고추냉이 신초의 생육에 미치는 배지의 Salt Strength, Sucrose 농도 및 NH4/NO3 비율의 영향 Effect of Salt Strength, Sucrose Concentration and NH4/NO3 Ratio of Medium on the Shoot Growth of Wasabia japonica in Vitro Culture원문보기
식물 세포나 조직의 배양에서 배지의 salt strength, sucrose 농도, 질소 함량과 질소원의 종류 및 그 비율 등이 세포 또는 조직의 생장에 영향을 미친다. 본 연구에서는 Agar를 함유한 MS 기본배지와 BA 1 mg/L를 첨가한 MS 기본 액체배지에서 계대배양을 통하여 생산한 다신초를 액아와 본엽이 $2{\sim}3$매 되도록 분할한 신초를 이용하여 MS 액체배지의 salt strength와 sucrose 농도 및 $NH_4/NO_3$ 비율이 고추냉이 신초의 생육에 미치는 영향을 조사하여 고추냉이 유묘의 생산에 필요한 최적 배지조건을 구명하였다. 고추냉이 신초의 증식에는 MS 액체배지의 salt strength는 기본조성이 가장 적합한 것으로 나타났으며, $1/4{\sim}1/2x$ 또는 2x MS 배지에서는 고추냉이 유묘의 생장이 크게 억제 되었다. 기본조성의 MS 액체배지에 sucrose 3%를 첨가하였을 때 고추냉이 신초의 생장이 가장 우수한 것으로 나타났으나 sucrose 농도 $1{\sim}6%$ 범위에서 신초의 수와 길이는 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 기본조성의 MS 액체배지에서 질소원으로 ${NH_4}^+$과 ${NO_3}^-$의 비율을 10:50으로 조절하였을 때 고추냉이 신초의 생장이 가장 우수한 것으로 나타났으며, ${NH_4}^+$의 비율이 증가할수록 생장은 억제되었다.
식물 세포나 조직의 배양에서 배지의 salt strength, sucrose 농도, 질소 함량과 질소원의 종류 및 그 비율 등이 세포 또는 조직의 생장에 영향을 미친다. 본 연구에서는 Agar를 함유한 MS 기본배지와 BA 1 mg/L를 첨가한 MS 기본 액체배지에서 계대배양을 통하여 생산한 다신초를 액아와 본엽이 $2{\sim}3$매 되도록 분할한 신초를 이용하여 MS 액체배지의 salt strength와 sucrose 농도 및 $NH_4/NO_3$ 비율이 고추냉이 신초의 생육에 미치는 영향을 조사하여 고추냉이 유묘의 생산에 필요한 최적 배지조건을 구명하였다. 고추냉이 신초의 증식에는 MS 액체배지의 salt strength는 기본조성이 가장 적합한 것으로 나타났으며, $1/4{\sim}1/2x$ 또는 2x MS 배지에서는 고추냉이 유묘의 생장이 크게 억제 되었다. 기본조성의 MS 액체배지에 sucrose 3%를 첨가하였을 때 고추냉이 신초의 생장이 가장 우수한 것으로 나타났으나 sucrose 농도 $1{\sim}6%$ 범위에서 신초의 수와 길이는 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 기본조성의 MS 액체배지에서 질소원으로 ${NH_4}^+$과 ${NO_3}^-$의 비율을 10:50으로 조절하였을 때 고추냉이 신초의 생장이 가장 우수한 것으로 나타났으며, ${NH_4}^+$의 비율이 증가할수록 생장은 억제되었다.
To establish a optimum culture condition in vitro for production of seedlings in Wasabia japonica, the effects of salt strength, sucrose concentration, and $NH_4/NO_3$ ratio on the shoot growth in MS medium were investigated. The full strength of MS medium was the best condition for shoot...
To establish a optimum culture condition in vitro for production of seedlings in Wasabia japonica, the effects of salt strength, sucrose concentration, and $NH_4/NO_3$ ratio on the shoot growth in MS medium were investigated. The full strength of MS medium was the best condition for shoot growth, and in $1/4{\sim}1/2x$ or 2x MS medium the growth was significantly suppressed. Growth of shoots was enhanced when sucrose was added in MS medium after 2 weeks of culture, and the best result was found at 3% sucrose addition. ${NH_4}^+/{NO_3}^-$ ratio of 10:50 gave the highest biomass of shoot in the liquid culture with MS medium, and increasing the ${NH_4}^+$ ratio in the medium significantly reduced the growth of shoot.
To establish a optimum culture condition in vitro for production of seedlings in Wasabia japonica, the effects of salt strength, sucrose concentration, and $NH_4/NO_3$ ratio on the shoot growth in MS medium were investigated. The full strength of MS medium was the best condition for shoot growth, and in $1/4{\sim}1/2x$ or 2x MS medium the growth was significantly suppressed. Growth of shoots was enhanced when sucrose was added in MS medium after 2 weeks of culture, and the best result was found at 3% sucrose addition. ${NH_4}^+/{NO_3}^-$ ratio of 10:50 gave the highest biomass of shoot in the liquid culture with MS medium, and increasing the ${NH_4}^+$ ratio in the medium significantly reduced the growth of shoot.
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문제 정의
본 연구에서는 고추냉이 유묘의 대량 생산에 필요한 최적 배지조건을 구명하기 위하여 배지의 salt strength, sucrose 농도 및 NH4/NO3 비율이 고추냉이 신초의 생육에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
7로 조정한 다음 고온고압멸균기로 121℃ 에서 15분간 멸균한 액체배지 60 mL를 250 mL 삼각플라스크에 분주하고 분할한 신초를 넣은 후 130 rpm으로 진탕배양 하였다. 배양환경은 온도 20±1 ℃, 40 umol/n?/s의 광도 하에서 16시간, 암상태 8시간의 광주기로 하였으며, 처리별로 12반복으로 실험을 수행하였다. 2주간의 액체진탕배양 후 증식된 신초의 수와 길이 및 생체중을 조사하였다.
0.6% agar를 함유한 MS 기본배지에 파종하였으며 (Murashige and Skoog 1962), 본엽이 2~3매 출현했을 때 정단분열조직 및 엽원기 1~2매를 포함시켜 절취하였다. 절취한 시료를 BA 1 mg/L를 첨가한 MS 기본 액체배지에서 2주간 130 rpm 으로 진탕 배양하였으며, 이어서 조성이 같은 반고체 배지에서 30 ~60일 동안 계대배양하여 다신초를 유도하였다.
배양환경은 온도 20±1 ℃, 40 umol/n?/s의 광도 하에서 16시간, 암상태 8시간의 광주기로 하였으며, 처리별로 12반복으로 실험을 수행하였다. 2주간의 액체진탕배양 후 증식된 신초의 수와 길이 및 생체중을 조사하였다.
질소원 비율 0:60, 10:50, 20:40 처리의 경우에는 NH4+과 NO3-의 농도를 NH4NO3와 KNO3를 이용하여 조절하였다. 30:30 처리의 경우에는 NH4+과 NO3-의 농도를 NH4NO3로 조절하였으며 K의 결핍을 보완하기 위하여 KC1 19 mH을 첨가하였다. 40:20, 50:10, 60:10 처리의 경우에는 NH4+ 농도는 (NHQzSQ와 NHKH로 조절하였으며 N03- 농도는 KNB를 이용하여 조절하였으며 K의 결핍을 보완하기 위하여 KC1 19 mM을 첨가하였다.
30:30 처리의 경우에는 NH4+과 NO3-의 농도를 NH4NO3로 조절하였으며 K의 결핍을 보완하기 위하여 KC1 19 mH을 첨가하였다. 40:20, 50:10, 60:10 처리의 경우에는 NH4+ 농도는 (NHQzSQ와 NHKH로 조절하였으며 N03- 농도는 KNB를 이용하여 조절하였으며 K의 결핍을 보완하기 위하여 KC1 19 mM을 첨가하였다. 각 처리별 배지에 BA 1 mg/L, sucrose 3%를 동일하게 첨가하여 2주간 신초를 배양하였다.
40:20, 50:10, 60:10 처리의 경우에는 NH4+ 농도는 (NHQzSQ와 NHKH로 조절하였으며 N03- 농도는 KNB를 이용하여 조절하였으며 K의 결핍을 보완하기 위하여 KC1 19 mM을 첨가하였다. 각 처리별 배지에 BA 1 mg/L, sucrose 3%를 동일하게 첨가하여 2주간 신초를 배양하였다. 배양방법은 위 무기성분 농도 효과조사에서 사용한 방법과 동일하였다 실험 종료 후 증식된 신초수, 신초길이, 생체중을 조사하였으며 또한 배지의 pH 변화와 신초 중의 NH;과 NB-의 함량을 다음과 같이 조사하였다.
강원도 평창 지역에서 물재배 고추냉이 (Wasabia japonica 島根 품종)의 종자를 수확하여 꼬투리 채 건조시킨 후 2℃ 에서 보관하며 실험에 사용하였다 종자를 sodium hypochlorite 2% 용액으로 20분간 처리하여 소독하였으며, 멸균수로 3회 세척한 후 휴면타파를 위해 2℃의 냉장고에서 100 mg/L의 ga3용액에 10일간 침적시켰다. 휴면타파 후 위와 같은 방법으로 종자를 2차 소독한 다음 치상하였다.
각 처리별 배지에 BA 1 mg/L, sucrose 3%를 동일하게 첨가하여 2주간 신초를 배양하였다. 배양방법은 위 무기성분 농도 효과조사에서 사용한 방법과 동일하였다 실험 종료 후 증식된 신초수, 신초길이, 생체중을 조사하였으며 또한 배지의 pH 변화와 신초 중의 NH;과 NB-의 함량을 다음과 같이 조사하였다. 신초를 68℃ oven에서 3일 간 건조시킨 후 Willy mill로 분쇄하여 분석 시료로 사용하였다.
배지 중의 질소원 NH4 과 NO3- 농도 비율이 고주냉이신초의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MS 기본액체배지의 초기 총 질소 농도인 60 mM을 기준으로 하여NH4LNO3- 비율을 0:60, 10:50, 20:40, 30:30, 40:20, 50:10, 60:0으로 조절하여 처리하였다. 질소원 비율 0:60, 10:50, 20:40 처리의 경우에는 NH4+과 NO3-의 농도를 NH4NO3와 KNO3를 이용하여 조절하였다.
신초를 68℃ oven에서 3일 간 건조시킨 후 Willy mill로 분쇄하여 분석 시료로 사용하였다. 신초 중의 NH4+과 NO3-를 끓는 물로 추출하였으며, 추출액을 0.45 urn membrane filter에 통과시 킨 후 flow injection autoanalyzer (FIAstar 5000 system, Foss Tecator, Sweden)를 이용하여 NH4+과 NO3-를 분석하였다.
신초의 생장에 미치는 sucrose 농도의 영향을 조사하고자 BA 1 mg/L가 첨가된 MS 기본액체배지에 sucrose를 1, 3, 6%로 달리 처리하여 2주간 배양한 후 증식된 신초의 수와 길이 및 생체중을 조사하였다. 배양방법은 위 무기성분 농도 효과 조사에서 사용한 방법과 동일하였다.
신초의 생장에 적합한 배지의 salt strength를 조사하기 위하여 MS 배지를 기본으로 1/4, 1/2, 1, 2배의 salt strength로 조정한 배지에 BA 1 mg/L, sucrose 3%를 동일하게 첨가한후 2주간 액체진탕방법으로 배양하였다. pH를 5.
조절하여 처리하였다. 질소원 비율 0:60, 10:50, 20:40 처리의 경우에는 NH4+과 NO3-의 농도를 NH4NO3와 KNO3를 이용하여 조절하였다. 30:30 처리의 경우에는 NH4+과 NO3-의 농도를 NH4NO3로 조절하였으며 K의 결핍을 보완하기 위하여 KC1 19 mH을 첨가하였다.
대상 데이터
다신초를 액아와 본엽 이 2 ~ 3매 되도록 분할하였으며 약 0.05 g 이하의 생체중을 지닌 신초를 대량증식 조건 구명을 위한 실험의 재료로 사용하였다 (Figure 1).
데이터처리
처리 사이의 유의성 검정은 SAS 프로그램을 이용하여 5% 유의범위 수준에서 Duncan 다중비교로 처리하였다 (SASInstitute 1989).
성능/효과
8 cm로 가장 길었으며, l/4x 또는 l/2x MS 배지의 신초에 비하여 길이가 2배 이상으로 길었다. MS 배지의 염 농도를 기본배지의 2배로 하였을 때 신초의 길이 신장은 현저히 감소하였다. MS 기본배지에서 신초의 길이가 2주 만에 매우 빠른 속도로 증식되어 평균 3.
NH4+ : NO」비율별 처리 중에서 NQ-의 비율이 높아질수록 고추냉이 신초의 수와 길이 및 생체중이 모두 증가하는 경향을 보였으며, NHJ : NOj 비율 0:60과 10:50 처리구에서 신초의 수와 길이 및 생체중이 모두 가장 우수하였다. W : NO3- 비율이 MS기본배지 농도인 20:40을 비롯하여 30:30, 40:20 까지는 유의차 없이 비슷한 경향을 보였다.
고추냉이의 신초 증식은 salt strength가 낮은 배지에서는 저조하였고, MS 기본배지에서는 신초수의 증가, 길이 신장및 생체중 증가가 뛰어나 MS 기본배지가 고추냉이의 신초증식에 가장 적합한 것으로 판단된다.
배양 2주 후 배지의 pH를 조사한 결과 Table 4와 같다. 배지에 처리된 질소원 중에서 NH; 비율이 높을수록 배지의 pH가 낮아졌으며 특히 질소원으로 NHj만을 공급한 60:0 처리구에서는 배지의 pH가 4.4로 식물생육을 심하게 저해할 수 있는 강한 산성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 보면 배지중의 질소 중에서 NH4+ 형태가 많아지면 고추냉이 신초의 생장이 저해되며 따라서 흡수된 NH4+이 적절히 동화되지 못하고 체내에 과다하게 축적되는 것으로 판단된다.
Table 3과 같다. 배지에 처리된 질소원 중에서 NO3-의 비율이 높을수록 식물체 중의 NO; 함량이 증가하였으며, 반대로 NH4+의 비율이 높을수록 식물체 중 NHJ의 함량이 증가하였다. 특히 NH4+ 비율이 상대적으로 훨씬 높은 40:20, 50:10, 60:0 처리구에서는 식물체 중에 40 ㎎/㎏ 이상의 NH4+ 질소가 축적되었으며, 60:0 처리구에서는 NH4+ 질소가 112.
따라서 배지의 종류, 식물의 종류 또는 배양에 사용하는 조직 등에 따라서 sucrose 적정 농도는 크게 달라질 수 있다. 본 실험에서는 처리간의 큰 차는 없었으나 신초의 수와 길이 그리고 생체중을 함께 고려할 때 고추냉이의 신초 증식에 가장 적합한 sucrose 농도는 3%로 판단된다.
6 cm의 길이 신장을 보였으며 100 mL의 플라스크의 배양병에 더 이상 배양하기 어려웠다 (Figure 1). 생체중도 MS 기본배지에서 1.8 g으로 가장 높았으며, 기본 배지에 비하여 염 농도를 낮추거나 증가시켰을 때 생체중이 현저히 낮았다. Salt strength가 높은 2x MS배지에서는 식물체가 검게 변하고 잎과 엽병의 비틀림 및 비대가 심한 기형을 나타내었다.
신초 수는 l/4x MS 배지에서 lx MS 배지까지 무기성분 농도와 비례하여 증가하다가 salt strength가 더 높은 2x MS 배지에서는 감소하였으나 모든 처리구에서 유의차 없이 평균 2개로 분할이 가능하였다. 신초의 길이 또한 같은 경향은 보였으나 lx MS 배지에서 4.
조사한 결과는 Table 2와 같다. 신초의 수는 배양 2주후 sucrose 1, 3, 6%에서 각각 4.9, 4.5, 4.1 개로 유의차 없이 나타났다. 신초의 길이는 sucrose 3%에서 3.
배지에 처리된 질소원 중에서 NO3-의 비율이 높을수록 식물체 중의 NO; 함량이 증가하였으며, 반대로 NH4+의 비율이 높을수록 식물체 중 NHJ의 함량이 증가하였다. 특히 NH4+ 비율이 상대적으로 훨씬 높은 40:20, 50:10, 60:0 처리구에서는 식물체 중에 40 ㎎/㎏ 이상의 NH4+ 질소가 축적되었으며, 60:0 처리구에서는 NH4+ 질소가 112.8g/kg까지 과다하게 축적되었다. 배양 2주 후 배지의 pH를 조사한 결과 Table 4와 같다.
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