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문제 정의
- 한편, 배지교환식은 연속식이라고도 하며 신선한 배지를 일정한 속도로 공급하고, 같은 부피의 배양액을 배출시켜 배양액의 부피를 항상 일정하게 유지하는 방식으로 새로운 배지의 지속적인 공급에 의한 배양기간의 연장과 생장저해물질을 효율적으로 제거할 수 있는 장점이 있다(Su and Humphrey, 1991). 이에 본 연구는 조직배양법을 이용하여 인공씨마로 이용 가능한 기내 소괴경을 대량 증식하는 체계를 마련하고자 수행하였으며, 둥근마의 기내 배양을 위한 배양온도와 일장의 전환 및 배지의 교체 효과에 대한 실험결과를 보고한다.
제안 방법
- 그러나 식물의 생체중은 두 일장 처리 간에 유의성이 없는 것으로 나타났다. Table 1의 결과에 근거하여 배양체를 초기 6주 동안은 25℃, 24시간의 광조건에서 배양한 후, 그 다음 6주 동안은 온도 15 또는 25℃에 광조건을 0, 8, 24시간으로 달리하여 배양하였고, 액아수, 생체중 및 소괴경의 수와 무게를 조사하였다(Table 2). 먼저 배양온도 15℃와 25℃를 비교해 보면, 동일한 일장 조건끼리 비교하였을 때 모든 조사항목에서 15℃처리보다 25℃처리가 우수한 것으로 나타나 배양후기의 저온처리가 소괴경의 형성을 유도하거나 식물체의 생장을 촉진하는 효과는 없는 것으로 나타났다.
- 한편, 배지의 적정 교체시기를 조사하기 위하여, 12주간의 배양기간 중 접종 후 2주째부터 매 2주 간격으로 동일성분의 배지로 교체하였다. 교체할 배지의 성분에 따른 배양 효율을 알아보기 위하여 접종 후 6주 배양시점에 sucrose 30 또는 60 g․L-1, BA 0 또는 0.1 mg․L-1를 단독 혹은 혼합 첨가한 배지로 교체하여 6주간 배양하여 배양효율을 비교하였다. 모든 배양은 3반복 이상으로 실시하였으며, 배양체의 생체중과 마디수, 소괴경의 형성수와 무게를 측정하였고, 실험결과의 통계는 Duncan의 다중검정법으로 분석하였다.
- 둥근마 기내 소괴경을 생산하기 위하여 250ml 삼각플라스크에서 12주간 배양을 하는데, 그 기간 중 소괴경의 비대가 활발해지는 시기인 배양 후 6주째에 새로운 배지로 교체하여 둥근마 액체배양에서 배지의 교체 효과를 조사하였다(Fig. 1). 배양 후 6주째에 배지를 교체하고 2주 후인 배양 8주부터는 소괴경의 수와 무게가 급격히 증가하였다.
- 둥근마 기내배양을 위한 일장효과에 대한 실험은 우선, 접종 후 6주간은 소괴경형성과 비대에 기반이 되는 배양체의 증식을 조사하고, 이후 6주간 여러 가지 온도와 일장조건에서 소괴경의 형성과 비대에 미치는 영향을 조사하였다. 초기 6주간은 25℃에서 24 또는 16시간 광주기의 효과를 검토하고, 이후 6주간은 25℃에서 24시간 광조건하에서 6주간 배양한 배양체를 배양온도를 15 또는 25℃에 일장 0, 8, 24 시간으로 전환하여 배양하였다.
- 본 연구에서 기내배양을 통한 둥근마 소괴경의 생산으로 기 연구에서의 생산 기간과 생산효율을 증대시키는 효과를 얻었다. 둥근마 기내배양의 배지공급 방식을 배지교환식 방법으로 적용하여 씨마로 실용가능한 기내소괴경의 생산을 할 수 있었으며, 종우생산을 위한 인공씨마의 효율적인 생산단계에 도입하였다. 배양체의 생산규모 확대와 생산된 인공씨마의 발아와 생장에 대한 연구가 뒷받침된다면 인공씨마를 활용한 종우 대량생산의 실용화가 완성될 것이다.
- 둥근마 액체배양에서 소괴경의 생산을 위하여 배양온도와 일장의 전환과 배양 배지의 교체 효과를 조사하였다. 둥근마 액체배양에서 식물체의 증식을 위한 일장시간은 6주의 배양기간 동안 25℃에서 16시간보다는 24시간이 효과적이었다.
- 마디 절편체 배양 후 6주째에 sucrose 30 또는 60 g·L-1, BA 0 또는 0.1 mg·L-1 이 혼합 또는 단독 함유된 배지로 교체한 처리와 배지를 교체하지 않은 대조구를 함께 비교하였다.
- 배양과정 중에 배지의 교체 효과를 알아보기 위하여, 초기 접종한 배지로 12주간 연속 배양한 대조구와 12주의 배양 기간 중에 배양 6주 후 같은 성분의 배지를 동량으로 교체하여 배양한 것을 비교하였다. 한편, 배지의 적정 교체시기를 조사하기 위하여, 12주간의 배양기간 중 접종 후 2주째부터 매 2주 간격으로 동일성분의 배지로 교체하였다.
- 배양조건은 분당 110 회의 속도로 진탕 배양하면서, 25 ± 1℃가 유지되는 항온실에 24시간의 광을 조사하였다.
- 기내소괴경의 생산을 위하여 배양기간을 12주로 연장하여 배양하였으며, 배지교체의 효과를 검토하기 위하여, 배양 중기인 배양 후 6주째에 새로운 배지로 교체하였더니, 배지를 교체하지 않은 것보다 소괴경의 형성수가 평균 5개씩 더 많았고, 소괴경무게도 70% 이상 증가하였다. 배양환경의 전환이 소괴경 형성에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 12주의 배양기간 중에 식물체 생장이 활발한 초기 6주간은 25℃에서 24시간의 일장환경에서 배양하고, 이후 6주간의 배양온도와 일장시간을 전환하였다. 배양온도는 25℃가 15℃보다 효과적이었고, 25℃에서 일장시간은 24시간이 암처리 또는 8시간 일장처리보다 효과가 있었다.
- 앞의 실험에서 둥근마의 기내 배양중 배지의 교체효과가 인정되었으므로, 교체할 배지의 성분을 다양하게 하여 그 효과를 조사하였다(Table 3). 마디 절편체 배양 후 6주째에 sucrose 30 또는 60 g·L-1, BA 0 또는 0.
- 이상과 같이 둥근마 소괴경 생산에 있어 배지의 교체처리가 효과적이었던 결과를 토대로, 배양 후 2, 4, 6, 8, 10주째에 같은 성분의 배지로 교체하여 교체시기에 대한 효과를 조사하였다(Fig. 2, 3). 생체중은 배지를 교체하지 않은 대조구에 비해서 배양 2, 4, 6, 8주 째에 배지를 교체한 처리에서 더 무거웠으나, 배양 10주째 배지를 교체한 처리는 오히려 대조구보다 감소하였다.
- 둥근마 기내배양을 위한 일장효과에 대한 실험은 우선, 접종 후 6주간은 소괴경형성과 비대에 기반이 되는 배양체의 증식을 조사하고, 이후 6주간 여러 가지 온도와 일장조건에서 소괴경의 형성과 비대에 미치는 영향을 조사하였다. 초기 6주간은 25℃에서 24 또는 16시간 광주기의 효과를 검토하고, 이후 6주간은 25℃에서 24시간 광조건하에서 6주간 배양한 배양체를 배양온도를 15 또는 25℃에 일장 0, 8, 24 시간으로 전환하여 배양하였다.
- 배양과정 중에 배지의 교체 효과를 알아보기 위하여, 초기 접종한 배지로 12주간 연속 배양한 대조구와 12주의 배양 기간 중에 배양 6주 후 같은 성분의 배지를 동량으로 교체하여 배양한 것을 비교하였다. 한편, 배지의 적정 교체시기를 조사하기 위하여, 12주간의 배양기간 중 접종 후 2주째부터 매 2주 간격으로 동일성분의 배지로 교체하였다. 교체할 배지의 성분에 따른 배양 효율을 알아보기 위하여 접종 후 6주 배양시점에 sucrose 30 또는 60 g․L-1, BA 0 또는 0.
대상 데이터
- 실험에 사용된 둥근마 무병 식물체는 경상북도 농업기술원 생물자원연구소에서 분양받은 것으로 초저온 동결법으로 보존된 무병식물체를 증식한 것이었다. 둥근마 무병식물체의 유지를 위한 배지는 30 g·L-1 sucrose 가 첨가된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지를 pH 5.
데이터처리
- 1 mg․L-1를 단독 혹은 혼합 첨가한 배지로 교체하여 6주간 배양하여 배양효율을 비교하였다. 모든 배양은 3반복 이상으로 실시하였으며, 배양체의 생체중과 마디수, 소괴경의 형성수와 무게를 측정하였고, 실험결과의 통계는 Duncan의 다중검정법으로 분석하였다.
이론/모형
- 8로 조정하여 사용하였다. 둥근마 식물체의 기내증식을 위해 단마디배양 (single-node culture)법을 사용하였는데 한 개의 액아를 가진 마디 절편체를 채취하여 5개씩, 250 mL 삼각플라스크에 30 mL의 배지를 넣어 치상하였다. 배양조건은 분당 110 회의 속도로 진탕 배양하면서, 25 ± 1℃가 유지되는 항온실에 24시간의 광을 조사하였다.
성능/효과
- 12주간의 배양기간 중 배양 후 6주째에 교체할 배지의 성분은 sucrose 30, 60 g·L-1 또는 sucrose 60 g + BA 0.1 mg·L-1함유 배지 중에서 sucrose 60 g·L-1이 함유된 배지로 교체하였을 때, 소괴경의 총무게가 가장 무거워 소괴경의 비대에 가장 효과적이었다.
- 배양온도는 25℃가 15℃보다 효과적이었고, 25℃에서 일장시간은 24시간이 암처리 또는 8시간 일장처리보다 효과가 있었다. 12주간의 배양기간중에 배지 교체의 적절한 시기는 배양후 2, 4, 6, 8, 10주째 또는 배지 무교체 처리구중에서, 생체중, 마디수, 소괴경수에서는 2주 또는 6주째에 교체하는 것이 좋았고, 소괴경중은 8주째 교체 처리구에서 가장 무거웠으나 소괴경의 수와 무게를 모두 고려하였을 때, 초기 배양 후 6주째에 배지 교체하는 것이 가장 효율적이었다. 12주간의 배양기간 중 배양 후 6주째에 교체할 배지의 성분은 sucrose 30, 60 g·L-1 또는 sucrose 60 g + BA 0.
- 둥근마 액체배양에서 식물체의 증식을 위한 일장시간은 6주의 배양기간 동안 25℃에서 16시간보다는 24시간이 효과적이었다. 기내소괴경의 생산을 위하여 배양기간을 12주로 연장하여 배양하였으며, 배지교체의 효과를 검토하기 위하여, 배양 중기인 배양 후 6주째에 새로운 배지로 교체하였더니, 배지를 교체하지 않은 것보다 소괴경의 형성수가 평균 5개씩 더 많았고, 소괴경무게도 70% 이상 증가하였다. 배양환경의 전환이 소괴경 형성에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 12주의 배양기간 중에 식물체 생장이 활발한 초기 6주간은 25℃에서 24시간의 일장환경에서 배양하고, 이후 6주간의 배양온도와 일장시간을 전환하였다.
- 둥근마 액체배양에서 소괴경의 생산을 위하여 배양온도와 일장의 전환과 배양 배지의 교체 효과를 조사하였다. 둥근마 액체배양에서 식물체의 증식을 위한 일장시간은 6주의 배양기간 동안 25℃에서 16시간보다는 24시간이 효과적이었다. 기내소괴경의 생산을 위하여 배양기간을 12주로 연장하여 배양하였으며, 배지교체의 효과를 검토하기 위하여, 배양 중기인 배양 후 6주째에 새로운 배지로 교체하였더니, 배지를 교체하지 않은 것보다 소괴경의 형성수가 평균 5개씩 더 많았고, 소괴경무게도 70% 이상 증가하였다.
- 1에서와 같이 둥근마 기내 배양시 세포의 생장곡선에서 대수기의 중반부인 4～6 주에 배지를 교체하였을 때 소괴경의 형성수와 무게에 효과적이었으며, 대수기 후반이며 감속기의 초반인 8주째에 배지를 교체하였을 때는 소괴경수에 비해 소괴경중이 무거웠다. 따라서 생체중과 마디수 및 소괴경 형성수와 무게를 모두 고려하였을 때, 배지교체의 적절한 시기는 배양 중기인 초기배양 후 6주째임을 알 수 있었다.
- 따라서, 둥근마의 액체배양시 25 ±1℃, 24시간 광조건으로, 마디접종 후 6주째에 sucrose 60 g·L-1를 함유한 배지로 교체하여 6주간 추가 배양하는 방법이 기내 식물체와 소괴경의 생장과 형성에 가장 효과적이었다.
- Table 1의 결과에 근거하여 배양체를 초기 6주 동안은 25℃, 24시간의 광조건에서 배양한 후, 그 다음 6주 동안은 온도 15 또는 25℃에 광조건을 0, 8, 24시간으로 달리하여 배양하였고, 액아수, 생체중 및 소괴경의 수와 무게를 조사하였다(Table 2). 먼저 배양온도 15℃와 25℃를 비교해 보면, 동일한 일장 조건끼리 비교하였을 때 모든 조사항목에서 15℃처리보다 25℃처리가 우수한 것으로 나타나 배양후기의 저온처리가 소괴경의 형성을 유도하거나 식물체의 생장을 촉진하는 효과는 없는 것으로 나타났다. 한편 일장을 0, 8 및 24시간으로 처리한 효과를 비교해 보면, 액아의 수는 일장의 길이에 관계없이 처리 간에 유의성이 없고, 생체중은 온도 15℃ 처리에서는 일장 시간 간에 차이가 없으나 25℃를 처리한 것에서는 일장 8시간 또는 24시간의 처리가 광을 전혀 처리하지 않은 0시간보다 효과적이었다.
- 배양환경의 전환이 소괴경 형성에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 12주의 배양기간 중에 식물체 생장이 활발한 초기 6주간은 25℃에서 24시간의 일장환경에서 배양하고, 이후 6주간의 배양온도와 일장시간을 전환하였다. 배양온도는 25℃가 15℃보다 효과적이었고, 25℃에서 일장시간은 24시간이 암처리 또는 8시간 일장처리보다 효과가 있었다. 12주간의 배양기간중에 배지 교체의 적절한 시기는 배양후 2, 4, 6, 8, 10주째 또는 배지 무교체 처리구중에서, 생체중, 마디수, 소괴경수에서는 2주 또는 6주째에 교체하는 것이 좋았고, 소괴경중은 8주째 교체 처리구에서 가장 무거웠으나 소괴경의 수와 무게를 모두 고려하였을 때, 초기 배양 후 6주째에 배지 교체하는 것이 가장 효율적이었다.
- , 2008). 본 연구에서 6주째에 배지를 교체하는 것은 식물체에 새로운 영양소를 공급해주는 효과가 있을 뿐만 아니라 배지에 축적되어 있는 생장 억제 성분의 제거 등의 효과로 기내배양한 둥근마의 생장과 소괴경형성을 촉진하는 효과가 있었던 것으로 생각된다.
- 가 함유된 새로운 배지로 교체처리하였을 때 소괴경의 형성과 비대에 가장 효과적임을 알 수 있다. 본 연구에서 기내배양을 통한 둥근마 소괴경의 생산으로 기 연구에서의 생산 기간과 생산효율을 증대시키는 효과를 얻었다. 둥근마 기내배양의 배지공급 방식을 배지교환식 방법으로 적용하여 씨마로 실용가능한 기내소괴경의 생산을 할 수 있었으며, 종우생산을 위한 인공씨마의 효율적인 생산단계에 도입하였다.
- 2, 3). 생체중은 배지를 교체하지 않은 대조구에 비해서 배양 2, 4, 6, 8주 째에 배지를 교체한 처리에서 더 무거웠으나, 배양 10주째 배지를 교체한 처리는 오히려 대조구보다 감소하였다. 마디수에 있어서도 배양 10주째 교체한 처리를 제외한 배양 후 2, 4, 6, 8주에 배지 교체한 처리에서 더 많았는데, 특히 배양 2주에 교체한 처리에서 가장 많았다.
- 마디수에 있어서도 배양 10주째 교체한 처리를 제외한 배양 후 2, 4, 6, 8주에 배지 교체한 처리에서 더 많았는데, 특히 배양 2주에 교체한 처리에서 가장 많았다. 소괴경의 수에서도(Fig. 3), 생체중과 마디수의 결과와 같이 배양 10주에 배지교체한 처리구를 제외한 처리에서 대조구보다 많았는데, 그중에서 배양 6주에 교체한 처리의 소괴경 수가 가장 많았다. 반면, 소괴경의 무게에서는 다른 양상을 보이는데, 배지를 교체하지 않은 대조구에서 가장 낮았고, 배양 8주째 교체한 처리에서 가장 무거웠다.
- 소괴경의 무게 역시, 25℃에 24시간 일장 처리한 것에서 가장 양호하였다. 이 결과를 보면 배양체의 액아수와 식물의 생체중은 초기 6주간의 배양에서 거의 결정되며 후기에 처리한 온도나 일장에는 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났고, 기내소괴경의 형성은 후기의 광조건 중 24시간 일장 처리가 가장 효과적임을 알 수 있었다. 노지재배한 둥근마는 늦은 가을에 수확을 하는 특징이 있어 가을의 저온이나 단일조건이 괴경형성에 중요한 영향을 미치게 되지만(Yasunori and Yoshino, 1991), 본 실험의 기내 배양조건에서는 저온이나 단일조건보다 25℃에 24시간의 일장조건에서 우수한 결과를 보였다.
- 이상의 결과를 종합하여 보면, 둥근마 기내소괴경의 생산을 위한 배양환경으로 25℃, 24시간의 광조건에서, 배양 중기인 초기배양 6주째에 sucrose 60 g·L-1가 함유된 새로운 배지로 교체처리하였을 때 소괴경의 형성과 비대에 가장 효과적임을 알 수 있다.
- Table 1은 둥근마 단마디 절편체를 액체배양하면서 24시간과 16시간의 일장조건에 두었을 때 6주후에 액아의수, 생체중 및 소괴경의 수를 조사한 것이다. 일장 24시간과 16시간 처리에서 액아의 형성수를 보면 각각 38개와 23개로 24시간 처리가 16시간 처리에 비해 약 1.7배가 많았으며 괴경수도 각각 3.6개와 1.2개가 형성되어 24시간 처리가 3배 더 많았다. 그러나 식물의 생체중은 두 일장 처리 간에 유의성이 없는 것으로 나타났다.
- 하지만, 8주처리는 소괴경의 형성수가 작았던 처리였으며, 소괴경 형성수와 무게를 모두 고려하였을 때, 배양 6주째에 배지를 교체한 것이 가장 효과적이었다. 즉, Fig. 1에서와 같이 둥근마 기내 배양시 세포의 생장곡선에서 대수기의 중반부인 4～6 주에 배지를 교체하였을 때 소괴경의 형성수와 무게에 효과적이었으며, 대수기 후반이며 감속기의 초반인 8주째에 배지를 교체하였을 때는 소괴경수에 비해 소괴경중이 무거웠다. 따라서 생체중과 마디수 및 소괴경 형성수와 무게를 모두 고려하였을 때, 배지교체의 적절한 시기는 배양 중기인 초기배양 후 6주째임을 알 수 있었다.
- 배양 후 6주째에 배지를 교체하고 2주 후인 배양 8주부터는 소괴경의 수와 무게가 급격히 증가하였다. 특히 배지를 교체하지 않은 대조구에 비해 배양 8주부터 10주까지 소괴경의 수가 평균 5개 정도씩 많았는데 배양 11주에 증가폭이 더욱 커지며, 이 같은 반응은 소괴경의 무게에서도 비슷한 양상을 보여 11주에서 대조구와 비교하여 70%이상의 증가를 보였다. 일반적으로 회분식 배양은 처음 공급한 배지가 모두 소비될 때까지 계속 배양하는 것으로 지수기-대수생장기-감속기-정지기 순의 생장곡선을 나타낸다(Kim et al.
- 반면, 소괴경의 무게에서는 다른 양상을 보이는데, 배지를 교체하지 않은 대조구에서 가장 낮았고, 배양 8주째 교체한 처리에서 가장 무거웠다. 하지만, 8주처리는 소괴경의 형성수가 작았던 처리였으며, 소괴경 형성수와 무게를 모두 고려하였을 때, 배양 6주째에 배지를 교체한 것이 가장 효과적이었다. 즉, Fig.
- 먼저 배양온도 15℃와 25℃를 비교해 보면, 동일한 일장 조건끼리 비교하였을 때 모든 조사항목에서 15℃처리보다 25℃처리가 우수한 것으로 나타나 배양후기의 저온처리가 소괴경의 형성을 유도하거나 식물체의 생장을 촉진하는 효과는 없는 것으로 나타났다. 한편 일장을 0, 8 및 24시간으로 처리한 효과를 비교해 보면, 액아의 수는 일장의 길이에 관계없이 처리 간에 유의성이 없고, 생체중은 온도 15℃ 처리에서는 일장 시간 간에 차이가 없으나 25℃를 처리한 것에서는 일장 8시간 또는 24시간의 처리가 광을 전혀 처리하지 않은 0시간보다 효과적이었다. 형성된 소괴경의 수를 보면 25℃에 24시간의 일장 처리에서 31.
- 한편 일장을 0, 8 및 24시간으로 처리한 효과를 비교해 보면, 액아의 수는 일장의 길이에 관계없이 처리 간에 유의성이 없고, 생체중은 온도 15℃ 처리에서는 일장 시간 간에 차이가 없으나 25℃를 처리한 것에서는 일장 8시간 또는 24시간의 처리가 광을 전혀 처리하지 않은 0시간보다 효과적이었다. 형성된 소괴경의 수를 보면 25℃에 24시간의 일장 처리에서 31.0개로 25℃에 8시간 일장 처리한 19.8개보다 현저히 많이 형성되었다. 소괴경의 무게 역시, 25℃에 24시간 일장 처리한 것에서 가장 양호하였다.
후속연구
- 둥근마 기내배양의 배지공급 방식을 배지교환식 방법으로 적용하여 씨마로 실용가능한 기내소괴경의 생산을 할 수 있었으며, 종우생산을 위한 인공씨마의 효율적인 생산단계에 도입하였다. 배양체의 생산규모 확대와 생산된 인공씨마의 발아와 생장에 대한 연구가 뒷받침된다면 인공씨마를 활용한 종우 대량생산의 실용화가 완성될 것이다. 이어 생산비의 절감과 보관, 파종의 편리성, 우수한 품질의 작물생산으로 농가소득의 증대와 경쟁력의 확대를 기대한다.
- 배양체의 생산규모 확대와 생산된 인공씨마의 발아와 생장에 대한 연구가 뒷받침된다면 인공씨마를 활용한 종우 대량생산의 실용화가 완성될 것이다. 이어 생산비의 절감과 보관, 파종의 편리성, 우수한 품질의 작물생산으로 농가소득의 증대와 경쟁력의 확대를 기대한다.
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