제주상사화 (Lycoris chejuensis K. Tae et S. Ko) 잎 및 뿌리 절편으로부터 소자구 형성을 통한 식물체 재생안 Plant Regeneration from Leaf and Root Cultures of Lycoris chejuensis via Bulblet Formation원문보기
제주상사화의 잎 및 뿌리 조직으로부터 형성된 캘러스 및 구형 소자구로부터 효율적인 기내 식물체 재생체계를 확립하였다. 2,4-D가 첨가된 B5 배양배지에서 12주 배양 후 제주상사화의 잎 조직으로부터 백색의 구형 세포괴 및 캘러스가 동시에 발달하였으며 그 빈도는 32.1%이었다. 그러나 3 mg/L 이상의 고농도 2,4-D 처리구에서는 캘러스 형성빈도가 14%로 크게 감소하였으며 10 mg/L 2,4-D 처리구에서는 캘러스 형성이 전혀 이루어지지 않았다. 잎 조직과 달리 뿌리 절편의 경우 3 mg/L 2,4-D 처리구에서 캘러스 형성빈도가 36.1%로 가장 높았으며 BA 단독처리구나 2,4-D와 BA의 혼용처리구에서는 그 빈도가 감소하였다. 형성된 백색의 구형세포괴는 생장조절제가 첨가되지 않은 B5배지에 배양하면 소자구 발달 경로를 거쳐 소식물체로 발달이 이루어졌다. 소식물체는 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2MS 기본배지로 옮겨 명배양한 결과, 약 배양 2주후부터 녹색의 잎이 신장되는 것을 관찰 하였으며 4주 후 뿌리 발달이 이루어지면서 정상적인 식물체로 발달하였다. 재생된 소식물체는 배양기내에서 순화과정을 통해 토양이식이 가능하였다. 본 연구에서 확립된 제주상사화의 식물체 재생체계는 제주상사화의 대량증식 수단은 물론, 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 수단 및 유용 유전자원의 장기보전을 위한 초저온 보존 연구의 직접적인 연구소재로 활용이 가능할 것으로 예상된다.
제주상사화의 잎 및 뿌리 조직으로부터 형성된 캘러스 및 구형 소자구로부터 효율적인 기내 식물체 재생체계를 확립하였다. 2,4-D가 첨가된 B5 배양배지에서 12주 배양 후 제주상사화의 잎 조직으로부터 백색의 구형 세포괴 및 캘러스가 동시에 발달하였으며 그 빈도는 32.1%이었다. 그러나 3 mg/L 이상의 고농도 2,4-D 처리구에서는 캘러스 형성빈도가 14%로 크게 감소하였으며 10 mg/L 2,4-D 처리구에서는 캘러스 형성이 전혀 이루어지지 않았다. 잎 조직과 달리 뿌리 절편의 경우 3 mg/L 2,4-D 처리구에서 캘러스 형성빈도가 36.1%로 가장 높았으며 BA 단독처리구나 2,4-D와 BA의 혼용처리구에서는 그 빈도가 감소하였다. 형성된 백색의 구형세포괴는 생장조절제가 첨가되지 않은 B5배지에 배양하면 소자구 발달 경로를 거쳐 소식물체로 발달이 이루어졌다. 소식물체는 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2MS 기본배지로 옮겨 명배양한 결과, 약 배양 2주후부터 녹색의 잎이 신장되는 것을 관찰 하였으며 4주 후 뿌리 발달이 이루어지면서 정상적인 식물체로 발달하였다. 재생된 소식물체는 배양기내에서 순화과정을 통해 토양이식이 가능하였다. 본 연구에서 확립된 제주상사화의 식물체 재생체계는 제주상사화의 대량증식 수단은 물론, 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 수단 및 유용 유전자원의 장기보전을 위한 초저온 보존 연구의 직접적인 연구소재로 활용이 가능할 것으로 예상된다.
Plant regeneration system from leaf and root segments of Lycoris chejuensis via bulblet formation was established. Surface-sterilized leaf and root segments were cultured on the B5 medium containing 2,4-D. After 12 weeks of culture onto B5 medium containing 2,4-D, white globular structures and white...
Plant regeneration system from leaf and root segments of Lycoris chejuensis via bulblet formation was established. Surface-sterilized leaf and root segments were cultured on the B5 medium containing 2,4-D. After 12 weeks of culture onto B5 medium containing 2,4-D, white globular structures and white calluses were formed on the cut surface of the explants. The highest frequency of globular structures and calluses formation from leaf explants was 32.1% when leaf explants were cultured onto B5 medium supplemented with 1 mg/L of 2,4-D. However, the higher concentration of 2,4-D (over than 3 mg/L) resulted in decrease of the frequency. In comparison to leaf explants, root segments showed the highest frequency at a rate of 36.1% when root explants were cultured onto B5 medium supplemented with 3 mg/L of 2,4-D. These structures and calluses were sub-cultured and proliferated onto the same culture medium. Upon transfer to B5 basal medium, white globular structures were developed into bulblets and normal plantlets. After 4 weeks of incubation in the light, plantlets were successfully rooted over the frequency of approximately 90%. Rooted plantlets were successfully transferred to potting soil and acclimatized in the growth chamber. The plant regeneration system of Lycoris chejuensis established in this study, might be applied to mass proliferation, conservation of genetic resources and genetic transformation for molecular breeding.
Plant regeneration system from leaf and root segments of Lycoris chejuensis via bulblet formation was established. Surface-sterilized leaf and root segments were cultured on the B5 medium containing 2,4-D. After 12 weeks of culture onto B5 medium containing 2,4-D, white globular structures and white calluses were formed on the cut surface of the explants. The highest frequency of globular structures and calluses formation from leaf explants was 32.1% when leaf explants were cultured onto B5 medium supplemented with 1 mg/L of 2,4-D. However, the higher concentration of 2,4-D (over than 3 mg/L) resulted in decrease of the frequency. In comparison to leaf explants, root segments showed the highest frequency at a rate of 36.1% when root explants were cultured onto B5 medium supplemented with 3 mg/L of 2,4-D. These structures and calluses were sub-cultured and proliferated onto the same culture medium. Upon transfer to B5 basal medium, white globular structures were developed into bulblets and normal plantlets. After 4 weeks of incubation in the light, plantlets were successfully rooted over the frequency of approximately 90%. Rooted plantlets were successfully transferred to potting soil and acclimatized in the growth chamber. The plant regeneration system of Lycoris chejuensis established in this study, might be applied to mass proliferation, conservation of genetic resources and genetic transformation for molecular breeding.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 제주상사화의 잎 및 뿌리 절편으로부터 소자구 형성을 통한 식물체 재생체계 확립에 미치는식물 조직 및 생장조절제의 영향을 규명하고자 한다.
제안 방법
잎 조직 (넓이 약 5 mm2) 을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하였다. 또한 제주상사화의 뿌리 배양을 위해 잎조직으로부터 재생된 기내 배양 소식물체의 뿌리 조직 (길이 약 5 mm)을 잎 조직과 동일한 캘러스 유도배지에 치상하였다. 제주상사화의 잎 및 뿌리조직을 위한 배양배지로 B5 (Gamborg et al.
옮겨 소식물체로 발달을 유도하였다. 발달된 소식물체는 1/2MS 기본배지로 옮겨 25℃ 명배양 (약 70 umol m'2s4; 광주기 16/8시간)을 통하여 소자구의 신장과 뿌리발달을 통한 정상적인 식물체 재생이 이루어지는지 여부를 조사하였다. 고체배지상에서 뿌리 발달이 이루어진 식물체는 Gelrite 조각을 제거한 다음 수돗물로 세척하여 원예용 상토로 이식하여 25 ℃ 명배양하였다.
3, 1 및 3 mg/L 첨가된 혼용처리구를 준비하였다. 뿌리 절편 역시 각각의 처리구에 12개씩 3반복으로 치상하여 상기의 배양조건에 따라 배양하였다. 생장조절제의 농도별 종류별 처리에 따른 제주상사화 조직 절편으로부터 소자구 및 캘러스 형성 빈도 조사는 계대배양 과정 없이 12주간 배양된 각 절편으로부터 백색의 구형세포괴 및 캘러스 형성유무를 관찰하여 소자구 및 캘러스 형성 빈도를 조사하였다.
뿌리 절편 역시 각각의 처리구에 12개씩 3반복으로 치상하여 상기의 배양조건에 따라 배양하였다. 생장조절제의 농도별 종류별 처리에 따른 제주상사화 조직 절편으로부터 소자구 및 캘러스 형성 빈도 조사는 계대배양 과정 없이 12주간 배양된 각 절편으로부터 백색의 구형세포괴 및 캘러스 형성유무를 관찰하여 소자구 및 캘러스 형성 빈도를 조사하였다. 소자구 및 캘러스 형성 빈도 데이터의 통계분석을 위해 반복구의 평균값과 표준편차를 상용 프로그램인 Origin (ver.
살균된 잎 조직을 무균 작업대 내에서 멸균수로 3-4회 세척한 다음 멸균된 여과지에서 표면의 수분을 제거하였다. 잎 조직 (넓이 약 5 mm2) 을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하였다. 또한 제주상사화의 뿌리 배양을 위해 잎조직으로부터 재생된 기내 배양 소식물체의 뿌리 조직 (길이 약 5 mm)을 잎 조직과 동일한 캘러스 유도배지에 치상하였다.
제주상사화 (Lycoris chejuensis K. Tae et S. Ko)의 식물체의 잎조직을 절취하여 수돗물에 세척한 다음 10% 상업용 락스 용액에 20분간 표면살균을 하였다. 살균된 잎 조직을 무균 작업대 내에서 멸균수로 3-4회 세척한 다음 멸균된 여과지에서 표면의 수분을 제거하였다.
3, 1, 3과 10 mg/L 첨가된 배지를 사용하였으며 각각의 식물 절편을 15개씩 3반복으로 치상하여 상기의 배양조건에 따라 배양하였다. 제주상사화의 뿌리배양은 잎 조직과 마찬가지로 B5기본배지에 2, 4-D 및 benzyl aminopurine (BA)를 각각 0, 0.1, 0.3, 1, 3과 10 mg/L 첨가된단독 처 리구 및 1 mg/L 2, 4-D에 BA가 각각 0, 0.1, 0.3, 1 및 3 mg/L 첨가된 혼용처리구를 준비하였으며 아울러 1 mg/L BA에 2, 4-D 가 각각 0, 0.1, 0.3, 1 및 3 mg/L 첨가된 혼용처리구를 준비하였다. 뿌리 절편 역시 각각의 처리구에 12개씩 3반복으로 치상하여 상기의 배양조건에 따라 배양하였다.
제주상사화의 잎 조직으로부터 식물체 재생체계를 확립하기 위하여 B5 기본배지에 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D)를 각각 0, 0.1, 0.3, 1, 3과 10 mg/L 첨가된 배지를 사용하였으며 각각의 식물 절편을 15개씩 3반복으로 치상하여 상기의 배양조건에 따라 배양하였다. 제주상사화의 뿌리배양은 잎 조직과 마찬가지로 B5기본배지에 2, 4-D 및 benzyl aminopurine (BA)를 각각 0, 0.
제주상사화의 잎조직으로부터 형성된 캘러스로부터소자구발생을 통한 기내 식물체 재생체계를 확립하였다 (Figure 1). 제주상사화의 잎 조직으로부터 2, 4-D가 첨가된배양배지에 4주 배양 후 백색의 솜털 (Figure 1A)이 발달하면서 조직팽창이 이루어지고 이후 백색의 구형 돌출 구조가절단면에 형성되기 시작하였으며 동시에 백색 캘러스의 형성이 관찰되었다(Figure IB).
대상 데이터
) and the BA and 1 mg/L 2, 4 -D (■)(B). Each treatment consisted of 12 explants with three replicates. Vertical bars represent SD.
또한 제주상사화의 뿌리 배양을 위해 잎조직으로부터 재생된 기내 배양 소식물체의 뿌리 조직 (길이 약 5 mm)을 잎 조직과 동일한 캘러스 유도배지에 치상하였다. 제주상사화의 잎 및 뿌리조직을 위한 배양배지로 B5 (Gamborg et al. 1968) 배지를 사용하였으며 뿌리 유도는 MS (Murashige and Skoog 1962)배지의 모든 무기염류 농도를 1/2로 낮춘 배지에 각각 04mg/L thiamine-HCl, 100 mg/L myo-inositol, 30 g/L sucrose 및 4 g/L Gelrite 가 첨가된 배지를 기본배지 (1/2MS 배지) 로사용하였다. 배양배지의 pH는 고압살균전에 IN NaOH 용액으로 5.
데이터처리
생장조절제의 농도별 종류별 처리에 따른 제주상사화 조직 절편으로부터 소자구 및 캘러스 형성 빈도 조사는 계대배양 과정 없이 12주간 배양된 각 절편으로부터 백색의 구형세포괴 및 캘러스 형성유무를 관찰하여 소자구 및 캘러스 형성 빈도를 조사하였다. 소자구 및 캘러스 형성 빈도 데이터의 통계분석을 위해 반복구의 평균값과 표준편차를 상용 프로그램인 Origin (ver. 7.5)를 이용하여 조사하였다.
성능/효과
2, 4-D가 첨가된 B5 배양배지에서 12주 배양후 제주상사화의 잎 조직으로부터 백색의 구형 세포괴 및캘러스가 동시에 발달하였으며 그 빈도는 32.1%이었다. 그러나 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 캘러스 형성빈도가 14%로 크게 감소하였으며 10 mg/L 2, 4-D 처리구에서는 캘러스 형성이 전혀 이루어지지 않았다.
형성된 백색의구형세포괴는 생장조절제가 첨가되지 않은 B5배지에 배양하면 소자구 발달 경로를 거쳐 소식물체로 발달이 이루어졌다. 소식물체는 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2MS 기본배지로 옮겨 명배양한 결과, 약 배양 2주후부터 녹색의 잎이신장되는 것을 관찰 하였으며 4주 후 뿌리 발달이 이루어지면서 정상적 인 식물체로 발달하였다. 재생된 소식물체는 배양기내에서 순화과정을 통해 토양이식이 가능하였다.
소자구 및 캘러스 형성을 촉진시키기 위하여 2, 4-D 와 BA 상대적인 비율을 달리하여 혼용처리를 수행한 결과 1 mg/L BA + 0.3 mg/L 2, 4-D 처리구에서 소자구 및 캘러스 형성빈도가 33.3% (Figure 3B)로 가장 높았으나 2, 4-D 와 BA의 단독처리에 비하여 2, 4-D 와 BA의 혼용처리에 의한 상승 효과를크게 보이지 않았다. 본 연구 결과는 일반적으로 Lycoris속식물의 기내 배양을 위해 오옥신으로 NAA를 싸이토키 닌으로 BA나 kinetin을 혼용처리하면 자구 형성이 촉진된다는 보고 (Kim et al.
소자구 형성빈도는 1 mg/L 2, 4-D 단독 처리구에서 32.1% 로 가장 높았으며 2, 4-D 농도가 증가할수록 감소하여 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 소자구의 형성빈도가 14 %로 크게 감소하였으며 10 mg/L 2, 4-D 처리구에서는 조직갈변이 이루어지면서 전혀 소자구 및 캘러스 형성이 이루어 지지 않았다 (Figure 2). 이상의 결과로 미루어 볼 때 제주상사화의 잎조직의 경우 생장조절제로 0.
1%로 가장 높았으며 그 이상 고농도의 2, 4-D 처리구에서는 빈도가 크게 감소하였다 (Figure 3A). 이 결과를 통해 제주상사화 뿌리 조직의 경우 잎 조직에 비하여 소자구 발생과정에 더 높은 농도의 2, 4-D가 요구됨을 알 수 있었다. 또한 BA 단독처리의 경우 0.
1% 로 가장 높았으며 2, 4-D 농도가 증가할수록 감소하여 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 소자구의 형성빈도가 14 %로 크게 감소하였으며 10 mg/L 2, 4-D 처리구에서는 조직갈변이 이루어지면서 전혀 소자구 및 캘러스 형성이 이루어 지지 않았다 (Figure 2). 이상의 결과로 미루어 볼 때 제주상사화의 잎조직의 경우 생장조절제로 0.3 -1 mg/L의 2, 4-D 처리가 소자구 발생을 통한 식물체 재생에 효과적임을 알 수 있었다. 따라서 이 결과는 Lycoris속 식물의 잎으로부터 소 자구 형성을 통해 식물체 재생이 가능 하다는 보고 (Ma et al.
이상의 연구 결과로 미루어 볼 때 제주상사화의 잎조직의 경우 저농도 (0.3 - 1 mgE의 2, 4-D 처리가 소자구 형성에매우 효과적임을 알 수 있었으며 재생된 식물체의 뿌리 조직의 경우 고농도 (3 mg/L)의 2, 4-D 처리가 소자구 형성에 효과적임을 알 수 있었다 아울러 뿌리조직에서는 저농도 (0.3 mg/L)의 BA 처리만으로도 소자구 형성이 이루어짐을 알 수 있었다. 현재 캘러스의 현탁배양체계를 확립중이며 제주상사화의 초저온보존 연구에 활용할 예정이다.
2%이었다 (Figure 3A). 이상의 연구결과를 통하여 비록 2, 4-D 단독처리에 비해 빈도는 낮지만 저농도의 싸이토키닌단독 처리만으로도 뿌리 조직에서도 소자구 형성이 이루어짐을 알 수 있었다.
그러나 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 캘러스 형성빈도가 14%로 크게 감소하였으며 10 mg/L 2, 4-D 처리구에서는 캘러스 형성이 전혀 이루어지지 않았다. 잎 조직과 달리 뿌리 절편의 경우 3 mg/L 2, 4-D 처리구에서 캘러스 형성빈도가 36.1%로 가장 높았으며 BA 단독처리구나 2, 4-D와 BA 의 혼용처리구에서는 그 빈도가 감소하였다. 형성된 백색의구형세포괴는 생장조절제가 첨가되지 않은 B5배지에 배양하면 소자구 발달 경로를 거쳐 소식물체로 발달이 이루어졌다.
제주상사화 잎조직으로부터 소자구 형성에 미치는 2, 4-D 의 영향을 조사한 결과 1-3 mg/L 2, 4-D 처리구에서는 백색의 구형 돌출구조 및 캘러스 형성을 관찰할 수 있었다 (Figure 2). 소자구 형성빈도는 1 mg/L 2, 4-D 단독 처리구에서 32.
제주상사화의 잎 및 뿌리 조직으로부터 형성된 캘러스및 구형 소자구로부터 효율적인 기내 식물체 재생체계를확립하였다. 2, 4-D가 첨가된 B5 배양배지에서 12주 배양후 제주상사화의 잎 조직으로부터 백색의 구형 세포괴 및캘러스가 동시에 발달하였으며 그 빈도는 32.
형성된 백색의 구형 돌출 구조 및 백색 캘러스는 배양 12주 경과 후에도 캘러스 증식 및 조직 팽창은 이루어지지만 매우 빠른 속도의 증식률을 보이지는 않았다 (Figure 1C). 형성된 구형의 돌출 구조를 동일 조성의 생장조절제가 첨가된 배양배지로 옮겨 캘러스의 증식 및 구형세포괴의 신장을 유도한 결과 구형의 돌출 구조가 소자 구로 발달함을 관찰할 수 있었다 (Figure ID). 신장된 구형 소자 구를 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2MS 배지로 옮겨 뿌리발달을 유도한 결과 약 90%이상의 소자구에서 정상적인 뿌리 발달이 이루어졌다 (Figure IE).
후속연구
본 연구에서 제주상사화 뿌리의 경우 오옥신과 싸이토키닌의 혼용처리가 소자구 형성에 미치는 영향을 조사하였으나 잎 조직의 경우 연구 재료의 부족으로 오옥신과 싸이토키닌의 혼용처리가 소자구 형성에 미치는 영향을 조사하지 못하였다. 따라서 향후 재생된 식물체의 잎조직으로부터 오옥신과 싸이토키닌의 혼용처리가 소자구 형성에 미치는 영향을 조사하게 되면 소자구 형성에 미치는 생장조절제의 영향을 더 자세하게 이해할 수 있을 것으로 기대된다.
2006)와는 상반된 결과라 사료된다. 본 연구에서 제주상사화 뿌리의 경우 오옥신과 싸이토키닌의 혼용처리가 소자구 형성에 미치는 영향을 조사하였으나 잎 조직의 경우 연구 재료의 부족으로 오옥신과 싸이토키닌의 혼용처리가 소자구 형성에 미치는 영향을 조사하지 못하였다. 따라서 향후 재생된 식물체의 잎조직으로부터 오옥신과 싸이토키닌의 혼용처리가 소자구 형성에 미치는 영향을 조사하게 되면 소자구 형성에 미치는 생장조절제의 영향을 더 자세하게 이해할 수 있을 것으로 기대된다.
재생된 소식물체는 배양기내에서 순화과정을 통해 토양이식이 가능하였다. 본 연구에서 확립된 제주상사화의 식물체 재생체계는 제주상사화의 대량증식 수단은 물론, 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 수단 및 유용 유전자원의 장기보전을 위한 초저온 보존 연구의 직접적인 연구소재로 활용이 가능할 것으로 예상된다.
현재 캘러스의 현탁배양체계를 확립중이며 제주상사화의 초저온보존 연구에 활용할 예정이다. 아울러 본 연구에서 확립된 제주상사화의 잎조직으로부터 소자구발생을 통한 식물체 재생체계는 제주상사화의 기 내 대량증식 수단은물론, 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 수단으로 활용이가능할 것으로 기대된다.
3 mg/L)의 BA 처리만으로도 소자구 형성이 이루어짐을 알 수 있었다. 현재 캘러스의 현탁배양체계를 확립중이며 제주상사화의 초저온보존 연구에 활용할 예정이다. 아울러 본 연구에서 확립된 제주상사화의 잎조직으로부터 소자구발생을 통한 식물체 재생체계는 제주상사화의 기 내 대량증식 수단은물론, 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 수단으로 활용이가능할 것으로 기대된다.
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