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문제 정의
- 이러한 결과는 형질전환 시스템을 이용하여 종자의 확보가 어려운 인삼에서 ginsenoside를 중심으로 한 이 차 대사의 functional genomics을 위한 재료로 인삼 모상 근을 사용할 수 있음을 시사한다. 따라서 본 연구에서는 인 삼의 주요 약리 성분인 인삼 사포닌, ginsenoside의 생합성 관련 유전자를 중심으로 한 이 차 대사의 functional genomics를 위한 시스템 확립을 위해 activation tagging 인삼 모상근 을 중심으로 대량의 모상근 line을 개발하고자 하였다.
- 본 연구는 아그로박테리움 공동배양법을 이용한 기능획득 인삼 모상근의 대량생산을 위한 조건 확립에 대한 것이다. 일반적으로, 인삼과 같이 형질전환을 통한 종자의 확보가 어려운 식물에서는 loss-of-fiinction을 이용한 기능유전체 연구에 한계가 있다.
제안 방법
- PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation한 후, 94, 58, 72℃ 각 1분씩 25 cycle을 수행 후, 72℃ 에서 5분간 last extension 시켰다. PCR 반응에 이용한 primer는 RolB 유전:4 (5'-CCTATTCGAGGGGATCCGATTTGC-3‘ / 5' CCGG ACGTGATATCCCGAGGGCAT-3')와 Agrobacterium 오염을확인호]■기 위한 VirC2 유전자 (5 '-TTTTGCTCCTTCAAGGG AGGTGCC-3' / 5, -GGCTTCGCCAACCAATTTGGAGAT-3, ) 또한 activation tagging line의 확인을 위한 35S enhancer 절편 (5'-GATCCCCAACATGGTGGAGCACGA-3' / 5'-TAGATATCA CATCAATCCACTTGC3)과 NPTII 유전자 부분 (5, -GAGG CTATTCGGCTATGACTG -3, / 5, -ATCGGGAGCGGCGATA CCGTA3)을 각각 이용하였다.
- 시기별로 3, 5, 10, 15, 30일 후에 발아된 접합자 배를 부위별 (엽병, 자엽) 및 4년근 식물체의 잎과 줄기를 모상근 유도재료로 이용하였다. YEB 3 mL에 2일간 현탁 배양한 4 rhizogenes 배양액 (R1000, A4, CIP104786) 을 원심분리 후 1/25 비율로 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2농도의 MS 액체배지로 희석하여 공동배양을 위한 배지를 조성하고, 약 30분간 인삼 조직을 침지 후 동일한 고체 배지에서 2일간 공동 배양하였다. 공동배양 된 조직은 800 mg/L cefotaxime이 첨가된 1/2MS 액체배지로 세척 후 3주일 간격으로 400 mg/L cefi)taxime이 첨가된 1/2MS 선택배지와 activation tagging vector를 포함하는 처리 구에서는 100 mg/L kanamycin 과 400 mg/L cefotaxime을 첨가한 1/2MS 선택배지에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 공동배양 된 조직은 800 mg/L cefotaxime이 첨가된 1/2MS 액체배지로 세척 후 3주일 간격으로 400 mg/L cefi)taxime이 첨가된 1/2MS 선택배지와 activation tagging vector를 포함하는 처리 구에서는 100 mg/L kanamycin 과 400 mg/L cefotaxime을 첨가한 1/2MS 선택배지에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 각처리 후 1달 뒤 나온 절편당 모상근 수와 모상근의 총수를 조사하였다.
- 모상근의 생장률 조사는 고체 배지와 액체배지에서의 생 중량의 증가로 측정하였다. 고체 배지에서의 증식률 조사는 3차 분지 이상 잘 증식된 모상근을 종류별로, 생장조절제를 첨가하지 않은 1/2무기 염 농도의 SH 고체 배지에 약 0.2 g씩 각 3 반복 치상하여 4주 후에 증식된 생중량을 조사하였다. 액체배지에서의 증식률 조사는 약 2 g씩 각 3 반복 치상하여 10 mL의 1/2SH 배지가 담겨있는 250 mL 멸균 삼각플라스크에 넣고 100 rpm 25℃ 암상태에서 진탕 배양 후 2주와 4 주차에 멸균 거름종이에서 액체 배지를 제거 후 무게를 재었다.
- YEB 3 mL에 2일간 현탁 배양한 4 rhizogenes 배양액 (R1000, A4, CIP104786) 을 원심분리 후 1/25 비율로 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2농도의 MS 액체배지로 희석하여 공동배양을 위한 배지를 조성하고, 약 30분간 인삼 조직을 침지 후 동일한 고체 배지에서 2일간 공동 배양하였다. 공동배양 된 조직은 800 mg/L cefotaxime이 첨가된 1/2MS 액체배지로 세척 후 3주일 간격으로 400 mg/L cefi)taxime이 첨가된 1/2MS 선택배지와 activation tagging vector를 포함하는 처리 구에서는 100 mg/L kanamycin 과 400 mg/L cefotaxime을 첨가한 1/2MS 선택배지에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 각처리 후 1달 뒤 나온 절편당 모상근 수와 모상근의 총수를 조사하였다.
- 수행하였다. 모 상근은 새로 생성된 모상근의 정단부위를 2-3 mm 절취 후, genomic DNA/를 추출하여 분석 재료로 이용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation한 후, 94, 58, 72℃ 각 1분씩 25 cycle을 수행 후, 72℃ 에서 5분간 last extension 시켰다.
- 모상근 유도에 효율적인 조직을 선발하기 위해 자엽, 하 배축 잎 엽병 등을 이용하였다. 인삼 유식 물체는 개갑 인삼 종자를 1/2MS 배지에서 무균 발아시켜 이용하였고, 성체 인삼은 4년근 인삼의 잎과 엽병을 0.
- 모상근의 생장률 조사는 고체 배지와 액체배지에서의 생 중량의 증가로 측정하였다. 고체 배지에서의 증식률 조사는 3차 분지 이상 잘 증식된 모상근을 종류별로, 생장조절제를 첨가하지 않은 1/2무기 염 농도의 SH 고체 배지에 약 0.
- 수행하였다. 모상근의 최적 조건의 배지로 선발된 1/2SH 배지를 이용하여 A. rhizogenes R1000을 형질전환 시킨 각각의 모상근들의 형태 및 생장률을 조사하였다. Figure 3 에서 나타낸 바와 같이 각각의 모상근의 색과 형태가 매우 다양하게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 1 mg/L)를 첨가하여 초기 분지도를 조사하였다. 배양조직에서 유도된 A. rhizogenes R1000에 pKHl벡터로 형질전환 시킨 activation tagging 된 각각 모상근을 1-1.5 cm로 절취하여 각 배지에 20- 30개를 치상 후, 4주 경과 후 분지된 뿌리 수를 조사하였다.
- R1000에 pKHl vector가 포함된 형질전환 모상근을 확인함과 아울러 Agrobaterium contamination을 초기에 확인한 결과 내부에 포함된 NPTII gene, rolB 유전자의 도입을 확인할 수 있었다 (Figure 6). 본 연구에서, A. rhizogens R1000 등을 이용한 activation tagging 된 모 상근은 초기 에는 kanamycin 이 첨가된 배지에서 모상근을 유도한 후에 kanamycine의 모 상근 발달에 있어서의 영향을 고려하여 계대 배양 시에는 kanamycin이 첨가되지 않은 배지에서 증식을 유도하였다. 따라서 일부 모상근 line에서는 enhancer element가 없을 수도 있다.
- 한편, 유전자의 기능을 활성화 시키는 방법 (gain-ofWinction)인 activation tagging 기술은 이러한 문제점을 극복할 수 있는 대안이 될 수 있으며, Agrobacterium rhizogenes를 이용한 모상근 생산 시스템은 대량의 돌연변이체를 안정적으로 용이하게 얻을 수 있다는 점에서 최적의 시스템이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 activation-tagging 된 효율적인 형질전환 모상근 생산에 있어서의 최적의 아그로박테리움 균주 및 인삼조직, 배지 조성 등에 대한 조건을 확립하였으며, 다양한 배지에서의 형질전환 모상근의 생장률 및 분지율, 표현형 등을 조사하였다. 엽병 절편을 activationtagging vector pKHOl을 가지고 있는 4 rhizogenes R1000 와 공동배양하였을 때 배양 4주 후 85.
- 4% 유한락스에 15분간 침지, 살균하여 이용하였다. 시기별로 3, 5, 10, 15, 30일 후에 발아된 접합자 배를 부위별 (엽병, 자엽) 및 4년근 식물체의 잎과 줄기를 모상근 유도재료로 이용하였다. YEB 3 mL에 2일간 현탁 배양한 4 rhizogenes 배양액 (R1000, A4, CIP104786) 을 원심분리 후 1/25 비율로 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2농도의 MS 액체배지로 희석하여 공동배양을 위한 배지를 조성하고, 약 30분간 인삼 조직을 침지 후 동일한 고체 배지에서 2일간 공동 배양하였다.
- 액체배지에서의 증식률 조사는 약 2 g씩 각 3 반복 치상하여 10 mL의 1/2SH 배지가 담겨있는 250 mL 멸균 삼각플라스크에 넣고 100 rpm 25℃ 암상태에서 진탕 배양 후 2주와 4 주차에 멸균 거름종이에서 액체 배지를 제거 후 무게를 재었다. 액체 배지는 매 2주마다 새로운 배지로 교환하였다.
- 2 g씩 각 3 반복 치상하여 4주 후에 증식된 생중량을 조사하였다. 액체배지에서의 증식률 조사는 약 2 g씩 각 3 반복 치상하여 10 mL의 1/2SH 배지가 담겨있는 250 mL 멸균 삼각플라스크에 넣고 100 rpm 25℃ 암상태에서 진탕 배양 후 2주와 4 주차에 멸균 거름종이에서 액체 배지를 제거 후 무게를 재었다. 액체 배지는 매 2주마다 새로운 배지로 교환하였다.
- PCR primer는 5'-TCTAGAACTAGTGGATCCCCAACATG-3', 5'-CTGCAGAA TATATCCTGTCAAACACTG3를 이용하였다. 이후 증폭된 PCR 산물은 pCR2.1 TOPO cloning vectoi를 이용하여 클로닝 하였다 (Invitrogen, USA). pCAMBIA 2300 vector와 클로닝한 tetramer CaMV 35S enhancer부분을 BamWPstI site를 이용하여 변형된 pKHOl 벡터를 제조하였다 제조된 pKHOl는 A.
- 인삼 모상근의 증식을 유도하기 위해서 고체배양과 액체배양을 수행하였다. 모상근의 최적 조건의 배지로 선발된 1/2SH 배지를 이용하여 A.
- 형성된 모상근의 형질전환 여부를 확인하고자 PCR 분석을 수행하였다. 모 상근은 새로 생성된 모상근의 정단부위를 2-3 mm 절취 후, genomic DNA/를 추출하여 분석 재료로 이용하였다.
- 효율적인 모상근 초기 증식 배지를 선발하기 위해 1/2 농도의 MS, SH (Schenk and Hildebrandt 1972), White (1943) 배지와 각 배지에 IBA (indole-3- butyric acid) (0.1 mg/L)를 첨가하여 초기 분지도를 조사하였다. 배양조직에서 유도된 A.
- 효율적인 모상근 초기 증식 배지를 선발하기 위해 1/2 농도의 MS, SH, White (1943) 배지와 IBA 0.1 mg/L를 이용하여 초기 분지도를 조사하였다 (Table 3). 조사 배지 중 l/2White 배지의 분지율이 3.
대상 데이터
- Agrobacterium rhizogenes는 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC로부터 분양받은 R1000, A4, CIP104786을 이용하여 모상근을 유도하였다. A.
- 1 TOPO cloning vectoi를 이용하여 클로닝 하였다 (Invitrogen, USA). pCAMBIA 2300 vector와 클로닝한 tetramer CaMV 35S enhancer부분을 BamWPstI site를 이용하여 변형된 pKHOl 벡터를 제조하였다 제조된 pKHOl는 A. rhizogenes R1000에 형질 전환하여 사용하였다.
- 본 연구를 위한 재료로는 인삼 (Panax ginseng) 품종 천풍 (KG101)을 사용하였다. 천풍은 한국인삼연초연구원이 품종화한 open pollinated type으로 매우 균일한 생육특성과 많은뇌두를 내는 대형 종이다.
- 4% 상용락스 용액에 침지 후 멸균증류수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 1/2MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 발아를 유도하여 재료로 이용하였다.
- 잎 엽병 등을 이용하였다. 인삼 유식 물체는 개갑 인삼 종자를 1/2MS 배지에서 무균 발아시켜 이용하였고, 성체 인삼은 4년근 인삼의 잎과 엽병을 0.4% 유한락스에 15분간 침지, 살균하여 이용하였다. 시기별로 3, 5, 10, 15, 30일 후에 발아된 접합자 배를 부위별 (엽병, 자엽) 및 4년근 식물체의 잎과 줄기를 모상근 유도재료로 이용하였다.
성능/효과
- A. R1000에 pKHl vector가 포함된 형질전환 모상근을 확인함과 아울러 Agrobaterium contamination을 초기에 확인한 결과 내부에 포함된 NPTII gene, rolB 유전자의 도입을 확인할 수 있었다 (Figure 6). 본 연구에서, A.
- 이는 사용한 cefotaxim외의 다른 항생제를 함께 사용하는 방법 등을 향후 고려해 볼 수 있을 것이다. A. rhizogenes R4000에 pKHl vector가 포함된 경우 60.0% 의 모상근 유도율을 보여, wild type의 A. rhizogenes R1000에 비해 모상근 발생 효율이 약간 감소하는 것으로 나타났다. 이는 상대적으로 선발 배지에 추가로 첨가된 kanamycine의농도가 모상근 발육 및 증식에 영향을 미친 것으로 사료되며, 圧한 모든 4 rhizogenes 균주의 종류와 관계없이 엽병의 모 상근 유도가 자엽보다 우수함을 재차 확인하였다.
- 또한, 1/2SH 고체 배지에 치상 후 약 30일 경과하였을 때 증식률을 조사한 결과 2-8배까지 생체량이 증가하였다 (Figure 4). 가장 생장률이 높은 모상근 linee 31번으로, 분지율과 뿌리털의 정도도 다른 line보다 우수하였다. 가장 생장률이 저조한 23번은 표현형에서도 섬유상의 모양을 하며 분지 정도도 저조하여 전체적으로 낮은 증식을 나타내었다.
- 인삼 각 조직별 모상근 유도율을 조사한 결과는 Table 1에 나타낸 바와 같다. 각 모 상근은 A. 아lizogenes로 접종 후 모든 조직에서 모상근의 유도를 확인할 수 있었고, 대부분의 경우 2-4주 사이에 모 상근이 유도됨을 확인하였다. 인삼 종자의 엽병에서 68.
- 이는 자엽과 자엽절의 모 상근 유도율에 비해 상대적으로 높았다. 따라서 다량의 모 상근 생산에 엽병이 가장 효율적임을 확인하였다. 인삼종자 유래 잎의 경우도 역시 66.
- 이는 4 加zogmv가 tagging vector와 내부적으로 이미 가지고 있는 Ri-Plasmid를 동시에 가지고 있기 때문에 불안정 할 수 있기 때문이다. 따라서 본 실험에서는 독립적으로 증식된 1, 100개의 line 중 무작위로 재차 44개의 모상근 line을 선발하여 PCR을 통해 rolB 와 35S enhancer 절편의 존재 유무를 확인한 바 37 line (84.1%)에서 35S enhancer 절편이 존재함을 알 수 있었다. 나머지 7개 line에서는 rolB 유전자만을 확인할 수 있어서 초기 PCR 분석치인 88%와 유사함을 확인하였다 (데이터 미제시).
- 인삼의 최대 문제점인 초기 모상근의 대량 확보를 인삼 종자를 이용함으로써 보다 체계적인 모상근 생산 시스템을 구축할 수 있을 것이다. 또한 본 연구에서 자엽 및 엽병을 배지 면에 세워 놓는 것이 눕혀 놓는 것보다 모상근 생산에 효율적 이었다.
- rhizogenes과 기타 오염에 의한 생산율 저하를 제거 할 수 있어서 각각 독립적인 모상근의 계획 생산이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 또한 접합자 배의 엽병은 상대적으로 여러 절편의 확보가 수월하여 현재까지 주로 사용된 뿌리 절편의 모상근 유도에 비해 매우 효율적이라 사료된다. 인삼의 최대 문제점인 초기 모상근의 대량 확보를 인삼 종자를 이용함으로써 보다 체계적인 모상근 생산 시스템을 구축할 수 있을 것이다.
- 7%로 가장 많이 발생하였다. 또한 종자의 발아에 의해 상대적으로 조직이 커짐에 따라 발아 28일경의 인삼 엽병은 8-10개의 절편을 만들 수 있어, 모상근 유도의 재료 준비에 유리함이 확인되었다 (Table 1).
- 본 연구에서 안정적인 activation tagging 된 인삼 모 상근의 대량생산 시스템을 확립할 수 있었다. 이들 돌연변이체들은 metabolomics 의 도움으로 metabolic mutant의 종류별로 분류되고 genome에서 tag 된 부위를 찾아서 해당 유전자의 기능을 유추하는 fiinctional genomics의 수단으로 이용될 수 있을 것이다 .
- rhizogenes 오염에 의해 계대배양이 안된다고 하였다. 본 연구에서는 뿌리 절편을 이용한 모 상근 유도 시 A. rhizogenes과 기타 오염에 의한 생산율 저하를 제거 할 수 있어서 각각 독립적인 모상근의 계획 생산이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 또한 접합자 배의 엽병은 상대적으로 여러 절편의 확보가 수월하여 현재까지 주로 사용된 뿌리 절편의 모상근 유도에 비해 매우 효율적이라 사료된다.
- 선행의 실험에 의해 인삼 종자의 자엽과 엽병이 모상근 유도에 유리한 재료임을 확인한데 이어서 각각의 A. rhizogenes 균주의 종류에 의한 모상근 유도율 조사 결과, R1000 균주가 엽병을 사용시 85.9%로 가장 우수하였다. 또한 A4 strain에 의해서 엽병에서 65.
- rhizogenes R1000에 비해 모상근 발생 효율이 약간 감소하는 것으로 나타났다. 이는 상대적으로 선발 배지에 추가로 첨가된 kanamycine의농도가 모상근 발육 및 증식에 영향을 미친 것으로 사료되며, 圧한 모든 4 rhizogenes 균주의 종류와 관계없이 엽병의 모 상근 유도가 자엽보다 우수함을 재차 확인하였다.
- 아lizogenes로 접종 후 모든 조직에서 모상근의 유도를 확인할 수 있었고, 대부분의 경우 2-4주 사이에 모 상근이 유도됨을 확인하였다. 인삼 종자의 엽병에서 68.8%의 모상근 유도가 확인되었으며, 또한 각 절편별 모상근 유도율 역시 평균 3.5개로 가장 많은 모 상근을 생산함을 확인하였다. 이는 자엽과 자엽절의 모 상근 유도율에 비해 상대적으로 높았다.
- 있음을 확인하였다. 즉, 고체 배지에서 증식률이 저조한 25번 line의 경우 액체배양에서는 한 달 뒤 가장 증식률이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 2주 차의 생장률에 비하여 4주차에는 각각의 생장 정도가 상이함을 확인할 수 있었다 (Figure 5).
- 한편, 고체 배지의 증식률과 액체배지의 증식률은 서로 차이가 있음을 확인하였다. 즉, 고체 배지에서 증식률이 저조한 25번 line의 경우 액체배양에서는 한 달 뒤 가장 증식률이 우수함을 확인할 수 있었다.
- 효율적인 모상근 유도를 위하여 4 rhizogenes R1000, A4, CIP104786균주에 의한 인삼 종자의 발달 시기별 모 상근의 유도율을 조사한 결과, 인삼 접합자 배 발아 유도 후 14일과 28일에서 자엽과 엽병 모두 우수한 모상근 유도를 보였다. 유도된 모상근은 고체 및 액체배지에서 각각 성공적으로 증식 할 수 있었다.
후속연구
- 일반적으로 인삼 모상근의 액체 배지에서의 적응 기간은 약 2주 정도이며 4주 이후 본격적인 증식이 시작된다. 앞으로 보다 정밀한 증식률 조사를 통하여 배지의 소비 정도와 생장과의 상관관계를 밝힘으로써 선발 모상근의 액체배양 최적조건의 확립이 필요할 것이다.
- 다만 CIP15834의 경우 오염에 의해 정량적인 데이터를 수집하는데 어려움이 있었다. 이는 사용한 cefotaxim외의 다른 항생제를 함께 사용하는 방법 등을 향후 고려해 볼 수 있을 것이다. A.
- 시스템을 확립할 수 있었다. 이들 돌연변이체들은 metabolomics 의 도움으로 metabolic mutant의 종류별로 분류되고 genome에서 tag 된 부위를 찾아서 해당 유전자의 기능을 유추하는 fiinctional genomics의 수단으로 이용될 수 있을 것이다 .
- 또한 접합자 배의 엽병은 상대적으로 여러 절편의 확보가 수월하여 현재까지 주로 사용된 뿌리 절편의 모상근 유도에 비해 매우 효율적이라 사료된다. 인삼의 최대 문제점인 초기 모상근의 대량 확보를 인삼 종자를 이용함으로써 보다 체계적인 모상근 생산 시스템을 구축할 수 있을 것이다. 또한 본 연구에서 자엽 및 엽병을 배지 면에 세워 놓는 것이 눕혀 놓는 것보다 모상근 생산에 효율적 이었다.
- 6의 분지도를 보여주었다. 최종적으로 1, 989개체의 독립적인 형질전환 모상근 line을 생산하였으며, 이들 모상근 linee 인삼 진세노사이드 생합성 관련 유전자의 발굴 및 기능해석에 유용하게 쓰일 것이다.
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