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문제 정의
- 이러한 이유로 일련의 과학자들에 의해 히알루론산과 합성고분자를 화학반응을 통해 결합시키는 일련의 연구가 진행되고 있으며, 22, 23 이들이 제시하는 화학반응과정은 여러 단계를 거쳐야 하는 번거로움(1) 따른다. 따라서 본 연구에서는 이러한 단점을 보완 하고 손쉽게 수용성의 특성을 갖는 히알루론산을 포함한 PLGA 담 체를 제조하고자 유화동결건조법을 사용하여 지지 체를 제조하였으며, 전자주사현미경, 수은다공도계 및 물 흡수율의 측정을 통해 특 성결정을 하였으며, MTT 분석법으로 제조된 지지체의 생체적합성 을 평가하고자 하였다.
- 24 또한 최근에는 중추신경 재생에 있어 GM-CSF의 효 과 및 이의 작용기전에 대한 연구결과가 꾸준히 보고되고 있다.25-27 이에 따라 본 연구에서는 모델 사이토카인。로서 GM-CSF를 담 지하여 이의 방출거동을 확인함으로써 HA-PLGA 다공성 지지체 의 생체활성물질 전달 디바이스로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 세포의 부착과 조직형성을 위한 3차원적 지지체로서 다공성 지 지체는 조직공학의 구성 요소 중 하나이다. 본 연구에서는 유화동 결건조법을 이용하여 생체적합성과 수분 보유 능력이 뛰어난 수용 성의 히알루론산를 함유하는 HA-PLGA 하이브리드 담체를 제조 하고자 하였다. 본 연구에서 사용된 유화동결건조법은 여타의 화학 적 결합을 통한 HA-PLGA 담체의 제조방법보다 더욱 경제적이며 손쉽게 지지체를 제조할 수 있었다.
- 하지만 상기의 방법은 담체 내에 항생제, 성장인자 등의 수용성 약물을 첨가시킬 수 없는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하고자 본 연구팀은 이전 연구에서 유 화동결건조법을 통하여 히알루론산을 함유한 다공성 PLGA 지지 체를 제조하여 이들의 특성을 분석하였으며 수용성 약물, 성장인자 및 단백질을 담지할 수 있는 지지체로의 적용가능성을 확인하였다.16T8
제안 방법
- PLGA 및 HA-PLGA 지지체로부터 GM-CSF의 생체 외 방출실험. 제 조된 각 지지체로부터 GM-CSF의 방출거동을 조사하기 위하여 생체 외에서 방출실험을 실시하였다.
- 방출 전후의 내부 형태 변화를 SEM을 통해 관찰하였다. SEM 분석을 위하여 방출 실험 전의 담체 는 냉동 보관하고 시료를 동결건조하여 잔류 수분을 제거하였고, 방 출 실험 후의 담체 또한 동결건조시킨 후 샘플을 샘플폴더에 고정시 킨 후 플라즈마 스퍼터를 이용하여 백금으로 진공 증착하였다此
- 면도칼로 5X5X1 mm의 크기로 절단하고 플라즈마 스퍼터를 이용하여 코팅하여 촬영한 사진으로 다공의 형태를 확인하였다. 또한 수 은 다공도계 (Micromeritics Co., Model AutoPore II 9220, USA)를 이용하여 제조된 다공성 지지체의 다공 크기 분포, 비다공면적, 평균 다공직경 및 다공도를 측정하였다羽
- 유화동결건조법을 이용한 지지체의 제조 및 GM-CSF를 함유한 지지 체 제조 유화동결건조법에 의한 지지체의 제조 모식도를 Figure 1에 나타내었다. 먼저 1 g의 PLGA를 10 mL의 메틸렌클로라이드에 용해한 후 증류수 또는 1%의 히알루론산 용액을 첨가하였다. 이때 PLGA 용액과 수용액의 부피비율은 7대 3이 되도록 하였다.
- 제조된 지지체의 물 흡수능력을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 먼저 지지체의 초기 무게 ( 昭摄를 측정하고 10 mL의 물에서 3, 5, 7 및 10일 동안 상온에서 방치하 였다 물을 흡수한 지지체의 표면의 수분을 제거한 후 무게 ( 电或) 를 측정하여 식 (1) 에 대입함으로써 물 흡수율을 측정하였다.28 모든 실험은 동일 조건에서 세 번씩 수행하였다.
- 상기의 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 내부, 표면 및 바닥면의 다공형태를 주 사전자현미경 (SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 면도칼로 5X5X1 mm의 크기로 절단하고 플라즈마 스퍼터를 이용하여 코팅하여 촬영한 사진으로 다공의 형태를 확인하였다. 또한 수 은 다공도계 (Micromeritics Co.
- 방출 후 지지체의 모폴로지 확인. 방출 전후의 내부 형태 변화를 SEM을 통해 관찰하였다. SEM 분석을 위하여 방출 실험 전의 담체 는 냉동 보관하고 시료를 동결건조하여 잔류 수분을 제거하였고, 방 출 실험 후의 담체 또한 동결건조시킨 후 샘플을 샘플폴더에 고정시 킨 후 플라즈마 스퍼터를 이용하여 백금으로 진공 증착하였다此
- 히알루론산을 함유한 PLGA 지지체의 특성. 상기의 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 내부, 표면 및 바닥면의 다공형태를 주 사전자현미경 (SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 면도칼로 5X5X1 mm의 크기로 절단하고 플라즈마 스퍼터를 이용하여 코팅하여 촬영한 사진으로 다공의 형태를 확인하였다.
- 이때 GM-CSF를 함유한 지지체를 제조하기 위하여 지지체당 50 및 200 ng의 농도로 GM-CSF를 수층에 첨가하였다. 유기층과 수층 으로 상분리가 일어난 용액을 유화시키기 위하여 초고주파 분쇄기 (Ultrasonic Dismembrator Model 500, Fisher Scientific, USA)를 사용하였으며, 30%의 출력으로 50초 동안 혼합을 실시하였다. 이 유화액을 미리 -198 ℃의 액체질소에 의해 냉각된 테플론 몰드 에 부어 충분히 급냉시킨 후 5 mTorr, -70 ℃의 조건에서 동결건 조하였다 잔류용매인 MC를 제거하기 위하여 최소 1주일 이상 4 ℃ 에서 건조시켰다.
- 유화동결건조법을 이용한 다공성 지지 체의 제조 . 유화동결건 조법을 이용하여 히알루론산을 함유한 다공성 지지체를 제조하였다. 히알 루론산을 혼합하여 다공성 지지체를 제조하여도 물성의 변화가 크 지 않고, 몰드의 형태와 같은 일정한 크기의 다공성 지지체를 제조 할 수 있었다.
- PLGA 및 HA-PLGA 지지체로부터 GM-CSF의 생체 외 방출거동 확인. 유화동결건조법으로 제조된 PLGA 및 HA-PLGA 지지체를 단백질 약물 및 싸이토카인의 전달체로서의 가능성을 확인하고자 모델 성장인자로 GM-CSF를 담체당 50 및 200ng씩 로딩하여 지지체 에서의 방출경향을 확인하였다. GM-CSF가 함유된 지지체의 방출 확인은 56일 동안 수행하였으며 ELISA를 통해 관찰한 누적방출 양(%) 측정 결과를 Figures 6 및 7에 나타내었는데, 방출기간 동안 지속적인 GM-CSF의 방출 경향을 확인할 수 있었다.
- 이때 PLGA 용액과 수용액의 부피비율은 7대 3이 되도록 하였다. 이때 GM-CSF를 함유한 지지체를 제조하기 위하여 지지체당 50 및 200 ng의 농도로 GM-CSF를 수층에 첨가하였다. 유기층과 수층 으로 상분리가 일어난 용액을 유화시키기 위하여 초고주파 분쇄기 (Ultrasonic Dismembrator Model 500, Fisher Scientific, USA)를 사용하였으며, 30%의 출력으로 50초 동안 혼합을 실시하였다.
- PLGA 및 HA-PLGA 지지체로부터 GM-CSF의 생체 외 방출실험. 제 조된 각 지지체로부터 GM-CSF의 방출거동을 조사하기 위하여 생체 외에서 방출실험을 실시하였다. 각각의 지지체에 5mL의 PBS 를 넣은 후, 37 ℃의 인큐베이터에서 70 rpm의 속도로 교반시켜주 면서 정해진 시간간격마다 전량의 PBS를 회수하고 동일한 양의 용 출액을 보충해 주었다.
- 각각의 지지체에 5mL의 PBS 를 넣은 후, 37 ℃의 인큐베이터에서 70 rpm의 속도로 교반시켜주 면서 정해진 시간간격마다 전량의 PBS를 회수하고 동일한 양의 용 출액을 보충해 주었다. 채취한 시료는 분석시까지 4 ℃에서 보관하 였으며 분석 방법으로는 효소결합면역 흡착검사(ELISA) 를 사용하 였으며 이는 고정화된 GM-CSF 수용체에 GM-CSF를 결합시킨 후 HRP로 발색시켜 450 nm의 파장을 조사하여 흡광도를 측정하였다.31
- MTT 분석. 히알루론산의 첨가에 따른 지지체에서의 세포독성을 MTT 분석법을 통하여 비교하였다(Figure 5). PLGA 지지체와는 달리 HA-PLGA 지지체는 실험을 진행하는 동안 계속적으로 세포 가 성장하였으며, 28일째에는 흡광도가 무려 4배의 차이를 보였다.
대상 데이터
- , USA) 등의 모든 화학약품과 유기용매는 HPLC 등급을 사용하였다. 방출확 인을 위해 ELISA 키트(R&D system, Inc., USA)를 사용하였으며, 방출을 위한 용출액으로 인산염완충용액(PBS, pH 7.4)을 사용하였다.
- NIH-3T3 세포의 배양. 섬유아세포(NIH/3T3 mouse embryo fibroblast, KCLB21658, Korea Cell Line Bank, Korea) 는 한 국세포주은행에서 구입하였으며, 10%의 우태아혈청 (FBS, Gibco, USA) 과 1%의 안티바이오틱 -안티 마이 코틱 (Gibco) 이 함유된 Rosswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배양액 (Gibco) 으로 37 ℃, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 플라 스크에 단층을 형성한 세포에 트립신(Trypsin-EDTA, Gibco)을 처리하여, ixlO'cells/지지체의 농도로 세포수를 세어 지지체에 파종하였다.
- 시약 및 재료 히알루론산(Fhika Co., USA)은 연쇄상구균으로부터 분리된 것을 사용하였으며, PLGA(락타이드/글라이콜라이드 몰 비 75/25, Resomer® RG 756, Boehringer Ingetheim Chem. Co. Ltd., Germany) 는 평균분자량이 90000 g/mole인 것을 사용하였다. 또한 메틸렌클로라이드(Tedia Co.
이론/모형
- MTT 분석 세포의 부착도 및 증식률은 MTT 분석법을 이용하여확인하였다. 세포가 파종된 지지체에 7, 14, 21 및 28일째에 MTT (3 — [4, 5- dimethylthiazol - 2—yl] -2, 5- dipheny Itetrazolium bromide, Sigma Co.
- Figure 2. SEM micrographs of hyaluronic acid loaded PLGA scaffold by means of emulsion freeze-drying method. (A) PLGA scaffold and (B) HA-PLGA scaffold (magnification; 100, scale bar; 500 μm).
- Figure 1. The Schematic diagram illustrating of the fabrication process of hyaluronic aicd loaded PLGA scaffold by emulsionfreeze-drying method.
- Figure 4. Water-uptake ability of PLGA and HA-PLGA scaffold by means of emulsion freeze-drying method.
- 유화동결건조법을 이용한 다공성 지지 체의 제조 . 유화동결건 조법을 이용하여 히알루론산을 함유한 다공성 지지체를 제조하였다.
성능/효과
- 이러한 미세 채널은 매트릭스 내부로 침투하는 물의 양을 증가시 켜 히알루론산의 용해와 PLGA의 분해를 촉진시키고 따라서 히알 루론산과 결합하고 있던 GM-CSF가 히알루론산의 용해와 동시에 지지체 밖으로 빠져나오기 용이하여 히알루론산을 함유한 지지체에서 더 높은 방출 거동을 보인 것으로 사료된다. 56일 이후의 GM- CSF의 방출량은 50 ng의 GM-CSF를 담지시킨 경우 각각 PLGA 지지체가 약 67%, HA-PLGA 지지체는 약 87%였고, 200 ng의 GM-CSF를 담지시킨 경우는 PLGA 지지체가 약 33%, HA- PLGA 지지체가 약 67%의 방출을 보였다. 각각의 실험군에 대한 누적방출 백분율을 계산할 때 50 ng의 GM-CSF를 함유한 담체가 200 ng의 GM-CSF를 함유한 담체보다 더 높은 백분율을 나타내 나 누적방출량을 환산하여 볼 때 200 ng의 GM-CSF를 함유한 담 체가 50 ng의 GM-CSF를 함유하는 담체보다 더 많은 양의 GM- CSF를 방출함을 확인할 수 있었다.
- 유화동결건조법으로 제조된 PLGA 및 HA-PLGA 지지체를 단백질 약물 및 싸이토카인의 전달체로서의 가능성을 확인하고자 모델 성장인자로 GM-CSF를 담체당 50 및 200ng씩 로딩하여 지지체 에서의 방출경향을 확인하였다. GM-CSF가 함유된 지지체의 방출 확인은 56일 동안 수행하였으며 ELISA를 통해 관찰한 누적방출 양(%) 측정 결과를 Figures 6 및 7에 나타내었는데, 방출기간 동안 지속적인 GM-CSF의 방출 경향을 확인할 수 있었다. 지지체에 포함된 히알루론신이 용출액과 접촉하면서 용해가 일어나게 되고 팽 윤되어 지지체내에 외부와 접촉할 수 있는 채널을 형성하기 쉬워진 다.
- 56일 이후의 GM- CSF의 방출량은 50 ng의 GM-CSF를 담지시킨 경우 각각 PLGA 지지체가 약 67%, HA-PLGA 지지체는 약 87%였고, 200 ng의 GM-CSF를 담지시킨 경우는 PLGA 지지체가 약 33%, HA- PLGA 지지체가 약 67%의 방출을 보였다. 각각의 실험군에 대한 누적방출 백분율을 계산할 때 50 ng의 GM-CSF를 함유한 담체가 200 ng의 GM-CSF를 함유한 담체보다 더 높은 백분율을 나타내 나 누적방출량을 환산하여 볼 때 200 ng의 GM-CSF를 함유한 담 체가 50 ng의 GM-CSF를 함유하는 담체보다 더 많은 양의 GM- CSF를 방출함을 확인할 수 있었다.
- 수용성의 생리 활성물질의 전달체로서의 가능성을 확인하기 위하여 GM-CSF가 담지된 지지체를 제조하고 이의 방출을 확인한 결과 GM-CSF는 56일 동안 지속적으로 방출되었고, 히알루론산을 함유한 지지체에서 높은 방출 결과를 확인하였다. 또한, 방출실험과 SEM을 통한 방 출 후 담체의 모폴로지 변화의 결과로부터 PLGA의 조성을 조절하 지 않고도 히알루론산의 혼합만으로도 분해속도를 조절할 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 방출 후 지지체의 모폴로지 변화 확인 방출 실험 후의 지지체의 모 폴로지 변화를 Figure 8에 나타내었다. 방출 후에는 지지체의 다공형태가 상당부분 일그러짐을 확인하였고 PLGA 지지체보다 히알 루론산을 함유한 PLGA에서 다공의 일그러짐이 더 확연함을 관찰 하였다 히알루론산의 물과 쉽게 결합하는 특성으로 인해 HA-PLGA 지지체의 내부의 형태변화에 있어서 히알루론산은 내부의 균열 증 가와 용출액과 접촉하는 표면적을 증가시킨다. 이러한 붕괴현상이 물의 침투속도를 가속화시키고 빠른 팽윤작용에 의해 약물의 방출 과 지지체의 분해를 촉진시킨 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 유화동 결건조법을 이용하여 생체적합성과 수분 보유 능력이 뛰어난 수용 성의 히알루론산를 함유하는 HA-PLGA 하이브리드 담체를 제조 하고자 하였다. 본 연구에서 사용된 유화동결건조법은 여타의 화학 적 결합을 통한 HA-PLGA 담체의 제조방법보다 더욱 경제적이며 손쉽게 지지체를 제조할 수 있었다. SEM을 통하여 제조된 지지체 내부에는 상호연결된 다공구조를 가짐을 확인하였으며, 급속도로 동결하므로 두상이 골고루 분산을 이루게 되어 담체의 모폴로지의 변화는 확인할 수 없었다.
- MTT 분석법을 통하여 히알루론산이 세포의 성 장과 증식에 긍정적인 영향을 미침을 확인하였고 이는 히알루론산 이 가지는 생체적합성과 친수성 때문으로 사료된다. 수용성의 생리 활성물질의 전달체로서의 가능성을 확인하기 위하여 GM-CSF가 담지된 지지체를 제조하고 이의 방출을 확인한 결과 GM-CSF는 56일 동안 지속적으로 방출되었고, 히알루론산을 함유한 지지체에서 높은 방출 결과를 확인하였다. 또한, 방출실험과 SEM을 통한 방 출 후 담체의 모폴로지 변화의 결과로부터 PLGA의 조성을 조절하 지 않고도 히알루론산의 혼합만으로도 분해속도를 조절할 수 있는 가능성을 보여주었다.
- SEM을 통하여 제조된 지지체 내부에는 상호연결된 다공구조를 가짐을 확인하였으며, 급속도로 동결하므로 두상이 골고루 분산을 이루게 되어 담체의 모폴로지의 변화는 확인할 수 없었다. 수은 다공도계 분석을 통해 히알루론산 을 함유한 PLGA 지지체가 단일한 PLGA 지지체보다 다공도가 높 고 다공의 크기가 큰 것을 관찰하였다. 이는 함유된 히알루론산의 약간의 손실에 의한 것으로 예상되나 세포의 부착과 성장에 큰 영향을 주지 않는 범위 내인 것으로 사료된다.
- 수은다공도계로 다공도 및 다공 크기를 분석한 결과를 Figure 3에 나타내었다. 유화동결건조법으로 제조된 지지체는 높은 다공도 와 여러가지 크기의 다공을 갖음을 확인하였고 제조된 지지체의 평균다공도는 PLGA 지지체가 약 91%, 히알루론산을 함유한 지 지체의 경우에 약 97%이였으며, 히알루론산을 함유한 지지체가 더 높은 다공도를 보였으나 두 지지체 모두 높은 다공도를 가짐을 확 인하였다. 평균 다공의 크기는 PLGA 지지체의 경우에는 12.
- 이로써 유화동결건 조법으로 제조된 히알루론산을 함유한 PLGA 지지체는 세포의 부착 및 성장에 도움을 주며 생리활성물질의 서방 형 담체로서의 가능성을 보여주었고, 또한 신경재생에 긍정적인 영향을 주는 인자로 보고되고 있는 GM-CSF를 함유한 HA-PLGA 담체는 손상된 중추신경 및 말초신경의 재생에 있어 기능성 담체로 서의 충분한 역할을 수행할 것으로 사료된다. 현재 조직공학적 장기 재생에서의 다공성 담체로서 히알루론산을 이용한 다양한 형태의 천연/합성 하이브리드 담체 개발과 이들의 실용화에 대하여 연구 중에 있다.
- 외형적 형태는 테플론 몰드의 빈 공간과 똑같은 형태로 얻어졌으며, 수축, 불규칙한 크기의 구멍 및 여타 결함이 없는 것点 관찰되었다. 지지체의 내부 및 표면의 다 공 구조는 다공과 다공 사이의 연결이 양호하고 대부분이 열린 셀 구조를 하고 있는 것으로 나타났으며, 히알루론산을 첨가하더라도 내부의 다공 구조에는 변화가 없음을 확인할 수 있었다.1631 하지만 실 리콘과의 접촉부분인 지지체의 바닥면은 거의 모든 샘플에서 대부분 닫힌 셀 구조를 나타내었으며, 히알루론산을 첨가한 지지체의 경우 더 확연한 결과를 확인할 수 있었다.
- 유화동결건조법으로 제조된 지지체는 높은 다공도 와 여러가지 크기의 다공을 갖음을 확인하였고 제조된 지지체의 평균다공도는 PLGA 지지체가 약 91%, 히알루론산을 함유한 지 지체의 경우에 약 97%이였으며, 히알루론산을 함유한 지지체가 더 높은 다공도를 보였으나 두 지지체 모두 높은 다공도를 가짐을 확 인하였다. 평균 다공의 크기는 PLGA 지지체의 경우에는 12.18 呻, HA-PLGA 지지체는 21.48 皿로 HA-PLGA 지지체에서 더 큰 다공의 크기를 확인하였다. 이는 PLGA에 고루 분산되어 있는 히 알루론산 가운데 극소량이 상온에서 약간의 분해가 일어나면서 다 공도 및 다공크기가 증가한 것으로 예상되나 두 지지체가 확연한 차이를 보이지 않았다.
- 히알루론산의 첨가에 따른 친수성 효과를 Figure 4에 나타내었다. 히알루론산을 함유한 PLGA 지지체가 PLGA 지 지체보다 4~6배 높은 함수율을 나타내었으며, 히알루론산을 함유 한 PLGA 지지체는 약 670%의 함수율을 나타내었다. 히알루론산 은 대표적인 프로테오글라이칸의한 종류로서 코어 단백질을 중심으로 많은 수의 글루코스아미노글라이칸들이 결합되어 있는 구조를 가지고 있는데, 이러한 구조적인 특징으로 인해 친수성이 증가하여 수분을 함유하는 능력이 뛰어나 이와 같은 결과를 보이는 것으로 사 료된다.
후속연구
- 상기의 결과들에서 설명해주는 것과 같이 PLGA 지지체에 히 알루론산을 첨가하게 되면 분해속도가 빨라지게 되는데 이는 물성 이 변하지 않고도 세포가 성장하는 환경을 제공하는 역할을 할 것으로 예상된다. 또한 손쉽게 PLGA의 분해속도를 조절할 수 있는 장점이 있어 차후 조직공학 및 약물전달시스템 분야에 있어서 여러 용도로 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
- 분 자량이 90000 g/mole의 PLGA의 생체외에서 분해기간은 약 여섯 달 정도이며, 이는 세포가 부착하고 성장하는 물성을 제공하여 준 다. 상기의 결과들에서 설명해주는 것과 같이 PLGA 지지체에 히 알루론산을 첨가하게 되면 분해속도가 빨라지게 되는데 이는 물성 이 변하지 않고도 세포가 성장하는 환경을 제공하는 역할을 할 것으로 예상된다. 또한 손쉽게 PLGA의 분해속도를 조절할 수 있는 장점이 있어 차후 조직공학 및 약물전달시스템 분야에 있어서 여러 용도로 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
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