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문제 정의
- 본 연구에서는 상사화를 메탄올 추출하고 그 추출물을 여러 가지 유기용매로 획분하여 각각의 항산화 활성을 in vitro 상에서 비교하고, 세포 생존율 및 항염증 효과를 확인하였다. 분획 중에서 우수한 생리 활성 효과를 가지는 ethyl acetate층을 HPLC를 이용하여 2개의 분획으로 다시 나누고, 2개의 획분된 층을 다시 항산화 효과, 세포 생존율의 2차 생리 활성 효과를 측정하여 알아 본 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Lycoris squamigera Maxim 뿌리의 ethyl acetate의 분획물을 0 ㎍/mL~50 ㎍/mL의 농도로 처리한 후 금속이온 (Fe3+→ Fe2+)을 환원 시키는 환원력을 측정한 결과는 다음과 같았다(Table 2).
- Lycoris squamigera Maxim의 antioxidant scavenging activities를 표준 물질인 ascorbic acid를 비교하여 측정하였다. 항산화 측정은 획층별로 흡광도가 50 %로 감소하는 IC50 값을 Table 1에 정리하였다.
- RAW 264.7 대식 세포에 뿌리의 ethyl acetate층에서 분리된 fraction 1,fraction 2을 0.1, 1, 5, 10 μM로 처리하고 세포 생존율을 확인하였다.
- RAW 264.7 세포주의 성장에 상사화에서 추출한 물질들이 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 진행하였으며, 3차 증류수로 현탁 하여 만든 0.1, 1, 10 μM 의 표준용액을 처리하였으며, 자극원에 의한 세포의 성장을 알아보기 위해 LPS만을 처리한 대조군을 기준으로 하였다.
- 농축한 100% methanol 추출물은 증류수에 완전히 녹인 후 극성에 따라 분획하였다. n-hexane(43.852 g)과 chloroform(65.364 g), ethyl acetate(80.760 g), butanol(109.15 g) 그리고 H2O(332.021 g) 층 순으로 분획하였다(schem 1)
- 1, 1, 10 μM 농도로 처리한 다음 2시간 후에 1 μg/ml LPS 를 처리한 후, 18시간 후에 5 μg/mL MTT 용액 50㎕를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거한 후, MTT 용액과 생존세포로부터 생성된 formazan 을 DMSO 150 ㎕ 로 용해하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율 (%)로 표시하였다.
- 본 연구에서는 상사화를 메탄올 추출하고 그 추출물을 여러 가지 유기용매로 획분하여 각각의 항산화 활성을 in vitro 상에서 비교하고, 세포 생존율 및 항염증 효과를 확인하였다. 분획 중에서 우수한 생리 활성 효과를 가지는 ethyl acetate층을 HPLC를 이용하여 2개의 분획으로 다시 나누고, 2개의 획분된 층을 다시 항산화 효과, 세포 생존율의 2차 생리 활성 효과를 측정하여 알아 본 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 상사화 추출물의 적정용액을 농도 별로 제조한 후 0.1, 1, 10 μM 농도로 처리하고, 2시간 후에 1 μg/ml LPS 을 처리하였다.
- 상사화에서 분리한 생리활성 추출물을 interferon-γ(INF- γ) 또는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에 주입하여, 추출물에 의한 염증억제 효과를 측정하였다.
- 상사화에서 추출한 생리활성 물질을 interferon-γ(INF- γ) 또는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포 주에 주입하여, 추출물에 의한 염증억제 효과를 측정하였다.
- 생리 활성이 우수한 상사화 뿌리의 ethyl acetate 분획을 HPLC를 이용하여 2차 분획을 나누었다. HPLC 분리 조건은 Liner gradient로 하여 water과 acetinitrile을 이동상으로 사용하였으며, 컬럼은 C18이 충진된 것을 사용하였다.
- 생쥐의 대식세포주(Murine macrophage Raw 264.7 cell line)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum, 56 ℃ heat inactivated), 1 % L-glutamine, nonessential amino acids 및 1 % antibiotic / antimycotic solution(100 U/ml of penicillin, 25 ㎍/ml of amphotericin D, and 100 ㎍/ml of streptomycin), 2 % sodium bicarbonate 등이 포함된 RPMI 1640배지에 넣고 37 ℃, 5 % CO2 incubator 에서 24시간 배양하였다.
- 추출물을 DMSO 또는 3차 증류수로 적정용액을 만들어 0.1, 1, 10 μM 농도로 처리한 다음 2시간 후에 1 μg/ml LPS 를 처리한 후, 18시간 후에 5 μg/mL MTT 용액 50㎕를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다.
- 추출물의 reductive potential 효과를 보기 위해 일반적으로 항산화 물질로 알려진 BHA, BHT 그리고 α-tocopherol과 효과를 비교하였다.
- 추출물의 total phenolics 효과를 보기 위해 일반적으로 항산화 물질로 알려진 BHA, BHT, α-tocopherol 효과와 비교하였다.
- 5% w/v sodium carbonate를 혼합한다. 혼합물을 45℃에서 20분간 배양시키고, 흡광도를 UV-Visible Spectophotometer(Molecular Devices Spectra Max 190.)로 765nm에서 측정하였다. 반응혼합물의 높은 흡광도는 더 좋은 total phenolics 효과를 나타낸다.
대상 데이터
- Anti-iNOS, anti-COX-2, anti-tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) antibody는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(California, U.S.A.)로부터 구입하였으며, nitrocellulose membrane(NC membrane)은 Amersharm Pharmacia 사 로부터 구입하여 사용하였다. 용매로는 n-hexane(Hex), methanol(MeOH), ethanol(EtOH), chloroform(CHCl3), ethyl acetate(EA), butanol(BuOH), dimethyl sulfoxide(DMSO), 정제하지 않고 사용하였고, 추출물들의 농축에는 원심분리기(Hanil Industrial Company, Hm 150Ⅳ)와 진공 회전식 농축기(Bϋchi, RE Ⅲ Rotavapor)를 사용하였고, 흡광도 측정에는 UV-Visible Spectrophotometer(Molecular Devices Spectra Max 190)와 UV-Visible S-2100(Scinco Co.
- 본 실험에서 사용한 상사화는 원광대학교 생명자원과학대학 박윤점 교수님의 자문을 받아 구입하여 외부형태를 비교 조사하고 확인 후 사용하였다. 실험에 사용된 상사화는 원광대학교 자연과학대학 4층 천연물실험실에 보관되어있다.
- 상사화 추출 및 open columm 분리에서 사용된 용매는 GR 급을 사용하였으며, 물질의 분리에는 25 TLC plastic sheets(20×20 ㎝) silica gel 60 F254(MERCK), 25 TLC plates 5×10 ㎝ RP-18 F254S(MERCK), silica gel 60(0.015~0.140 ㎜, MERCK), silics gel 60(0.040~0.063㎜; MERCK), octadecyl-functioalized silica gel(Aldrich), lipophilic sephadex LH-20(SIGMA) 등 충진제와 Phenomenex 사의 Luna 5u C18(2)(250×21.20 ㎜ 5 micron) HPLC column 과 YMC 사의 Hydrosphere C18(250×20 ㎜ I. D. S-5 ㎛, 12 ㎚) HPLC column, EYEL4 rotary vacuum evaporator, VISION WORKSTATION perseptive biosystems HPLC 등을 사용하였다.
- 생리활성 효과 측정을 위해 MTT(2-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoli um bromide)와 DMSO(dimethyl sulfoxide), LPS(lipopolysacchride)는 SIGMA 사에서 구입하였으며, Antibiotic antimyotic solution 과 FBS(fetal bovine serum), RPMI 1640 은 Gibco/Invitrogen에서 구입하였다.
- )로부터 구입하였으며, nitrocellulose membrane(NC membrane)은 Amersharm Pharmacia 사 로부터 구입하여 사용하였다. 용매로는 n-hexane(Hex), methanol(MeOH), ethanol(EtOH), chloroform(CHCl3), ethyl acetate(EA), butanol(BuOH), dimethyl sulfoxide(DMSO), 정제하지 않고 사용하였고, 추출물들의 농축에는 원심분리기(Hanil Industrial Company, Hm 150Ⅳ)와 진공 회전식 농축기(Bϋchi, RE Ⅲ Rotavapor)를 사용하였고, 흡광도 측정에는 UV-Visible Spectrophotometer(Molecular Devices Spectra Max 190)와 UV-Visible S-2100(Scinco Co. Ltd.)을 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과는 mean ± S.D. 값으로 표시하였으며, 각 실험 결과로부터 ANOVA(analysis of variance)를 구한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 군의 평균간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- RAW 264.7 cell line으로 생성된 nitric oxide의 양은 Feelish5) 등의 방법에 준하여 실험하였다. 96-well plate 에 RAW 264.
- Total phenolics test 방법은 Folin-Ciocalteu 방법에 의해서 결정하였다.
- 상사화 추출물 각각의 fraction은 Spanos and Wrolstad7)의 방법을 바탕으로 하여 측정하였다. 다양한 농도(0 ㎍/mL~50 ㎍/mL)의 상사화 시료 150㎕에 750 ㎕ Folin-Ciocalteu 시약과 600㎕ 7.
- 상사화 추출물들에 의한 RAW 264.7 세포주의 세포 생존율을 MTT(2-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Assay 방법을 이용하여 분석 하였다11). 세포주를 96-well plate에 2.
- 셀 배양액은 20시간 후에 수집하여 깨끗하게 원심분리하고 -80 ℃까지 얼린다. 상업적으로 판매되는 Sandwich의 enzyme-linked immunosorbent assay ELISA를 이용한다. TNF-α 측정은 96 well ELISA plate에서 수행되었고, coating buffer(1:250 dilution) 안의 capture antibody의 100 (㎕/well)을 coated 한다.
- 추출물의 환원력(reductive potential test)은 Oyaizu6) 방법에 의해서 측정 하였다.
성능/효과
- DPPH법에 의하여 항산화 효과와 Nitrite oxide와 TNF-α의 저해 능력이 우수한 뿌리의 ethyl acetate층(R-EA)를 HPLC를 이용하여 10 % acet nitrile~50 % acetnitrile를 농도 구배법으로 60 분동안 분리한 결과 27.66 분에서 fraction 1과 40.300분에서 fraction 2를 얻었다(Fig. 5).
- Sodium nitrite(NaNO2)를 표준용액으로 하여 생성된 NO2-의 농도를 정량한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군은 3.98 μM 을 나타내었고, 자극원만 처리한 대조군은 14.29 μM 을 나타내었으며, 상사화 추출물을 0.1, 1 10 μM 을 처리한 군에서 IC50(Thehalfmaximalinhibitoryconcentration)를 측정한 결과, 뿌리의 ethyl acetate층에서 가장 많이 NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 그 결과 상사화 ethyl acetate fraction 1에서는 0.1~5 μM의 농도와 fraction 2에서는 0.1~10 μM의 농도에서 세포 생존율에 영향이 없는 것을 확인 하였다(Fig. 4)
- 그 결과 상사화에서 추출한 물질은 0.1~10 μM 의 농도에서는 세포생존율에 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다(Fig. 1)
- 뿌리 물 추출물(R-H2O)은 항산화 효과가 없는 것으로 나타났다. 그러나 뿌리의 ethyl acetate 층(R-EA)와 뿌리의 chlroroform 층(R-CHCl3), 줄기의 ethyl acetate 층(S-EA)층은 4.82, 9.88,5.25로 비교물질인 Ascorbic acid 5.61과 비교 하였을때, R-EA와 S-EA는 더 우수한 효과를 보였으며, R-CHCl3도 비교물질 보다는 적지만 항산화 효과가 높음을 확인 할 수 있었으며, 나머지 추출물들도 미미하게는 항산화 효과를 가짐을 확인 하였다(Table 1)
- 대조군을 기준으로 하여 백분율로 세포 성장을 나타난 결과, 화합물을 처리하지 않은 대조군의 세포생존율을 100 % 로 나타내었을 때, 자극원만 처리한 대조군의 세포생존율은 70 %의 생존율을 나타내었고 상사화 ethyl acetate에서 분리한 fraction 1 은 5 μM을 처리한 군에서는 72 %의 생존율을 나타내었고, 10 μM 을 처리한 군에서 62 %의 생존율을 나타내었다.
- 대조군을 기준으로 하여 백분율로 세포 성장을 나타난 결과, 화합물을 처리하지 않은 대조군의 세포생존율을 100% 로 나타내었을 때, 자극원만 처리한 대조군의 세포생존율은 70%의 생존율을 나타내었고 상사화에서 추출물을 처리한 군에서 가장 좋은 세포 생존율을 나타내는 군은 뿌리의 ethyl acetate(R-EA)와 줄기의 ethyl acetate(S-EA) 층으로 나타났고, 세포 생존율이 가장 낮은 군은 뿌리의 물 층(R-H2O) 이었으며, 뿌리의 물 층에서 가장 높은 농도인 10 μM에서 72%의 생존율을 나타내었다.
- 상사화 추출물이 LPS로 활성화되어 염증반응이 진행된 대식세포로부터 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 효과를 나타낸 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 상사화에서 추출한 생리활성물질이 염증억제 효과를 가지고 있음을 증명하였다(Fig.
- 상사화를 methanol로 추출한 후 각 추출물에 대하여 생리 활성 효과를 측정한 결과 DPPH를 통한 항산화 효과는 뿌리 ethyl acetate 추출물에서 가장 효과가 뛰어났으며, 상사화의 추출물이 면역반응에 미치는 영향에 대한 실험을 진행한 결과 뿌리의 ethyl acetate 층이 가장 우수한 Nitrit oxide 저해 효과를 가졌으며, TNF-α 저해 실험에서는 뿌리의 ethyl acetate층은 농도 의존적으로 TNF-α를 저해함을 관찰 하였다.
- 상사화 추출물이 LPS로 활성화되어 염증반응이 진행된 대식세포로부터 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 효과를 나타낸 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 상사화에서 추출한 생리활성물질이 염증억제 효과를 가지고 있음을 증명하였다(Fig. 2).
- 자극원만 처리한 대조군은 0 μM 을 나타내었으며, 상사화 추출물을 0.1, 1, 10 μM 을 처리한 뿌리 etyl acetate(R-EA)추출물 층에서는 TNF-α의 저해율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 하였다(Fig. 3)
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