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문제 정의
- 본 연구에서는 순천만의 갯벌토양으로부터 배양 가능한 미생물의 세포외 효소 활성을 측정하여 기본적인 특성을 분석하였으며, 생태계에 존재하는 환경 총유전체, 즉 메타게놈을 추출하여 세균 16S rDNA 클론 라이브러리를 제작하고, 이의 염기서열을 분석하여 순천만 갯벌에 존재하는 난배양성 미생물들을 포함한 미생물군집의 다양성을 조사하였다.
제안 방법
- 비교. 세균과 곰팡이 이외의 종속영양생물들이 고분자물질을 분해하는 효소를 체외로 방출하는 경우가 거의 없고, 해양에서의 고분자물질 가수분해효소의 활성이 세균의 생물량과 밀접한 연관을 갖고 있으며, ") 갯벌 주변의 효소들은 대부분 세균으로부터 유래한다는 가정을 토대로 수초 주변과 갯벌 내에 존재하는 미생물들의 세포 외 효소를 비교하기 위하여 CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 조사하였다. 각 시료를 10배 희석하여 얻은 colony를 CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 조사하기 위하여 각각 LBC, LBX 그리고 LBM 배지에 옮겨 확인한 결과 수초의 경우 45.
- 0~ 11.0로 조정하여 50。(2에서 30분 동안반응시킨 후 효소 활성을 측정함으로 조사하였다.
- 9% NaCl 9mZ에 넣고 잘 섞은 후 LB(Luria- Bertani) agar plate에 도말한 후 25℃에서 24시간 배양한 후나타난 콜로니를 분리하였다. CMCase(carboxymethyl-cellulase) 활성은 1%의 CMC와 0.08%의 trypan blue가 첨가된 LB 한천배지 LBS], xylanase 활성은 0.3%의 xylan이 포함된 LB 한천배지 LBX에, 그리고 protease 활성은 1%의 skim milk와 2 mM CaCL가 첨가된 LB 한천배지 LBM에 24시간 배양한 후콜로니 주위의 투명한 환으로 확인하였다.
- 조효소 원 효소 활성 측정. CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 모두 보이는 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지 200 m2 에 3TC에서 12시간 배양한 후 6, 000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상층 액을 효소원으로 사용하였다. CMCase는 기질로부터 생성된 환원당을 dinitrosalicylic acid(DNS) 방법', 으로측정하여 효소의 활성을 정량하였다.
- 계통수를 작성하였다. Neighbor-joining data의 Bootstrap 분석 시 1,000회의 resampling을 적용하여 tree topology의 평가 기준으로 사용하고 이를 토대로 phylogenetic tree를 결정하였다.
- 16S rDNA 중폭 및 클로닝. 분리한 total DNA에서 16S rDNA를 증폭시키기 위하여 5LAGAGTTTGATCMTGGCTCAG 를 forward primer로, 5'-GGrTACCTTGTTACGACTT를 reverse primer로 사용하여 PCR을 수행하였다 PCR 조건은 160 ng의 DNA와 10 pmol primers, 2.5 mM dNTPs, lOx PCR 완충용액, 1.0 (J Taq DNA polymerase를 넣고 최종 반응 부피를 20 μ/되게 하여 95。(2에서 7분간 pre-denaturation 시킨 후 종 35회 반복(95℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 1 분 3。초간 extension)한 후, 최종적으로 72。(에서 7 분간 더 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 0.
- 염기서열의 chimeric artifact는 RDP(Ribosomal Database Project)의 CHECK CHIMERA program에 의해 확인하였다. 염기서열 간의 유사도를 확인하기위하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) search# 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 의 GenBank와 EMBL database에서 유사한 염기서열을 비교하였다.叫 클론의 결정된 염기서열과 database에 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(ver 3.
- rDNA 클론 확인 및 분석. 위에서 얻은 white 콜로니를 ampicillin이 포함된 LB 배지에 접종하여 플라즈미드 DNA를 추출한 후 제한효소 5amHI, HindOl, Sspl, EcoRV, Hir&, 그리고 Smal을 처리하叫 밴드 패턴을 비교하여 분류할 수 있는 그룹으로 나누었으며, 각 그룹별로 한 개 클론의 염기서열을 분석하였다.
- 이들 중 200개의 플라즈미드를 대상으로 제한효소 pattern 을 분석한 결과 20개의 그룹으로 나눌 수 있었다(결과 미제시). 이들 중 3개의 그룹에 해당하는 클론은 염기서열 분석 결과가 분명하지 않아 염기서열이 확인된 17개의 클론을 대상으로 RDP 의 CHECK CHIMERA program과 NCBI의 BLAST 분석을 통하여 각각의 유사도를 분석하였다(Table 2).
- 조효소 원 효소 활성 측정. CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 모두 보이는 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지 200 m2 에 3TC에서 12시간 배양한 후 6, 000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상층 액을 효소원으로 사용하였다.
- 0 (J Taq DNA polymerase를 넣고 최종 반응 부피를 20 μ/되게 하여 95。(2에서 7분간 pre-denaturation 시킨 후 종 35회 반복(95℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 1 분 3。초간 extension)한 후, 최종적으로 72。(에서 7 분간 더 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 0.7% agarose gel에서 전기영동하여 분리하였으며, 분리된 DNA를 pGEM T-Easy vector(Promega, USA)에 ligation 하여 Escherichia coli XL1- Blue에 형질전환시켜 , ampicillin(50 이 포함된 LB 한천 평판배지에서 blue-white 콜로니 선별법에 의해 형질전환 클론을 선별하였다.
- 회수한 상등액을 70% ethanol로 씻어 준 후 다시 한 번 원심분리하여 DNA를 확보하였다. 확보한 DNA는 완충용액(10 mM Tris-HCl/pH 8.0 + 1 mM EDTA)을 사용하여 41에서 하룻밤 투석하였다.
- 효소 반응의 최적 온도와 pH. 최적 온도는 각각의 효소 반응 혼합물을 40, 50, 55, 60, 65, 70 그리고 80℃에서 30분간반응하여 효소 활성도를 측정함으로 조사하였다. 최적 pH는 최종 농도 50mM의 Na-citrate, Tris-HCl, Glycine-NaOH를 사용하여 반응액의 pH를 4.
대상 데이터
- 순천만 갯벌에서 2005년 1월에 시료들을 채취하였고 기존의 방법 02。)을 약간 수정하여 이들로부터 DNA를 분리하였다. 갯벌 5 g에 DNA 추출 완충용액 (100 mM Tris-HCl/pH 8.0, 100 mM EDTA, 100 mM sodium phosphate/pH 8.0, 1.5 M NaCl, 1% CTAB, 100 |i/ proteinase K) 13.5ml를 첨가한 후, 37℃에서 진탕 배양하였다. 그 후, 20% SDS 1.
- 수초에서 2번, 3번, 갯벌 시료에서 27, 30번 콜로니를 택하였다. 대조군으로는 위 3종류의 효소 활성이 없는 E. coli DH5a를사용하였다. 이들 4개 균주의 효소 활성을 측정한 결과, 전반적으로 xylanase 활성이 높게 나타났다(Fig.
- 16S rDNA 분석. 분리된 메타게놈의 bacterial 16S rDNA를증폭시키기 위하여 27f와 1522r primer를 사용하였고, PCR 증폭한 결과 1.5 kb 산물을 얻었다(Fig. 4B). 이 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector에 삽입하여 약 2,000개의 클론들을 얻었다.
- 시료 채취. 시료는 전남 순천만의 수초지역과 갯벌지역에서 채취하였다. 각각의 시료는 표층에서 채취하였으며, conical tube 에 넣어 4P에 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 활성이 있는 콜로니 중에서 수초와 갯벌 시료에서 각각 2개씩 총 4개의 비교적 큰 활성 환을 보이는 콜로니를 선택하였다. 수초에서 2번, 3번, 갯벌 시료에서 27, 30번 콜로니를 택하였다.
데이터처리
- 염기서열 간의 유사도를 확인하기위하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) search# 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 의 GenBank와 EMBL database에서 유사한 염기서열을 비교하였다.叫 클론의 결정된 염기서열과 database에 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(ver 3.2; http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/phydit) 을 이용하여 Clustal W multiple alignnmlent로 정렬하여 계통수제작에 이용하였다. 염기서열 간 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model")로 사용하여 추정하였으며, Neighbor-joining methods.
이론/모형
- kr/~jchun/phydit) 을 이용하여 Clustal W multiple alignnmlent로 정렬하여 계통수제작에 이용하였다. 염기서열 간 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model")로 사용하여 추정하였으며, Neighbor-joining methods. 계통수를 작성하였다.
- CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 모두 보이는 콜로니를 선별하여 LB 액체 배지 200 m2 에 3TC에서 12시간 배양한 후 6, 000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상층 액을 효소원으로 사용하였다. CMCase는 기질로부터 생성된 환원당을 dinitrosalicylic acid(DNS) 방법', 으로측정하여 효소의 활성을 정량하였다. 반응액은 0.
- 16S rDNA 염기서열의 계통 분석. 염기서열의 chimeric artifact는 RDP(Ribosomal Database Project)의 CHECK CHIMERA program에 의해 확인하였다. 염기서열 간의 유사도를 확인하기위하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) search# 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 의 GenBank와 EMBL database에서 유사한 염기서열을 비교하였다.
성능/효과
- 이들 humic compound나 효소저해 물질들은 PCR 및 제한효소 반응을 저해하는 것으로 알려져 있다.25") Ethanol 침전 시에는 갯벌 자체에 염 농도가 매우 높으므로 NaCt을 넣지 않았으나, ammonium acetate 침전에의해 정제된 DNA는 갈색을 띠었으며, PCR이 수행되지 않았 匸上 따라서 humic compound들이 전기영동 싱에서 DNA에 비해 약 2배 정도 빠르게 이동하는 성질을 이용하여 DNA의 2차정제를 수행하였으며, 이후 얻어진 DNA는 PCR, 제한효소 처리 및 클로닝을 수행하기에 적합하였다. 분리된 메타게놈은 약 20 kb 이상으로 확인되었으며, 투석으로 불순물을 제거하였다 (Fig.
- 황 원소의 산화와 환원에 관여하는 gamma Proteobacteria의 비율이 전체 Proteobacteria 중에서 높게 나타났다. 총 클론 중 gamma Proteobacteria의 비율(8/17 = 47.1%)은 강화도 갯벌의 연구 결과인 21.5%"‘码 비교할 때높은 것으로 나타났다. 3개(17.
- 9%로僱 매우 낮은 유사도 지수를 보였다. 108번 클론은 중금속에 오염된 해양 퇴적토 환경의 uncultured gamma proteobacterium Belgica 2005/10-130-12 클론과 98.5%回 유사도를 보였으며, 배양균주 Thiocystis violacea DSM 207 표준 균주와 88.7%의 유사도 지수를 보였다.
- 3%의 염기 유사도를 나타냈다.33)104번 클론은 갯벌 퇴적토로부터 분리된 Lutibacter litoralis JCM 13034 표준균주 16S rRNA 유전자와 98.7%2] 유사도를 보였다.翊 106번은 탈질 반응기로부터 클론된 uncultured bacterium DB-33 16S rRNA gene과 91.
- 1 %으로 매우 낮은 유사도 지수를 보였다.3그 97번 클론은 uncultured proteobacterium clone DR 93 8CH110701SACH45 16S rRNA 유전자와 96%의 염기 유사도를 보였으며, Thioalkalivibrio denitrificans ALJD 표준 균주와는 88.7%의 유사도 지수를 보였다. 101번은 배앙가능한 Nitrincola lacisaponensis 4CA 표준균주와 90.
- 9%의유사도 지수를 보였다. 5번은 해수 표면으로부터 클론된 uncultured marine bacterium SJC3.21 와 98.4%留 유사도 지수를 보였으며, 배양가능한 Rubritalea squalenifaciens HOact23 표준균주와 89.02%의 낮은 유사도 지수를 보였다.2" 7번, 107 번 클론은 그람양성 세균이며, 토양, 담수, 해수 등 자연계 전반적으로부터 분리되는 Bacillus subtilis subsp.
- 3%로 매우 낮은 유사도 지수를 보였다. 81번은해양퇴적토 샘플의 uncultured delta proteobacterium Belgica 2005/10-130-15의 클론과 97.5%의 유사도를 보였으며 배양 가능한 미생물 Byssowrax cruenta DSM 14553 표준균주와는 88.1 %으로 매우 낮은 유사도 지수를 보였다.3그 97번 클론은 uncultured proteobacterium clone DR 93 8CH110701SACH45 16S rRNA 유전자와 96%의 염기 유사도를 보였으며, Thioalkalivibrio denitrificans ALJD 표준 균주와는 88.
- 5%5j 유사도 지수를 나타냈다. 9번 클론은 조류가 풍부한 해수로부터 클론된 bacterium DG976와 98.0%의 유사도 지수를 보였으며, 鄭 배양 가능한 균주인 Donghaeana dokdonensis DSW-6 표준균주와도 비교적높은 97.1%倒 유사도 지수를 나타내었다. 17번, 22번, 98번 클론들은 국내 강화 갯벌 환경의 클론들과 매우 높은 유사도 지수를 보였다.
- 33번 클론은 항구 퇴적토로부터 클론된 uncultured Pseudomonas sp. VHS-B4-54 와 98.4%의 높은 유사도 지수를 보였으며, 극호염 환경에서 서식하는 호염성 항산화 세균의 일종인 Thiohalophilus thiocyanoxidans HRhD 2 표준 균주와 91.1%로 가장 가까운 유사도 지수를 보였다即 46번은 해저 열수공의 bio句m으로부터 클론된 uncultured Acidobacteria bacterium MS12 16S ribosomal RNA 유전자와 93.2%의 유사도를 확인할 수 있었으며, 배양 가능한 미생물 Desulfotomaculum halophilum SEBR 3139의 표준균주와는 82.3%로 매우 낮은 유사도 지수를 보였다. 81번은해양퇴적토 샘플의 uncultured delta proteobacterium Belgica 2005/10-130-15의 클론과 97.
- 8 이상에서 CMCase 활성이 감소하였다. Xylanase의 최적 pH는 2, 3, 27, 30번 모두 pH 4~5임을 알 수 있었다(Fig. 3). Protease는 4 균주 모두 pH 7에서 최대 활성을 나타냈다.
- 세균과 곰팡이 이외의 종속영양생물들이 고분자물질을 분해하는 효소를 체외로 방출하는 경우가 거의 없고, 해양에서의 고분자물질 가수분해효소의 활성이 세균의 생물량과 밀접한 연관을 갖고 있으며, ") 갯벌 주변의 효소들은 대부분 세균으로부터 유래한다는 가정을 토대로 수초 주변과 갯벌 내에 존재하는 미생물들의 세포 외 효소를 비교하기 위하여 CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 조사하였다. 각 시료를 10배 희석하여 얻은 colony를 CMCase, xylanase, 그리고 protease 활성을 조사하기 위하여 각각 LBC, LBX 그리고 LBM 배지에 옮겨 확인한 결과 수초의 경우 45.4%, 갯벌의 경우 61.3%의 균주에서 위 3종류의 효소 활성을 보이는 것으로 확인되었다 (Table 1).
- 분석된 17개의 클론들의 평균 유사도는 97.3%이었으며, 그 범위는 91.0-99.9%를 보였다. 이 값은 이전에 보고된 배양 가능한 미생물과의 최고 유사도인 96.
- 16S rDNA 계통 분석. 위에서 얻은 자료와 PHYDIT program을 이용한 Clustal W multiple alignment과 Neighborjoining method로 계통수를 작성하여 이들의 계통을 분석한 결과, Proteobacteria, Bacteroidetes, Flavobacteria, Verrucomicrobia, Acidobacteria, Firmicutes, 그리고 Chloroflexi 등 7개의 lineage로 구분될 수 있었다(Table 2 & Fig. 5). 분석한 클론 수가 충분하지는 않으나 본 연구의 7개의 그룹은 이전에 보고된 해양퇴적물 내 6개") 또는 5개 그룹 36)의 결과 보다 다양또는 비슷한 수준에 있다고 추정할 수 있다.
- 이들 균주가 생산하는 protease 활성은 사용된 buffer의 종류에 민감한 것으로 확인되었다. 위와 같이 미생물의 세포 외 효소 활성을 CMCase, xylanase, 그리고 protease을 대표로 하여 분석한 결과, 수초와 갯벌에 존재하는 미생물의 종류는 큰 차이가 없는 것으로 추정할 수 있었다.
- 다시 증가하는 것으로 나타났다. 이 결과로부터 2, 3 번 균주는 최적 온도가 다른 두 종류 또는 그 이상의 CMCase 를 생산한다는 것을 예측할 수 있다. 분리 균주 4개 모두 70℃ 에서 최대 활성을 보이는 비교적 열에 안정한 CMCase를 생산하였다(Fig.
- coli DH5a를사용하였다. 이들 4개 균주의 효소 활성을 측정한 결과, 전반적으로 xylanase 활성이 높게 나타났다(Fig. 1).
- Protease는 4 균주 모두 pH 7에서 최대 활성을 나타냈다. 이들 균주가 생산하는 protease 활성은 사용된 buffer의 종류에 민감한 것으로 확인되었다. 위와 같이 미생물의 세포 외 효소 활성을 CMCase, xylanase, 그리고 protease을 대표로 하여 분석한 결과, 수초와 갯벌에 존재하는 미생물의 종류는 큰 차이가 없는 것으로 추정할 수 있었다.
- 1%(103개 중 64개) 클론이 Proteobacteria6^ 속하였다는 결과 보다는 낮게 나왔다. 황 원소의 산화와 환원에 관여하는 gamma Proteobacteria의 비율이 전체 Proteobacteria 중에서 높게 나타났다. 총 클론 중 gamma Proteobacteria의 비율(8/17 = 47.
후속연구
- 일반적으로 미생물 군집구조가 물리 화학적 요인으로 다양^ 이 감소하거나 변할 수 있다는 보고37) 와는 다르게 순천만 갯벌은 미생물 다양성을 유지하고 있으며, 분석된 클론의 65% 가량이 배양되지 않은 미생물인 것으로 조사되었다. 다양^을 유지하고 있는 이 갯벌로부터 메타게놈 라이브러리를 제작하여보다 다양한 유전자원을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.
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