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문제 정의
- 형성방향을 검토하였다. 아울러 소괴경 형성과정에서의 세포조직을 관찰하고 체내 ADP-glucose pyrophosphorylase의 활성을 조사하여 기내배양을 위한 기초자료로 활용될 수 있도록 하였다.
제안 방법
- MS기본배지에서 2주간 기내배양한 감자의 유식 물체로부터 액아부위가 포함되게 3-4 mm의 길이의 마디조직을 채취한 절간조직을 S8배지 및 S8C5OO배지에 옮겨 0, 8, 16시간 일장 조건으로 배양하였다. 이때 배양온도는 20 ℃ 로 하였으며, 암조건에서 28℃로 배양한 처리구도 설정하였고 일장 처리에서의 광도는 생육상에서 42-45 ㎛ol.
- 감자의 기내배양에서 포복경의 생장이 정지되고, 이 포복경의 선단부에서 괴경이 형성될 때 환경요인과 내생 생장조절물질이 영향을 미치는 것으로 우량한 소괴경의 생산을 체계화하기 위해서 괴경의 형성에 요구되는 일장과 온도 등의 환경 조건과, sucrose의 농도 CCC 등의 다양한 배양환경에서 기내 소 괴경 형성방향을 검토하였다. 아울러 소괴경 형성과정에서의 세포조직을 관찰하고 체내 ADP-glucose pyrophosphorylase의 활성을 조사하여 기내배양을 위한 기초자료로 활용될 수 있도록 하였다.
- Superior) 유식물체를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서 25℃ 및 16시간의 장일조건으로 절간배양을 하여 실험재료로 이용하였다. 기내 배양식물체는 지속적인 재료의 공급을 위하여 2주 간격으로 절간 계대배양을 하였다. 재료를 유지하기 위한 계대배양 기간 중에는 괴경의 형성이 보이지 않았으며 실험의 도입 시에 생육상의 차이를 고려하여 정단부위는 사용하지 않았다
- 절간의 잎을 제거한 후 3%와 8% sucrose가 첨가된 MS배지에 치상하여 20℃ 및 28℃ 로 80일간 배양하였다. 또한 CCC의 효과를 보기 위해 MS 기본배지에서 8%의 sucrose를 첨가한 S8배지와, 8% sucrose 및 생장억제물질 CCC를 500 mg/L 첨가한 S8C500배지에 절간마디조직을 옮겨 80일 동안 배양하였다. 일장조건은 생육상에서 42-45 umolFff 의 조명으로 하였고, 0, 8, 12, 16시간 배양 후 소괴경의 형성과 생체 구중을 조사하였다.
- hematoxylin method로 (佐野 1972) 하였다. 수세가 끝난 재료를 2.5% iron alum으로 3시간 촉매처리한 다음 0.5% hematoxylin으로 16시간 염색한 후 다시 2.5% iron alum 용액에 5-30분간 옮겨 분별시키고 흐르는 물로 1시간 세척한 다음 Canada balsam으로 밀봉한 후 검경하였다.
- 실험의 내용으로 sucrose의 농도 온도 일장 및 2-(chloroethyl) trimethylammonium chloride (CCC)의 처리가 기내소괴경 형성에 미치는 영항과 괴경 형성과정에서의 세포조직을 관찰하였으며, 이 과정에서 체내 ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase)의 활성을 조사하였다.
- 02% TritonXIOO, 1% BSA)를 첨가 후 4℃ 로 5분간 원심분리 (15,000 X g)를 하였다. 원심분리 후 상징액 (crude extract)을 효소의 활성을 측정하는데 사용하였다.
- 유발로 미세하게 분쇄한 후 -180℃ 에 보관하였다. 이 중 1 g의 시료를 채취하여 시료 무게의 4배가 되도록 extraction buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7, 10 mM MgCl2, 1 mM Na2-EDTA, 2.6 μM DTT, 0.02% TritonXIOO, 1% BSA)를 첨가 후 4℃ 로 5분간 원심분리 (15,000 X g)를 하였다. 원심분리 후 상징액 (crude extract)을 효소의 활성을 측정하는데 사용하였다.
- 또한 CCC의 효과를 보기 위해 MS 기본배지에서 8%의 sucrose를 첨가한 S8배지와, 8% sucrose 및 생장억제물질 CCC를 500 mg/L 첨가한 S8C500배지에 절간마디조직을 옮겨 80일 동안 배양하였다. 일장조건은 생육상에서 42-45 umolFff 의 조명으로 하였고, 0, 8, 12, 16시간 배양 후 소괴경의 형성과 생체 구중을 조사하였다.
- ㎡로 하였다. 절간을 이식하여 9일간 배양한 후 액아로부터 괴경의 분화 및 생장의 외형적인 생육상태와 내부 세포조직의 신장 및 비대 상태를 조사하였다.
- 절간의 잎을 제거한 후 3%와 8% sucrose가 첨가된 MS배지에 치상하여 20℃ 및 28℃ 로 80일간 배양하였다. 또한 CCC의 효과를 보기 위해 MS 기본배지에서 8%의 sucrose를 첨가한 S8배지와, 8% sucrose 및 생장억제물질 CCC를 500 mg/L 첨가한 S8C500배지에 절간마디조직을 옮겨 80일 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 경정배양을 통하여 얻어진 감자 (Solanum tuberosum L. cv. Superior) 유식물체를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서 25℃ 및 16시간의 장일조건으로 절간배양을 하여 실험재료로 이용하였다. 기내 배양식물체는 지속적인 재료의 공급을 위하여 2주 간격으로 절간 계대배양을 하였다.
- 실험재료로 감자 기내 유식물체의 줄기를 이용하여 마디 1개가 포함된 절간을 평균 1 cm의 길이로 채취하였다. 절간의 잎을 제거한 후 3%와 8% sucrose가 첨가된 MS배지에 치상하여 20℃ 및 28℃ 로 80일간 배양하였다.
이론/모형
- Mounting재료 paraffin을 제거하고, 염색 (stain)은 Heidenhain iron hematoxylin method로 (佐野 1972) 하였다. 수세가 끝난 재료를 2.
- 감자 줄기의 마디조직을 1 cm 간격으로 절단하여 괴경 형성 조건인 20℃ 에서 S8배지와 S8C500배지에 옮겨 0, 8, 16시간 일장으로 15일간 배양한 12개의 배양재료를 채취하여 Thevenot 등 (2005)의 방법에 따라 AGPase의 activity를 조사하였다.
- 일정기간 배양한 재료를 잘 수세한 다음 Xu등(1998b)의 방법에 따라 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2)에 용해한 2.5% glutaraldehyde+2.5% PFA (paraformaldehyde)용액으로 2시간 동안 고정 (fixation)하였다. 고정한 재료를 buffer용액으로 15 분씩 4회에 걸쳐 세척한다음 다시 증류수로 15분씩 2회 세척한 후30% EtOH, 2시간; 50% EtOH, 5시간; 70% EtOH, 12시간 85% EtOH, 1시간; 80% EtOH (65)+BtOH (35), 1시간; 90% EtOH (45)+BtOH (55), 1시간; 100% EtOH (25)+BtOH (75), 1시간 BtOH, 1시간; BtOH, 1시간의 순서로 탈수(dehydration) 과정을 거친 후 paraffin block을 만들어 15 |_im의 두께로 절편하였다.
성능/효과
- 본 실험의 감자의 절간배양에서 sucrose의 농도와 CCC 처리에 따른 AGPase의 활성을 분석한 결과는 Figure 5와 같았다. 24 시간 암조건배양에서 sucrose의 농도가 8%일 때 다른 일장 처리에 비해 AGPase의 활성이 다른 일장처리에 비해 3배 이상 높았으며 여기에 CCC를 첨가하면 활성이 더욱 높게 나타났다. 그러나 sucrose의 농도가 3%일 때에는 AGPase의 활성이 거의 나타나지 았았지만 이 경우에도 CCC를 첨가하였을 때에는 sucrose 8%처리구와 같은 수준의 활성을 보여 CCC가 AGPase의 활성에 촉진효과를 보이는 것을 알 수 있었다.
- 28℃의 비교적 고온조건에서도 24시간 암처리로 감자의 절간을 배양하였을 경우 S8배지에서 뚜렷하지는 않았지만 세포의 약간의 비대와 신장을 확인할 수 있었고, S8C500배지에서는 기부부위에서 뚜렷한 괴경의 형성과 비대 현상을 확인할 수 있어 고온에서도 단일과 CCC의 복합처 리에 의한 괴경의 형성유도 효과가 확인되었다. 감자의 식물체에 CCC 를 처리하였을 때 sucrose의 분해과정에서 sucrose synthase 의 활성이 모든 조직내에서의 acid invertase 활성에 비해 몇 배 높게 나타나고, alkaline invertase의 활성은 미미하였다는 보고도 있다.
- 반면에 S8배지의 암처리에서는 정단부위가 짧은 괴경이 형성됨을 볼 수 있었다. 8, 16시간 일장 처리에서도 비슷한 양상으로 기부부위는 부풀고 정단 부위는 약간 신장하는 형태의 괴경이 형성됨을 볼 수 있었다. 그러나 S8C500배지의 암처리에서는 S8배지에서보다 더 양호한 상태의 괴경이 형성됨을 볼 수 있었고 8, 16시간 일장에서도 일장 간의 차이는 크지 않았으나 S8배지에서보다 정단부위가 짧고 양호한 괴경이 수 있었다 (Figure 1).
- 2000). MS배지에서 절간을 15 일간 20℃로 배양하였을 때 이미 외형적으로도 괴경의 형성된 모습이 빠르게 출현하고 있었으며, 3% sucrose를 첨가한 배지에서는 일장간의 차이가 두드러지 게 보여 암처리 에 비해 일장이 길어질수록 초장이 짧아짐을 볼 수 있었다. 이것은 단일에 의한 도장현상으로 보여진다.
- Sucrose, 온도처리에 의한 80일 동안 배양한 결과 20℃의 온도에서는 S8배지의 경우 모든 일장처리구에서 소괴경이형성되었으며 , 3% sucrose 첨가구에서도 괴경은 형성되었으나 S8배지와 비교할 때 비대효과에 크게 차이가 보였다 (Table 1). 기내에서의 감자 소괴경의 형성은 sucrose의 농도에 따라 크게 영향을 받으며 (Xu et al.
- 특히 포복경의 기부 신장이 보이지 않고 괴경이 형성되는 이른바 'sessile tuber' (Van den Berg 1996)가 형성되는 것을 알 수 있었다. 그러나 20℃의 저온조건에서도 16시간의 장일은 괴경의 형성을 유도하는데 억제적 효과를 보였으며 괴경형성에 뚜렷한 촉진 효과를 보였던 CCC와 같은 조절물질의 처리에서도 괴경의 형성은 억제되는 경향을 보였다.
- 그러나 온도와 sucrose의 농도, 일장과 sucrose의 농도는 괴경의 형성수에 유의성이 인정되지 않았지만, 괴경의 직경과 괴경중에 있어서는 고도의 유의성이 인정되었다. 따라서 온도, 일장, sucrose 농도간의 상관관계는 구경과 구중에 있어서 고도의 유의성이 인정되었다 (Table 1).
- 수 있었다. 반면 S8C500배지에서는 일장이 길어짐에 따라 분열된 세포의 생장이 신장생장보다 비후생장으로 진행됨을 확인할 수 있었다. 28℃ 암처리의 경우에도 S8 배지에서는 세포의 생장이 신장생장의 방향으로 발달되는 것이 뚜렷하게 보여지며 S8C500배지에서는 20℃ 에서와 마찬가지로 세포의 뚜렷한 비후생장이 확인되었다.
후속연구
- Vreugdenhil 등 (1998)도 괴경의 형성유도 단계에서의 AGPase는 높으나 포복경에는 보이지 않고 괴경에만 한정된다고 하였다. 그러나 본 연구에서 AGPase의 양이 암조건에서 특히 높았다는데 주목할 필요가 있으며, 아울러 Vreugdenhil와 Sergeeva (1999)가 감자의 괴경형성의 개시점에서의 형태적 변화는 GA에 의해 영향을 받는다고 하였듯이 내생 GA의 합성과 이의 활성과의 관계 등 다른 내생의 조절물질 등과의 관계에 관하여도 검토할 필요가 있다.
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