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문제 정의
- 국내의 경우 최근에 갯벌 미생물 다양성에 대한 연구들도 보고되고 있지만(2, 3, 20) 외국에 비해 극히 부진한 실정이다. 본 연구는 우리나라 대표적인 하구 갯벌의 하나인 강화도 갯벌에서 말단제 한절편분석 (terminal-restriction fragment length polymorphism; T- RFLP)을 통해 미생물 군집구조를 파악하고, 16S rDNA의 염기 서열 분석을 이용한 미생물 다양성 분석을 통해 서로 다른 두 층의 미생물 생태 환경을 이해하기 위한 것이다.
제안 방법
- 분석은 자동염기서열 결정 장치를 이용하여 유전자 서열분석을 실시하였다. 16S rDNA의 S말단에서부터 약 500-900 base까지 염기서열을 결정하였고, RDP (Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK CHIMERA 프로그램에 의해 chimera artifact를 확인하였다. 결정된 16S rDNA 염기서열들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색을 통해 클론과 가장 가까운 그룹을 조사하여 참조서열을 확보하였다.
- 5로 조정하고 나머지는 위 조건과 동일하게 하였다. PCR 산물을 분석하기 위해 0.8% 아가로즈 젤에 전기영동 하여, EtBr용액에 10분간 염색하고 15분간 탈색시킨 후 UV Illuminator로 관찰하였고 PCR 산물을 정제하기 위해 AccuPrep® PCR Purification kit (BIONEER, Daejeon, Korea)을 이용하였다.
- 표층(0-1 cm 깊이)에서는 다양한 크기의 T-RFs가 고른 분포를 보였고, 저층(6-7 cm 깊이)에서는 특정 크기의 T-RFs가 상대적으로 매우 높은 비율로 나타나 특정 그룹이 우점하고 있음을 보여주었다. T-RFLP 분석 결과와 클로닝을 통해 얻어진 염기서열에 제한효소를 처리하였을 때 예상되는 말단제한절편(T-RF)의 크기를 계산하여 비교하였다. 표층에서 가장 높게 나타나는 1번 피크(Fig.
- 반응 부피 50111 용량으로 핵산 증폭기 모델 2400 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 95℃에서 5분간 반응 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72 ℃ 2분으로 35회 반복 반응시킨 후 72℃에서 7분간 더 반응시켰다. T-RFLP 분석을 위하여 수행한 PCRe 8F primer의 5'말 단에 phosphoramidite dye 인 5-hexachlorofluorescein(HEX)으로 표지된 HEX-8F를 제작 의뢰하여 사용하였다. PCR 조건은 primer 농도를 0.
- 16S rDNA의 S말단에서부터 약 500-900 base까지 염기서열을 결정하였고, RDP (Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK CHIMERA 프로그램에 의해 chimera artifact를 확인하였다. 결정된 16S rDNA 염기서열들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색을 통해 클론과 가장 가까운 그룹을 조사하여 참조서열을 확보하였다. 염기서열 편집과 정렬은 PHYDIT (developed by Dr.
- 2)을 이용하였고, Evolutionary distance matrices 들은 Jukes and Cantor(1969)의 algorithm으로 계산하였으며, 계통도는 Neighbor-Joining method를 이용하였다. 계통도내 분지의 안정도를 조사하기 위하여 1000번의 bootstrap resampling 분석을 실시하여 500 이상의 값을 표시하였다. 172개의 클론에 대해 결정한 부분 염기서열들은 NCBI GenBank로부터 accession number (AY568762 - AY568934)를 부여 받았다.
- coli JM109에 형질전환시켜 ampicillin (50㎍/μl)이 포함된 LB 평판배지에서 blue-white colony 선별법에 의해 형질 전환체를 선별하였다. 무작위로 얻어진 총 172개(0-1 cm 깊이, 84개; 6-7 cm 깊이, 88개)의 클론을 대상으로 primer T7 (5'-TAA ATC CAA GAA TIT CAC C-3)과 SP6 (5-TAT TTA GT GAC ACT ATA G-3)를 이용하여 16S rDNA부분을 증폭한 후 정제하여 이를 염기서열 분석을 위한 주형으로 이용하였다. 염기서열 분석은 Big-Dye Cycle Sequencing Kit (v.
- 5 U Taq DNA polymerase, template 는 약 10~100ng으로 하였다. 반응 부피 50111 용량으로 핵산 증폭기 모델 2400 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 95℃에서 5분간 반응 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72 ℃ 2분으로 35회 반복 반응시킨 후 72℃에서 7분간 더 반응시켰다. T-RFLP 분석을 위하여 수행한 PCRe 8F primer의 5'말 단에 phosphoramidite dye 인 5-hexachlorofluorescein(HEX)으로 표지된 HEX-8F를 제작 의뢰하여 사용하였다.
- 1)를 이용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 분석은 자동염기서열 결정 장치를 이용하여 유전자 서열분석을 실시하였다. 16S rDNA의 S말단에서부터 약 500-900 base까지 염기서열을 결정하였고, RDP (Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK CHIMERA 프로그램에 의해 chimera artifact를 확인하였다.
- T-RFLP 분석 방법이 비록 미생물 종의 정성적 분석(richness) 과 정량적 분석(evenness)에 대한 정확한 정보를 제공하기에는 부족할지라도 이는 미생물 군집간의 유사도와 분포를 설명하고자 할 땐 비교적 신속하고, 효과적인 방법으로 알려져 있다(13, 27, 30). 정제된 PCR 산물 50ng/|H을 4 염기서열을 인지하는 제한효소 Hhal (GCGTC; Promega, Madison, USA) 으로 최종 부피 20μ1로 하여 제조사의 방법대로 처리하였다. 반응이 끝난 말 단제한절편은 에탄올 추출방법으로 농축한 다음 formamide 용액과 DNA standard (ROX 2500; ABI)의 혼합물(50:1)을 10|11 넣어 잘 섞어준 후 95℃에서 5분간 중탕 가열하여 denature 시킨 후 즉시 얼음 위에 위치시켰다.
- 퇴적 깊이 0-1 cm 와 6-7 cm 두 층을 대상으로 16S rDNA 클론의 염기서열을 분석하였다. 총 172개(표층-84개; 저층-88개)의 클론을 임의로 선택하여 500-900 bp 크기의 부분염기서열을 결정하였고, chimera artifact를 조사한 결과 chimera는 발견되지 않았다.
- 핵산을 추출하는 기본적인 방법은 Kuske 등(22)의 것을 기본으로 하여 이를 약간 수정한 방법을 사용하였다(3). RNA를 제거하기 위해 RNase A solution을 0.
대상 데이터
- 갯벌 퇴적물 시료의 채집은 2002년 7월에 실시하였으며, 채집 위치는 강화도의 남서쪽에 위치한 장화리 갯벌로 육지에서 약 50 m 떨어진 곳에서 50 ml 주사기 코어를 이용하여 현장에서 수직으로 갯벌 시료를 채취하였다. 시료의 교란에 주의하여 실험실로 운반한 후, 두 층(0-1 cm, 6-7 cm)의 퇴 적 물을 0.
- 퇴적 깊이 0-1 cm 와 6-7 cm 두 층을 대상으로 16S rDNA 클론의 염기서열을 분석하였다. 총 172개(표층-84개; 저층-88개)의 클론을 임의로 선택하여 500-900 bp 크기의 부분염기서열을 결정하였고, chimera artifact를 조사한 결과 chimera는 발견되지 않았다. 분석된 부분 염기서열들은 PHYDIT 프로그램으로 정렬한 후 GenBank database를 이용하여 16S rRNA sequence와 비교하였다.
- 퇴적물 내의 eubacteiral 16S rDNA 증폭을 위해 primer 8F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1522R (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3)을 사용하였다. PCR 조건은 lx PCR buffer, 2mM MgCl2, 0.
데이터처리
- 총 172개(표층-84개; 저층-88개)의 클론을 임의로 선택하여 500-900 bp 크기의 부분염기서열을 결정하였고, chimera artifact를 조사한 결과 chimera는 발견되지 않았다. 분석된 부분 염기서열들은 PHYDIT 프로그램으로 정렬한 후 GenBank database를 이용하여 16S rRNA sequence와 비교하였다. 그 결과 배양 가능한 미생물과 98%이상의 유사도를 갖는 클론들은 4개에 불과하였고, 나머지 약 98%가 배양되어지지 않은 미생물로 나타났다(Fig.
이론/모형
- 반응이 끝난 말 단제한절편은 에탄올 추출방법으로 농축한 다음 formamide 용액과 DNA standard (ROX 2500; ABI)의 혼합물(50:1)을 10|11 넣어 잘 섞어준 후 95℃에서 5분간 중탕 가열하여 denature 시킨 후 즉시 얼음 위에 위치시켰다. 생성된 말단제한절편(T-RF; terminal restriction fragment)분석은 자동염기서열 결정 장치(모델 ABI 3100, Automated sequencer; Apfilied Biosystems Instrument, Foster, USA)를 사용하였다.
- 무작위로 얻어진 총 172개(0-1 cm 깊이, 84개; 6-7 cm 깊이, 88개)의 클론을 대상으로 primer T7 (5'-TAA ATC CAA GAA TIT CAC C-3)과 SP6 (5-TAT TTA GT GAC ACT ATA G-3)를 이용하여 16S rDNA부분을 증폭한 후 정제하여 이를 염기서열 분석을 위한 주형으로 이용하였다. 염기서열 분석은 Big-Dye Cycle Sequencing Kit (v.3.1)를 이용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 분석은 자동염기서열 결정 장치를 이용하여 유전자 서열분석을 실시하였다.
- 결정된 16S rDNA 염기서열들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색을 통해 클론과 가장 가까운 그룹을 조사하여 참조서열을 확보하였다. 염기서열 편집과 정렬은 PHYDIT (developed by Dr.J. S. Chun, version 3.2)을 이용하였고, Evolutionary distance matrices 들은 Jukes and Cantor(1969)의 algorithm으로 계산하였으며, 계통도는 Neighbor-Joining method를 이용하였다. 계통도내 분지의 안정도를 조사하기 위하여 1000번의 bootstrap resampling 분석을 실시하여 500 이상의 값을 표시하였다.
- 증폭된 1.5 kb 크기의 16S rDNA를 pGEM T-Easy Vector (Promega, Madison, USA)에 ligation 한 후 E. coli JM109에 형질전환시켜 ampicillin (50㎍/μl)이 포함된 LB 평판배지에서 blue-white colony 선별법에 의해 형질 전환체를 선별하였다. 무작위로 얻어진 총 172개(0-1 cm 깊이, 84개; 6-7 cm 깊이, 88개)의 클론을 대상으로 primer T7 (5'-TAA ATC CAA GAA TIT CAC C-3)과 SP6 (5-TAT TTA GT GAC ACT ATA G-3)를 이용하여 16S rDNA부분을 증폭한 후 정제하여 이를 염기서열 분석을 위한 주형으로 이용하였다.
성능/효과
- 16S rDNA 클론의 염기서열 분석 결과 a-, y-, 8-Pmteobacteria 그룹, Acidobacteria/Holophaga 그룹 그리고 green nonsulfur bacteria 등에 속하였으며, 이중 Proteobacteria 그룹이 연구지역 표증에서는 전체의 69%, 저층에서는 46%의 높은 비율로 나타났다. 또한 깊이가 깊어짐에 따라 "f-Proteobacteria와 a-Proteobacteria 그 룹이 차지하는 비율은 감소하고, 주로 혐기성 환경에서 나타나는 미생물로 알려진 Acidobacteria/Holophaga그룹과 green nonsulfur bacteria의 비율이 증가하는 것으로 조사되었다. BLAST 검색 결과 기존 연구들에서 나타난 그 어떤 클론과도 90% 이상의 유사성을 갖지 않는 클론들도 조사되었다.
- 16S rDNA 클론들의 계통 분석 결과 강화도 갯벌 퇴적물 내에는 대사과정에 황화물을 이용하는 미생물 그룹이 많이 나타나는 것으로 조사되었다. 특히, y-Pmteobacteria 그룹 내의 황산화 세균과 8-Proteobacteria 그룹 내의 황산염 및 황환원 세균이 전체 16S rDNA 클론 중 37.
- 본 조사 지역 에서 나타나는 주요 미생물 그룹을 Table 1에 나타내었다. 16S rDNA 클론의 염기서열 분석 결과 a-, y-, 8-Pmteobacteria 그룹, Acidobacteria/Holophaga 그룹 그리고 green nonsulfur bacteria 등에 속하였으며, 이중 Proteobacteria 그룹이 연구지역 표증에서는 전체의 69%, 저층에서는 46%의 높은 비율로 나타났다. 또한 깊이가 깊어짐에 따라 "f-Proteobacteria와 a-Proteobacteria 그 룹이 차지하는 비율은 감소하고, 주로 혐기성 환경에서 나타나는 미생물로 알려진 Acidobacteria/Holophaga그룹과 green nonsulfur bacteria의 비율이 증가하는 것으로 조사되었다.
- Alpha Proteobacteria 총 23개의 클론이 조사되었으며 (0-1 cm 깊이에서 13개, 6-7 cm 깊이에서 10개), 주로 Rhodobacteraceae 그룹에 속하는 Roseobacter, Ruegeria, Tanella vestfoldensisv, Rhodobacter 속과 95~99%의 유연관계를 보이는 클론들이 많이 나타났으며(Fig. 5), 이들은 산소를 발생하지 않는 광영양 미생물로 알려져 있다(1). 또한 통성호기성 호흡을 하는 Rhodoplanes e/egtms와 Rhodobium orie湖s와 유연관계를 보이는 클론들, 그리고 Erythrobacter와 유연관계를 보이는 클론이 나타났는데, 이중 Erythrobacter 속의 미생물들은 절대 호기성 세균으로 0-1 cm 깊이에서만 관찰되었다.
- Gamma Proteobacteria y-Proteobacteriae- 본 연구 지역에서 총 40개로 가장 많은 수의 클론이 나타났다(Table 1). 0-1 cm 깊이에서는 28개의 클론, 6-7 cm 깊이에서는 12개의 클론이 나타나 퇴적 깊이가 증가할수록 그 수가 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 또한 6-7 cm 깊이에서 나타난 클론 JH12 C01, JH12 C03 그리고 JH12 C20은 하나의 cluster를 형성하고 있는데 BLAST 검색 결과 어떤 세균과도 80%이상의 유연관계를 보이지 않았고, 가장 높은 유사도를 보인 Arctic sediment clone Sva0389와도 79% 정도로 낮았다. Planctomyceteec 91%의 유사도를 갖는 클론이 6-7 cm 층에서 한 개 관찰되었고, 다양한 고분자 물질을 분해할 수 있는 능력을 가진 Cytophaga에 속하는 클론들은 표층과 저층에서 각각 한 개씩 발견되었다. 엽록체 클론들도 각 깊이에서 2개씩 조사되었는데, 이들 클론들은 Skeletonema pseudocustatum 의 엽록체와 98%의 높은 유사도를 나타내었으나 계통 분석도에서는 제외하였다.
- Green nonsulfur bacteria 0-1 cm 깊이에서 8개, 6-7 cm 깊이에서는 16개의 클론이 나타나 퇴적깊이가 증가할수록 높은 비율로 나타났으며(Table 1), 대부분 혐기성이고, 호열성 환경에서 주로 보고 되었다(17). 계통 분석결과 크게 BD3-16/BPC11O 그룹과 OPB11 그룹으로 나타나며, 두 그룹 모두 주로 심해저에서 발견된 클론들과 높은 유연관계를 갖고, 배양 가능한 어떤 미생물 종과도 유연관계를 갖지 않는다(Fig. 7).
- 분석된 부분 염기서열들은 PHYDIT 프로그램으로 정렬한 후 GenBank database를 이용하여 16S rRNA sequence와 비교하였다. 그 결과 배양 가능한 미생물과 98%이상의 유사도를 갖는 클론들은 4개에 불과하였고, 나머지 약 98%가 배양되어지지 않은 미생물로 나타났다(Fig. 3~Fig. 8). 그 중 서로 98%의 유사도를 갖는 염기서열을 같은 것 또는 같은 계통형(phylotype)이라 보고 계산하여 본 결과(8), 148개(전체 중 86%)의 서로 다른 염 기서열을 확인할 수 있어 본 연구 지역에는 다양한 미생물이 서식하는 것을 알 수 있었다.
- 8). 그 중 6개의 클론이 Arctic sediment clone SvaO389와 81~89%의 유사성을 보였고, 6개의 클론 모두가 일본 열수 환경의 심해 퇴적물에서 발견된 클론(AB099989)과는 90% 이상의 유사성을 보였다. 또한 6-7 cm 깊이에서 나타난 클론 JH12 C01, JH12 C03 그리고 JH12 C20은 하나의 cluster를 형성하고 있는데 BLAST 검색 결과 어떤 세균과도 80%이상의 유연관계를 보이지 않았고, 가장 높은 유사도를 보인 Arctic sediment clone Sva0389와도 79% 정도로 낮았다.
- 8). 그 중 서로 98%의 유사도를 갖는 염기서열을 같은 것 또는 같은 계통형(phylotype)이라 보고 계산하여 본 결과(8), 148개(전체 중 86%)의 서로 다른 염 기서열을 확인할 수 있어 본 연구 지역에는 다양한 미생물이 서식하는 것을 알 수 있었다. 계통 분석 시 클론 2개 이상, distance 0.
- 본 연구의 결과 강화도 갯벌 퇴적물 내 미생물 군집은 퇴적 깊이에 따라 다르게 나타나며 매우 다양한 미생물들이 서식하는 것으로 나타났다. 그 중 황화합물을 이용하는 미생물 그룹이 전체 중 37.2%로 조사되어 본 연구지역에서는 황원소 순환에 관련된 미생물 군집이 생지화학적으로 중요한 역할을 수행하고 있을 것이라 여겨진다. 따라서 연안 퇴적 환경의 생지화학적 원소의 순환 및 조절 요인에 대한 이해를 넓히기 위해서는 황환원 세균 군집의 생태에 대한 연구가 필요하다.
- 4, 9, 12번 피크는 일부 y-Proteobacteria 그룹이, 6, 7, 13번은 Acidobacteria/Holophaga 그룹이 주로 형성하는 피크로 조사되었다. 그리고 2번 피크의 경우 81 bp의 T- RF로 a-Proteobacteria 그룹 내의 절대 호기성 광영양세균인 Erythrobacter 속이 형성하며 표층에서만 관찰되었다. 저층에서는 1번과 3번 피크가 우세하게 나타난 것으로 보아 이 환경에서는 1번 피크를 형성하는 일부 a-, y-Proteobacteriae 3번 피크를 형성하는 대부분의 8-Proteobacteria 그룹에 속하는 미생물들이 우점하는 것으로 여겨진다.
- 이들은 일반적으로 해양 혐기환경에 널리 나타나는 그룹으로, 전자수용체인 황산염이나 황이 없는 환경에서는 여러가지 유기산들을 발효시켜 성장하기도 하는 미생물 그룹으로 알려져 있다(33). 두 번째 큰 그룹은 황 원소를 전자수용체로 하는 Desulfuromonas 그룹으로 종 4개의 클론이 포함되었고, DesiUfQfacinum과 Desulfobacterium 그룹에도 각각 3개, 2개의 클론이 조사되었다.
- 2)는 60(±2) bp 정도의 크기로 주로 γ-Proteobacteria와 일부 a-Proteobacteria가 이 크기의 T-RF를 형성하였고, 3번 피크는 93(+2) bp 정도의 크기로 모든 8-Pmteobacteriae\- 일부 green nonsulfur bacteria들이 속한 것으로 나타났다. 또한 5번 피크의 크기는 약 211 bp 정도로 y- Proteobacteria와 green nonsulfur bacteria가, 8번 피크는 약 341 bp로 a-Proteobacteria 그룹의 일부가이 크기의 T-RF를 형성하는 것으로 나타났다. 4, 9, 12번 피크는 일부 y-Proteobacteria 그룹이, 6, 7, 13번은 Acidobacteria/Holophaga 그룹이 주로 형성하는 피크로 조사되었다.
- 그 중 6개의 클론이 Arctic sediment clone SvaO389와 81~89%의 유사성을 보였고, 6개의 클론 모두가 일본 열수 환경의 심해 퇴적물에서 발견된 클론(AB099989)과는 90% 이상의 유사성을 보였다. 또한 6-7 cm 깊이에서 나타난 클론 JH12 C01, JH12 C03 그리고 JH12 C20은 하나의 cluster를 형성하고 있는데 BLAST 검색 결과 어떤 세균과도 80%이상의 유연관계를 보이지 않았고, 가장 높은 유사도를 보인 Arctic sediment clone Sva0389와도 79% 정도로 낮았다. Planctomyceteec 91%의 유사도를 갖는 클론이 6-7 cm 층에서 한 개 관찰되었고, 다양한 고분자 물질을 분해할 수 있는 능력을 가진 Cytophaga에 속하는 클론들은 표층과 저층에서 각각 한 개씩 발견되었다.
- 5), 이들은 산소를 발생하지 않는 광영양 미생물로 알려져 있다(1). 또한 통성호기성 호흡을 하는 Rhodoplanes e/egtms와 Rhodobium orie湖s와 유연관계를 보이는 클론들, 그리고 Erythrobacter와 유연관계를 보이는 클론이 나타났는데, 이중 Erythrobacter 속의 미생물들은 절대 호기성 세균으로 0-1 cm 깊이에서만 관찰되었다. Rhizobiaceae 그룹에 속하는 클론들은 질소 고정 능력을 가진 Rhizobium(18)과 95% 이상의 높은 유연관계를 갖고 있다.
- 본 연구는 16S rRNA 유전자 분석을 통해 강화도 갯벌 퇴적물 내 미생물 군집구조와 다양성을 이해하기 위한 시도로써, 퇴적깊이 0-1 cm와 6-7 cm 로 구분하여 T-RFLP 분석을 통해 두 층의 미생물 군집구조가 크게 다른 것을 확인하였고(Fig. 2), 16S rDNA 염기서열 분석 결과 갯벌에 서식하는 미생물은 매우 다양하고 98%의 클론이 배양 가능한 미생물 그룹과 일치하지 않는 것으로 조사되었다(Fig. 3~Fig. 8). 이러한 결과로 미루어 볼 때 배양 방법만을 이용한 갯벌 환경의 미생물 생태 연구 방법은 다양한 미생물 그룹들의 중요성과 역할에 대한 충분한 정보를 제시하지 못하므로 분자생물학적인 방법을 이용한 해석이 필수적이라 할 수 있다.
- 본 연구의 결과 강화도 갯벌 퇴적물 내 미생물 군집은 퇴적 깊이에 따라 다르게 나타나며 매우 다양한 미생물들이 서식하는 것으로 나타났다. 그 중 황화합물을 이용하는 미생물 그룹이 전체 중 37.
- 2에 나타내었다. 분석 결과 표층과 저층에서 나타나는 피크의 양상뿐만 아니라 각각의 T-RFs가 차지하는 상대적인 비율에도 차이를 보였다(Fig. 2). 표층(0-1 cm 깊이)에서는 다양한 크기의 T-RFs가 고른 분포를 보였고, 저층(6-7 cm 깊이)에서는 특정 크기의 T-RFs가 상대적으로 매우 높은 비율로 나타나 특정 그룹이 우점하고 있음을 보여주었다.
- 5%, bootstrap 값 1000으로 하나의 그룹을 형성하였다. 이들 클론은 BLAST 검색 결과 Sva0725 클론과 가장 높은 유사도를 보였으나 90% 이하, bootstrap 500 이하로 낮았다.
- 또한 유기물 유입이 많은 연안 퇴적물에서 황산염 환원은 총 유기물 분해의 50-100 %를 담당하는 것으로 보고되어 왔으며(5, 19), 이를 뒷받침하는 연구로써 최근에 현 등(6)은 하계 장화리 갯벌의 혐기성 유기물 분해의 80%가 황산염 환원 세균에 의해 일어난다고 보고하였다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때 본 연구지역에서 황환원 세균이 주요 미생물 그룹으로 조사된 것은 타당한 결과라 여겨지며, 이는 다른 곳의 해양 퇴적물 미생물 군집을 연구한 결과와도 일치하는 바이다(8, 12, 16, 28).
- 0-1 cm 깊이에서는 28개의 클론, 6-7 cm 깊이에서는 12개의 클론이 나타나 퇴적 깊이가 증가할수록 그 수가 감소하는 것을 알 수 있었다. 조사된 대부분의 클론은 Sva0340 그룹, B2M60 그룹, OM60 그룹 그리고 Sva0091/BPCO22 그룹으로 묶이며 이들은 독립적 또는 공생하는 황산화 세균과 관계되었으나 배양되는 미생물과 는 계통분류학적으로 일치하지 않았다(Fig. 3). 황산화 세균은 주로 황화수소가스가 풍부한 환경에서 환원된 황화합물을 산화시켜 전자공여체로 이용하는 화학 독립 영양 미생물 그룹으로(26), 이들은 환경 내에서 생물에게 독성으로 작용하는 황화수소를 산화하는 중요한 생태적 역할을 담당한다(11).
- 조사지역에서 관찰된 황환원 세균은 모두 ^-Proteobacteria 그룹 내에 포함되었다. 클로닝을 통해 얻어진 염기서열에 제한효소를 처리하였을 때 예상되는 말단제한절편(T-RF)의 크기를 계산하여 T-RFLP 분석결과와 비교하여 본 결과 δ-Proteobacteria에 속하는 모든 클론들은 갯벌 퇴적물 내에서 가장 높은 피크를 형성하여 본 연구 지역의 주요 미생물 그룹의 하나로 조사되었다(Peak 3 in Fig. 2). 황환원 세균은 황산염(SCf-)을 전자수용체로 이용한 혐기적 호흡을 통해 알칸, 톨루엔, 벤젠, PAHs등을 포함하는 다양한 종류의 유기물을 분해하는 능력을 가지고 있어 해양 퇴적 환경에서 중요한 그룹으로 인식되어 왔다(5, 12, 19, 32).
- 4), 4개의 주요 그룹으로 묶였다(Table 1). 특히 Desulfobulbaceae 그 룹과 Desulfuromonas 그룹에 많은 클론들이 포함되었고(Fig. 7), 그 중 가장 큰 그룹인 Desulfobulbaceae 에는 총 17개의 클론이 포함되었다. 이들은 일반적으로 해양 혐기환경에 널리 나타나는 그룹으로, 전자수용체인 황산염이나 황이 없는 환경에서는 여러가지 유기산들을 발효시켜 성장하기도 하는 미생물 그룹으로 알려져 있다(33).
- 16S rDNA 클론들의 계통 분석 결과 강화도 갯벌 퇴적물 내에는 대사과정에 황화물을 이용하는 미생물 그룹이 많이 나타나는 것으로 조사되었다. 특히, y-Pmteobacteria 그룹 내의 황산화 세균과 8-Proteobacteria 그룹 내의 황산염 및 황환원 세균이 전체 16S rDNA 클론 중 37.2%(21.5%, 15.7%)의 높은 비율을 차지하여 중요한 기능을 담당하는 것으로 인식되었다. 해양 환경에서 황산염의 농도는 약 25~28mM로 높게 나타나기 때문에 이를 전자수용체로 이용하는 황산염 환원 세균 그룹이 높은 비율로 나타나고(5), 이 황산염 환원 세균의 호흡작용에 의해 환원된 형태의 황화합물 또한 높게 나타나서 이를 전자공여체로 이용하는 황산화 세균 그룹 또한 많이 나타나는 것으로 여겨진다.
- 2). 표층(0-1 cm 깊이)에서는 다양한 크기의 T-RFs가 고른 분포를 보였고, 저층(6-7 cm 깊이)에서는 특정 크기의 T-RFs가 상대적으로 매우 높은 비율로 나타나 특정 그룹이 우점하고 있음을 보여주었다. T-RFLP 분석 결과와 클로닝을 통해 얻어진 염기서열에 제한효소를 처리하였을 때 예상되는 말단제한절편(T-RF)의 크기를 계산하여 비교하였다.
- T-RFLP 분석 결과와 클로닝을 통해 얻어진 염기서열에 제한효소를 처리하였을 때 예상되는 말단제한절편(T-RF)의 크기를 계산하여 비교하였다. 표층에서 가장 높게 나타나는 1번 피크(Fig. 2)는 60(±2) bp 정도의 크기로 주로 γ-Proteobacteria와 일부 a-Proteobacteria가 이 크기의 T-RF를 형성하였고, 3번 피크는 93(+2) bp 정도의 크기로 모든 8-Pmteobacteriae\- 일부 green nonsulfur bacteria들이 속한 것으로 나타났다. 또한 5번 피크의 크기는 약 211 bp 정도로 y- Proteobacteria와 green nonsulfur bacteria가, 8번 피크는 약 341 bp로 a-Proteobacteria 그룹의 일부가이 크기의 T-RF를 형성하는 것으로 나타났다.
- 한편 많은 수의 클론들이 외양 심해 퇴적물에서 조사된 클론들과 높은 유사성을 보였으며, 호냉성 세균과도 높은 유사성을 보였다. 특히 y-Proteobacteria 그룹과 Acidobacteria/Holophaga 그룹 그리고 green nonsulfur bacteria 그룹들이 외양 심해 클론들이 형성하는 그룹들과 유사하였다.
후속연구
- Finlay(14)는 미생물들의 높은 개체수, 짧은 세대시간(generation time), 작은 크기, 그리고 높은 dispersal rates(분산율)는 미생물 군집의 지역적 특유성을 소멸시키며, 지리적으로 발생하는 커다란 차이를 무시할 수 있게 한다고 주장하였다. 따라서 우리나라 갯벌 환경에 서식하는 미생물의 실제적인 분포를 보다 정확히 알기 위해서는 더 많은 개수의 클론 분석이 나 더 나은 분석 방법(예; specific oligonucleotide를 이용한 군집 분석)이 필요하다는 결론에 이른다(8).
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