 시작하여 극세포층, 과립층으로 갈수록 점차 발현이 높아지는 효소이다[19]. 피부 장벽층인 cornified cell envelop를 만드는데 가장 중요한 효소인 TGase-1의 발현을 측정한 결과 대조군에 비하여 31% 가량 발현이 증가되어 있다는 것을 알 수 있었으며(Figure 5A), RT-PCR 결과(Figure 5B) 또한 단백질의 발현과 같은 경향의 결과를 나타내 두충추출물을 처리한 군에서 mRNA의 발현양이 현저히 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.
먼저 비만세포에서 알러지의 시초가 되는 물질인 β-hexosaminidase의 방출을 확인한 결과, anti-DNP 만 처리한 군을 기준으로 두충 추출물은 13%가 감소하는 효능을 확인하였다. 피부장벽기능의 회복과 관련된 모든 bio marker들은 mRNA, protein, activity 모두에서 뛰어난 효능을 확인하였는데, Filaggrin의 경우 mRNA와 protein 모두에서 대조군보다 높은 발현을 나타내었으며, TGase-1은 activity와 mRNA 발현율 모두 높인다는 것을 확인하였다. 각질형성세포의 분화를 판단할 수 있는 CE 측정에서는 두충추출물이 양성대 조군보다 더 좋은 효능을 나타내기도 하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
두충을 이용한 차의 효능에는 어떤 것들이 있는가?
두충(杜冲) (Eucommia ulmoides Oliver)은 두충나무 과에 속하는 낙엽교목으로서 우리나라 중부이남 지역 어디에서나 잘 서식하며 약용가치가 높아 전국적으로 많이 재배되는 약용식물 중 하나이다. 이를 이용한 차는 항산화효과[8], 활성산소종의 소거작용[9], 항암효과[10,11], 항당뇨효과[12] 뿐만 아니라 collagen 생성을 촉진시키는 효과[13]까지 다방면에서 효능이 보고 되고 있다.
두충은 무엇인가?
두충(杜冲) (Eucommia ulmoides Oliver)은 두충나무 과에 속하는 낙엽교목으로서 우리나라 중부이남 지역 어디에서나 잘 서식하며 약용가치가 높아 전국적으로 많이 재배되는 약용식물 중 하나이다. 이를 이용한 차는 항산화효과[8], 활성산소종의 소거작용[9], 항암효과[10,11], 항당뇨효과[12] 뿐만 아니라 collagen 생성을 촉진시키는 효과[13]까지 다방면에서 효능이 보고 되고 있다.
민감성 피부가 급증한 이유는 무엇인가?
민감성 피부가 급증한 원인으로는 사회생활의 변화와 환경오염의 증가로 인한 피부 장벽 기능의 손상이다. 피부 장벽이란, 우리 피부의 가장 바깥층으로 우리가 볼 수 있는 피부 표면을 말한다.
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