[논문]마이크로웨이브법에 의해 제조된 HAp 및 BCP 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 미치는 영향

송호연; 민영기; 양훈모; 맹주양

doi:10.3740/mrsk.2007.17.12.669

문제 정의

따라서 본 연구에서는 생체친화성 칼슘-인산계 뼈 이식제의 원료분말을 합성하기 위해 microwave 합성법을 사용하여 나노 수준의 HAp와 BCP 분말을 합성하였고, 특히 pH를 조절함에 따라 다양한 Ca/P 조성을 갖는 BCP를 합성할 수 있는 기술을 확보 하였다. 또한 이들 HAp 및 BCP 분말을 뼈 ">확보 하였다. 또한 이들 HAp 및 BCP 분말을 뼈 이식제등 생체소재의 원료 분말로 사용하기 위한 전 단계로 이들 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다. 즉, 이들 HAp와 BCP 분말의 생체적합성 및 생체 활성을 평가하기 위해 이들 분체의 미세조직을 관찰하기 위해 SEM(JSM-635F, JEOL)과 TEM(JEM2010, JEOL)에 의해 분석하였고, XRD(D/MAX250, Rigaku, Japan)을 사용하여 결정상을 관찰하였다. 또한 이들 분말을 뼈 이식제등 생체소재의 원료 분말로 사용하기 위한 전 단계로 이들 HAp 및 BCP 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다.
본 실험은 마이크로파를 이용하여 나노 크기를 갖는 칼슘-인산계 (HAp, α-TCP, β-TCP) 화합물 및 단상 HAp분체를 제조하는 방법이다.

제안 방법

0.1 mg/ml의 비율로 제조된 HAp 및 BCP 분말 현탁 원액을 배양배지로 10배수로 희석(1 : 1, 10−1, 10−2)하여 첨가한 후 3, 7, 14일 동안 배양하였다.
후)독성평가">독성 평가 실험을 수행하였다.¹⁴⁾ 배양된 L-929 세포의 각 well마다 분말의 용출 희석액을 넣고 72시간 동안 배양 한 후 MTT 분석법에 의해 살아있는 세포수를 간접 측정하였다. HAp와 BCP 후)정량 ;">정량; Alizarin red-S는 calcium salt와 특이적으로 결합하는 염색 시약으로 뼈모세포의 배양에서 석회화의 정도를 측정하는 방법으로 이용되고 있다.^16,17) In vitro mineralization assay를 위해 뼈모세포 유래인 MG-63 세포를 10% 우혈청, 항생제, 50 ug/ml ascorbic acid 및 10 mM L-glycerophosphate가 포함된 세포 분화용 배지를 사용하여 28일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 즉 MG-63 세포를 24-well 20) 본 실험에서는 2×103의 MG-63 세포를 24-well 배양용기에 24시간 동안 배양한 후 배양 상층액을 제거하여 microwave 합성법으로 제조된 HAp 와 BCP의 분말이 첨가된 배양배지에서 3, 7, 14일 동안 배양하였다.
후)세포성장거동을">세포성장 거동을 관찰하였다.^9,14) 또한 HAp와 BCP를 처리한 MG-63 세포에서 뼈 형성 초기에 생산되는 효소인 alkaline phosphatase를 측정하여 세라믹 뼈 이식제가 뼈모세포의 활성에 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하였고, 장기간 배양된 뼈모세포에서 콜라겐 섬유의 생성 및 칼슘 침전 여부를 관찰하여 뼈모세포의 in vitro mineralization 정도를 관찰하였다.
HAp와 BCP 분말 현탁액 제조; microwave법으로 제조된 100 nm 이하의 HAp와 BCP 분말은 고압증기멸균 방법으로 121℃에서 15분 동안 멸균하여 dry-oven에 24시간 이상 건조 시킨 후, 0.1 mg/ml의 비율로 10% 우혈청이 첨가된 DMEM 배지에 현탁시켜 사용하였다.
SEM에 의한 세포의 형태학적 관찰; Scanning electron microscope(SEM)에 의한 세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 HAp 및 BCP 분말과 함께 단층 배양된 MG-63 및 Raw 264.7 세포를 2% glutaraldehyde로 2시간 동안 고정한 후, 0.1 M 인산 완충용액으로 희석된 1% OsO₄로 1.5시간 동안 후 고정을 실시하였다. 세포들은 0.
TEM에 의한 콜라겐 섬유 관찰; TEM에 의한 뼈모세포에서의 콜라겐 생성을 관찰하기 위해 HAp 및 BCP 분말 현탁액과 함께 배양한 세포에 직접 2.5% glutaraldehyde-1.5% paraformaldehyde PBS 고정액을 2 ml씩 첨가한 후 4℃에서 2시간 동안 고정하였고 1% OsO₄로 1.5시간 동안 후 고정을 실시하였다. 이어 세포들은 0.
후)초박절 편을">초박절편을 만들었다. 각각의 절편들은 전자현미경(JEM 100 CXII)으로 관찰하였다.
">에탄올로 탈수시켰다. 건조제로 hexamethy-ldislazene (Sigma)를 사용하였고, 준비된 시편은 금 스퍼터링을 이용하여 코팅한 후 SEM(JSM-541-LV, JEOL)으로 관찰하였다.
후)분말현탁액을">분말 현탁액을 첨가한 후 3일 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양시켰다. 대조군으로는 분말이 포함되지 않은 배양배지에서 자란 뼈모세포를 사용하여 비교 관찰하였다. 세포의 후)배양 배지의">배양배지의 조건과 뼈 형성 유도물질의 첨가에 의해 in vitro에서도 관찰될 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 HAp 와 BCP가 뼈모세포의 석회화 과정을 유도하는지를 TEM을 통해 관찰하였다. 콜라겐 섬유들은 단층 배양된 뼈모세포의 주위에서 관찰 되었으며, HAp 와 BCP 분말이 첨가된 후)기대되었던">기대 되었던 Ca-P 결정체는 세포 주변에서 관찰되지 않았다. 따라서 칼슘과 특이적으로 결합하는 AR-S 염색을 하여 석회화 과정에 필수적인 Ca-P의 침전을 정량적으로 측정하였다. HAp 와 BCP 분말이 첨가된 그 후 ELISA reader(EL 312e, Bio-tek)를 사용하여 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며 ALP의 농도는 p-NP(sigma, N7660)를 기준으로 정량하였다. 또한 각각의 ALP 측정치를 보정하기 위해 BCA kit (pierce, 23225)를 사용하여 총 단백질 량을 측정하였다.
1). 마이크로파를 이용하여 합성된 HAp와 BCP 분말을 XRD에 의해 분석하였다. pH 6인 경우, HAp, β-TCP 그리고 α-TCP의 상이 섞여 있는 것을 확인 할 수 있었다.
후)세포독성평가;">세포독성 평가; 용출액은 분말을 0.1 mg/ml의 비율로 배양 배지에 첨가 한 뒤 37℃에서 100 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양하여 제조 하였고, 이를 새로운 배양배지를 사용하여 2 배수로 연속 희석하여 용출-희석액을 만들었다.⁹⁾ 섬유아세포인 L-929 세포를 24-well 후)배양 배지에서">배양배지에서 자란 뼈모세포를 사용하여 비교 관찰하였다. 세포의 성장 거동은 상기의 MTT 분석법 및 SEM으로 관찰하여 비교하였다.
">용해 시켰다. 용해된 MTT 용액을 96 well 배양 용기에 옮겨 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정한 후 용출액의 희석농도(%)에 대한 각 흡광도로부터 상대적 세포 생존율(%)을 구하였다.¹⁵⁾
후)수산화 아파타이트를">수산화아파타이트를 제조하였다. 이들 분체의 미세조직을 관찰하기 위해 SEM(JSM-635F, JEOL)과 TEM(JEM2010, JEOL)에 의해 분석하였고, XRD(D/MAX250, Rigaku, Japan)을 사용하여 결정상을 관찰하였다. 또한 이들 분말을 뼈 후)단상HAp분체를">단상 HAp분체를 제조하는 방법이다. 이를 자세히 기술하면, Ca(OH)₃와 H₃PO₄을 출발물질로 하여 마이크로파를 사용하여 pH를 조절함으로서 단상의 수산화아파타이트 및 인산-칼슘계 화합물을 합성하였고 건조단계를 거쳐 입자 크기가 100 nm 이하인 구형의 칼슘-인산계 혼합분체 및 단상의 수산화아파타이트를 제조하였다. 이들 분체의 미세조직을 관찰하기 위해 SEM(JSM-635F, JEOL)과 TEM(JEM2010, JEOL)에 의해 분석하였고, XRD(D/MAX250, Rigaku, Japan)을 사용하여 결정상을 관찰하였다.
후)인공뼈">인공 뼈 이식제의 원료 분말로 사용하기 위해 microwave 합성법을 이용하여 HAp와 BCP 분말을 합성하였고 이들 분말의 생체접합성과 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다.
일정 배양시간이 지난 후 배지를 완전히 제거하고 PBS(pH 7.4)로 2번 수세한 후 0.5% triton x-100을 250 µl를 첨가하였다.
즉 MG-63 세포를 24-well 배양 용기에 well 당 1×103 세포씩 분주하여 24시간 동안 배양한 뒤 배지를 제거하고 0.1 mg/ml의 비율로 제조된 HAp 및 BCP 분말 현탁 원액을 배양배지로 희석(1 : 1, 10−1, 10−2)하여 첨가한 후 28일 동안 배양 하였다.
즉, 이들 HAp와 BCP 분말의 생체적합성 및 생체 활성을 평가하기 위해 국제 표준 규격(ISO: international Standard Organization) 10993 항목인 'biological evaluation of medicine devices'에 준하여 세포독성 평가 및 세포성장 거동을 관찰하였다.
한편 HAp와 BCP 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 5×103의 MG-63 세포를 24-well 배양용기에 배양한 후 배양 상층액을 제거하고 microwave 합성법으로 제조된 나노 크기의 HAp와 BCP의 분말이 첨가된 배양배지에서 3일 동안 배양하였다.

대상 데이터

세포배양; 세포독성 평가에 흔히 사용되는 섬유아세포인 L-929 세포와 뼈모세포 유래인 MG-63 세포(KCLB21427) 및 파골세포 유래의 Raw 264.7 세포의 배양은 10% 우혈청(FBS, #SH30088, Hyclone)과 항생제(antibioticantimycotic solution, #15240-062, Gibco)가 포함된 DMEM(Gibco, 11965-092) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 증식시켰다.

이론/모형

HAp와 BCP의 생체적합성을 확인하기 위해 국제 표준 규격인 ISO 10993-5 항목에 준하여 HAp와 BCP에 대한 세포단계의 독성 평가 실험을 수행하였다.¹⁴⁾ 배양된 L-929 세포의 각 well마다 분말의
성능/효과
- 1. Microwave 합성법을 이용하여 100 nm 이하의 HAp와 BCP 분말을 합성하였고 pH 조건을 조절함으로서 HAp와 β-TCP의 상의 비를 조절할 수 있었다.
- 2. ISO 기준에 준하여 평가한 세포독성 평가 결과 HAp와 BCP 분말은 세포독성을 나타내지 않는 생체 친화성 소재임을 확인 하였다.
- 3. HAp와 BCP 분말과 함께 배양된 뼈모세포와 파골 세포에서 세포 증식의 억제나 세포 손상에 의한 형태학적 변화는 관찰되지 않았다.
- 후)4.뼈모세포의">4. 뼈모세포의 ALP 활성을 비교해 보면 HAp와 BCP 분말과 함께 배양된 세포에서 대조군에 비해 현저하게 높은 활성을 나타났는데 이는 칼슘-인산계 뼈이식제인 HAp와 BCP가 뼈모세포의 활성을 현저하게 유도하는 생체소재로 사료된다.
- 5. HAp와 BCP 분말과 함께 배양된 뼈모세포의 석회화 과정을 TEM으로 관찰한 결과, 분말을 처리한 군에서 콜라겐 섬유 합성에 관여하는 세포 소기관인 lamella body 형성이 두드러지게 증가하였고, 세포와 세포 사이의 콜라겐 섬유도 증가하였다.
- 후)배양 배지에서">배양배지에서 3, 7, 14일 동안 배양하였다. ALP의 활성은 분말 현탁액을 넣고 3일 동안 배양한 세포에서 현저하게 높게 나타났고, 7과 14일 동안 배양한 세포에서는 점차 감소하는 양상이 관찰되었다. 특히 배양 3일째에 뼈모세포의 ALP 활성을 후)특이적으 로">특이적으로 결합하는 AR-S 염색을 하여 석회화 과정에 필수적인 Ca-P의 침전을 정량적으로 측정하였다. HAp 와 BCP 분말이 첨가된 배양배지에서 증식된 뼈모세포에서 대조군에 비해 높은 칼슘 축적률을 나타내었고 첨가된 HAp 와 BCP의 농도가 높아질수록 칼슘의 양이 증가하였다(Fig. 8). 이는 세포 후)배양한">배양 한 후 MTT 분석법에 의해 살아있는 세포수를 간접 측정하였다. HAp와 BCP 용출액을 첨가하여 배양한 L-929 세포의 생존율은 저농도의 용출액을 첨가한 배지에서는 정상 배양배지에서 자란 세포와 유사한 세포성장 거동을 나타내었으나 고농도의 용출액이 첨가된 배양배지에서 자란 세포는 대조군에 비해 약간 낮은 세포성장을 나타내었다(Fig. 3, 4). 그러나 HAp와 BCP의 합성에 일반적으로 사용되는 wet-reaction 합성법을 사용하면 sub-micron 크기의 침상형 HAp가 합성되는데 비해 마이크로파를 이용하여 합성하면 나노 크기의 구형 HAp 분말을 합성할 수 있었고 특히 pH 조건을 조절함에 따라 HAp와 β-TCP의 상비를 조절할 수 있었으며, pH가 증가함에 따라 더욱 미세한 분말 구조를 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 그러나 pH가 증가함에 따라, HAp 상의 비가 증가하였고 β-TCP, α-TCP의 상비는 낮아짐을 확인 할 수 있었다.
- 3, 4). 그러나 세포독성 평가 기준인 IC 50(Inhibitor concentration 50) 보다는 훨씬 높은 세포 성장 거동을 나타내고 있어 microwave 합성법으로 제조된 HAp와 BCP는 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 한편, HAp 용출액과 배양된 L929 세포의 생존율이 BCP ">관찰 되었다. 또한 이들 세포내에서 콜라겐 섬유의 합성에 관여 하는 것으로 알려진 lamallar body가 현저히 증가된 것이 관찰되었는데 이는 HAp 와 BCP가 뼈모세포의 콜라겐 생성을 강력히 유도하는 것으로 사료된다(Fig. 7). 그러나 TEM 소견상 후)분말현탁액을">분말 현탁액을 넣고 3일 동안 배양한 세포에서 현저하게 높게 나타났고, 7과 14일 동안 배양한 세포에서는 점차 감소하는 양상이 관찰되었다. 특히 배양 3일째에 뼈모세포의 ALP 활성을 비교해 보면 분말과 함께 배양된 세포에서 대조군에 비해 현저하게 높은 활성을 나타났는데 이는 HAp 와 BCP가 뼈모세포의 활성을 현저하게 유도하는 것으로 뼈 이식제 제조를 위한 우수한 원료 소재로 사료된다(Fig. 6).
- 이는 나노 크기의 HAp와 BCP 분말이 세포독성에 영향을 끼치지 않는 것으로 판단된다. 한편, HAp와 BCP 나노분말이 포함된 배지에서 배양된 Raw 264.7 세포의 SEM 사진에서는 세포들의 돌기가 잘 발달되어 있고 돌기에 의해 세포들이 서로 연결되어 있는 등 대조군과 비교하여 형태학적 큰 차이점은 발견되지 않았으나, 고농도를 처리 해준 세포에서는 세포 표면이 세포내로 들어가고 있는 듯한 함몰 현상이 관찰되었다(Fig. 5, bottom). 그러나 TEM 소견에서는 세포질 내에서 HAp 나 BCP 입자가 관찰되지 않았으며 핵과 세포질 내의 세포 소기관들의 손상 또한 관찰되지 않았다.
후속연구
- 13) 따라서 이들 원료 분말을 사용하여 뼈 이식제를 개발한다면 HAp에 의한 기계적 강도 조절과 β-TCP에 의한 생분해 특성 조절이 가능해져 인체 내 이식 부위의 뼈의 특성에 맞게 환자 맞춤형 치료도 가능할 것으로 생각된다.
- 8). 이는 세포 시료 처리과정에서 충분한 수세가 이루어졌기 때문에 칼슘양의 증가가 첨가된 HAp 나 BCP에 의한 것으로는 보이지 않지만 보다 정확한 확인을 위해 SEM-EDS 등을 통한 관찰이 요구된다.

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

마이크로웨이브법에 의해 제조된 HAp 및 BCP 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 미치는 영향
The Effects of HAp and BCP Nano Powders Synthesized by Microwave-Assisted Synthesis on the Activation of Osteoblast and Osteoclast 원문보기

Abstract ▼ AI-Helper

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

제안 방법

대상 데이터

이론/모형

성능/효과

후속연구

참고문헌 (21)

이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

연구과제 타임라인

관련 콘텐츠

원문 보기

원문 URL 링크

오픈액세스(OA) 유형

이 논문과 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

연합인증

마이크로웨이브법에 의해 제조된 HAp 및 BCP 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 미치는 영향 The Effects of HAp and BCP Nano Powders Synthesized by Microwave-Assisted Synthesis on the Activation of Osteoblast and Osteoclast 원문보기

Abstract ▼ AI-Helper

주제어

AI 본문요약 엑셀 다운로드 AI-Helper

문제 정의

제안 방법

대상 데이터

이론/모형

성능/효과

후속연구

참고문헌 (21)

이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

송호연 (21) 민영기 (22) 양훈모 (17) 맹주양 (9)

연구과제 타임라인

전체(0) 논문(0) 특허(0) 보고서(0)

전체(0) 논문(0) 특허(0) 보고서(0)

관련 콘텐츠

원문 보기

원문 URL 링크

오픈액세스(OA) 유형

이 논문과 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

마이크로웨이브법에 의해 제조된 HAp 및 BCP 분말이 뼈모세포 및 파골세포의 활성에 미치는 영향
The Effects of HAp and BCP Nano Powders Synthesized by Microwave-Assisted Synthesis on the Activation of Osteoblast and Osteoclast 원문보기

AI 본문요약
AI-Helper