B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)는 만성감염, 간암의 원인이 되는 등 가장 큰 공중보건문제 중의 하나이다. 그리하여 감염 초기에 바이러스의 DNA 농도를 측정하여 관찰 하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 기존의 Real Time-PCR과 새로운 방법인 Micro-PCR를 이용하여 HBV를 검출하였다. 단국대학교 병원에서 HBV 감염 환자의 혈청 샘플 120개를 얻은 후 분석하였고 각각 장비에서의 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성, 분석시간을 비교해 보았다. 그 결과 Micro-PCR과 Real-Time PCR은 높은 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성을 가지고 있었다. 그러나 Micro-PCR은 Real-Time PCR보다 빠른 시간 안에 증폭이 가능하며 조작하는데 있어 간편하였고 적은 양의 시약이 소모됨을 알 수 있었다. 그러므로 Micro-PCR은 신뢰성 있고 빠른 임상적 진단이나 각종 검사가 요구되는 곳에서 이용 가치가 높은 장비라 할 수 있겠다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)는 만성감염, 간암의 원인이 되는 등 가장 큰 공중보건문제 중의 하나이다. 그리하여 감염 초기에 바이러스의 DNA 농도를 측정하여 관찰 하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 기존의 Real Time-PCR과 새로운 방법인 Micro-PCR를 이용하여 HBV를 검출하였다. 단국대학교 병원에서 HBV 감염 환자의 혈청 샘플 120개를 얻은 후 분석하였고 각각 장비에서의 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성, 분석시간을 비교해 보았다. 그 결과 Micro-PCR과 Real-Time PCR은 높은 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성을 가지고 있었다. 그러나 Micro-PCR은 Real-Time PCR보다 빠른 시간 안에 증폭이 가능하며 조작하는데 있어 간편하였고 적은 양의 시약이 소모됨을 알 수 있었다. 그러므로 Micro-PCR은 신뢰성 있고 빠른 임상적 진단이나 각종 검사가 요구되는 곳에서 이용 가치가 높은 장비라 할 수 있겠다.
Hepatitis B is a serious public health problem leading to chronic infection and liver cancer. Quantitation of circulating hepatitis B virus (HBV) is important for monitoring disease progression and for assessing the response to antiviral therapy. In this study, by using Real-Time PCR and novel Micro...
Hepatitis B is a serious public health problem leading to chronic infection and liver cancer. Quantitation of circulating hepatitis B virus (HBV) is important for monitoring disease progression and for assessing the response to antiviral therapy. In this study, by using Real-Time PCR and novel Micro-PCR assay method, we measured HBV concentration in the clinical sample. A total of 120 serum samples from patients with HBV infection collected was in Dankook university hospital to compare the detection limit, sensitivity, specificity and reproducibility of the two assay methods. These findings of this study suggest that Micro-PCR and Real-Time PCR assay methods are comparable to each other in there detection limit, sensitivity, and reproducibility for HBV DNA quantitation. However, Micro-PCR assay is more efficient than Real-Time PCR method, because Real-Time PCR is not so time - consuming, technically easy and need to reagent of a small quantity. It will be useful for rapid and reliable clinical diagnosis of HBV in many countries.
Hepatitis B is a serious public health problem leading to chronic infection and liver cancer. Quantitation of circulating hepatitis B virus (HBV) is important for monitoring disease progression and for assessing the response to antiviral therapy. In this study, by using Real-Time PCR and novel Micro-PCR assay method, we measured HBV concentration in the clinical sample. A total of 120 serum samples from patients with HBV infection collected was in Dankook university hospital to compare the detection limit, sensitivity, specificity and reproducibility of the two assay methods. These findings of this study suggest that Micro-PCR and Real-Time PCR assay methods are comparable to each other in there detection limit, sensitivity, and reproducibility for HBV DNA quantitation. However, Micro-PCR assay is more efficient than Real-Time PCR method, because Real-Time PCR is not so time - consuming, technically easy and need to reagent of a small quantity. It will be useful for rapid and reliable clinical diagnosis of HBV in many countries.
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제안 방법
Master mix와 DNA를 1:1로 섞 어 20 jiL으］ PCR 반응 용액을 0.2 mL PCR 반응 시 험관에 넣은 후, RealTime PCR(Corbett, Rotor-Gene, USA)을 이용해서 우선 50 °C에서 2 분간 Uracil-N-Glycosylase를 활성화 시키고 95。(3에서 1 분간 주형 DNA를 완전히 변성시킨 후 다시 94。(：에서 20 초간 변성, 60。(：에서 20 초간 결합, 72。(3에서 30 초간 신장 단계를 40회 반복하여 DNA를 증폭시켰고 마지막으로 60-90 °C 까지 melting curve를 그려 분석하였다.
2%(w/v) agarose gel을 이용하여 Mupid-a(Advance, Japan) 전기 영동장치로 PCR 산물을 분석하였다.
DNA의 증폭은 GeneAmp PCR System 2700(Applied Biosystems, USA), GENSPECTORTMC-1000 SYSTEM (Samsung, Korea), Rotor-Gene™ 3000(Corbett research, USA)을 사용하였고, PCR 증폭물 확인은 Mupid-a (Advance, Japan) 전기영동장치를 이용하였다.
HBV 김I염 환자로 판정된 혈청 샘플 120 개 이용하여 두 장비 에 대한 특이 성 테스트 하였다（7况泥 4）. 그결과 Micro-PCR법은 57 개의 샘플에서 Real-Time PCR 법은 56 개의 샘플에서 검출이 되었다.
HBV-DNA core region에서 증폭하기 위한 프라이머 세트(7泌/e 1)를 제작하였다.
HBV-DNA를 실시간으로 모니터링 하기 위하여 기존에 일려 져 있고 현재 많이 사용하고 있는 Real-Time PCR법과 마이크로칩의 개념을도입하여 새롭게 개발된 Micro-PCR법을 가지고 비교실험을 하였다.
본 저자는 앞으로 Micro-PCR과 Real-Time PCR법을 응용하여 B형 간염 바이러스 이외에도 결핵, 탄저균, 살모넬라, 브루셀라 등 다양한 균 및 바이러스에 적용할 계획이다. 그리고 마지막으로 인간 유전자의 돌연변이 검출까지 확대, 응용하여 기존의 방법으로 5시간 이상 걸리는 돌연변이 검출시간을 1 시간 이내로 단축시킴으로써 돌연변이 검출의 새로운 방법을 제시하고자 한다.
동일한 샘플을 Micro-PCR과 Real-Time PCR법을 이용하여 한번에 6 개의 동일 샘플을 30 번 반복 시행 하여 각 실험간 재현성을 테스트 하였다. 실시간 모니 터 링 시 스템은 Master mix속에 들어 있는 SYBR Green이 DNA 이중나선 사이로 결힙되 어 나타나는 형광을 측정힘:으로써 Ct와 Tm을 알 수 있고 이를 통해 샘플의 농도, 증폭유무 및 종을 확인 할 수 있다.
된 증폭산물이 HBV-DNA가 맞는지 최종적으로 확인 하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다. 그후 동일한 Master mix를 가지고 HBV plasmid DNA 와 임상 샘플을 Micro-PCR과 Real-Time PCR법에 적용시켰다.
마지막으로 UV transilluminator 위에 agarose gel을 올려놓고 PCR 여부를 확인했다.
본 연구에서는 HBV의 검출을 위해 Real-Time PCR 과 Micro-PCR법을 사용하였고 두 장비의 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성, 분석시간에 대한 반복 테스트를 시행하여 비교, 평가하였다.
준비된 반응 용액에서 1 pL을 취하여 마이크로칩 안에 분사하고 optical tape을 붙인 후 모듈 안에 넣는다. Micro-PCR（Samsung, TMC-1000, Korea）을 이용해서 우선 50。（?에서 2 분간 Uracil-N-Glycosylase를 활성화 시키고 91。（?에서 1 분간 주형 DNA를 완전히 변성시킨 후 다시 92。（?에서 1 초간 변성, 62。（?에서 15 초간 결합 및 신장, 단계를 40 회 반복하여 DNA 를 증폭시켰고 마지믹으로 60〜90 °C 까지 melting curve 를 그려 분석하였다.
혈청에서 HBV-DNA를 추출하여 PCR법을 통하여 타겟(target) 부위를 증폭을 시 킨 후 증폭된 DNA를 전기영동법에 의해 확인하였고 이를 정제하였다. 정제
대상 데이터
본 연구에서는 단국대학교 병원에서 HBV에 감염된 환자의 혈청 샘플 120개를 대상으로 하였다. Positive Control(HBV plasmid DNA, ATCC 45020D) 은 제넷바이오(GeNet Bio, Korea)에서 구입하여 사용 하였다.
본 연구에서는 단국대학교 병원에서 HBV에 감염된 환자의 혈청 샘플 120개를 대상으로 하였다. Positive Control(HBV plasmid DNA, ATCC 45020D) 은 제넷바이오(GeNet Bio, Korea)에서 구입하여 사용 하였다.
혈청 에서 HBV-DNA추출에는 PrlmePrep™Genomic DNA Isolation Kit(GeNet Bio, Korea)를 사용하였고 Real-Time PCR과 Micro-PCR에 사용된 반응 시약은 Master mix™(GeNet Bio, Korea)을 사용하였다. 전기영동의 agarose는 QA-AgaroseTM(Q-bio gene, USA)을 이용하였다.
이론/모형
9 卩L 로 구성되 어 있다. DNA증폭은 GeneAmp® PCR System 2700(Applied Biosystems, USA)를 이용해서 DNA를증폭시켰다.
된 증폭산물이 HBV-DNA가 맞는지 최종적으로 확인 하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다. 그후 동일한 Master mix를 가지고 HBV plasmid DNA 와 임상 샘플을 Micro-PCR과 Real-Time PCR법에 적용시켰다.
성능/효과
HBV-DNA 원액（1.3,J（）Scopy4iL）을 serial dilution 하여 13,1俨〜1.3司哓opy/|iL으］ 농도에서 검출 테스트를한 결과 긱玛의 장비에서 농도별 Ct 간격이 3~4 cycle 을유지하며 나타나는 것을 확인하였다（7泌"3M该 5-7）.
검줄 된 수가 낮은 이유는 B형 간염 바이러스 DNA의 소멸과 낮은 검출 한계의 영향이라 볼 수 있다. 그 외에 PCR에 소요되는 시간은 Micro-PCR법 이 25 분, Real-Time PCR법은 80 분이 소요됐고 소모되는 시약의 양도 Micro-PCR법이 1/10-1/50 적게 소모됨을 확인함으로서 각종 진단이나 검사법에 매우 유용하다는 사실을 알 수 있었다. 더욱이 Micro-PCR법은 6 개의 모듈로 이루어져 있어 여러 가지의 조건으로 실험할 수 있고 서로 다른 유전자를 동시에 검출해 낼 수 있고 컴퓨터와 PCR machine이 하나로 이루어져 있어 이동이 용이 하여다 방면에 응용 할 수 있는 강점을 가지고 있다.
3号（凫이寧/ jiL의 범위로 동일한 결과를 나타냈다. 세 번째로 임상 샘플에 대한 특이성 테스트 결과에서는 전체 120개의 혈청 샘플 중에서 Real-Time PCR법은 56 개의 샘플에서 Micro-PCR법은 57 개 샘플에서 검출이 됨으로써 두 장비가 가지고 있는 특이성 또한 매우 유사하다는 것을 보여줬다. 검줄 된 수가 낮은 이유는 B형 간염 바이러스 DNA의 소멸과 낮은 검출 한계의 영향이라 볼 수 있다.
첫 번째로 재현성 테스트 결과 Real-Time PCR법의 Ct와Tm value는 17.5±0.5 cycle과 79.5±0.8, Micro-PCR 법의 경우는 12.6±0.4 cycle과 7%1가 나타남으로써 편차 범위가 비슷함을 알 수 있었다. 두 번째로 검출 가능한농도 범위 테스트 결과는 I.
후속연구
본 저자는 앞으로 Micro-PCR과 Real-Time PCR법을 응용하여 B형 간염 바이러스 이외에도 결핵, 탄저균, 살모넬라, 브루셀라 등 다양한 균 및 바이러스에 적용할 계획이다. 그리고 마지막으로 인간 유전자의 돌연변이 검출까지 확대, 응용하여 기존의 방법으로 5시간 이상 걸리는 돌연변이 검출시간을 1 시간 이내로 단축시킴으로써 돌연변이 검출의 새로운 방법을 제시하고자 한다.
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