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문제 정의
- 본 연구의 목표는 발효식품인 된장의 섭취가 Helicobacter pylori에 의한 감염의 억제에 효과가 있음을 확인하는 데 있다. 된장 추출물과 된장으로부터 분리된 균이 H.
- 본 연구의 목표는 우리나라 전통 발효식품인 된장의 H. pylori에 대한 억제 효과와 된장의 섭취가 H. pylori성 위염 치료에 대한효과를 밝히는 데 있다. 재래식 방법으로 제조된 된장 추출물과 이 된장으로부터 분리된 미생물의 H.
제안 방법
- pylori kit에 의한 감염의 유무와 감염 강도를 판정하기 위해 요소호기검사를 실시하였다. 13C-urea 75 mg을 물 100 ml에 용해 시 켜 섭취하게 한 후 자연호흡으로 호기를 채취하여 Helikit (Isodiagnostika, Canada) 와 HeliView (Medichems, Korea)를 이용하여 요소호기 검사 실시하였다. 13c-urea의 섭취 전(To)과 섭취 30분 후(Ti)의 13CO2의 농도 변화 (P=31CO2 (Ti-T0))가 4% 이상일 때 양성으로 판정하였다.
- 13C-urea 75 mg을 물 100 ml에 용해 시 켜 섭취하게 한 후 자연호흡으로 호기를 채취하여 Helikit (Isodiagnostika, Canada) 와 HeliView (Medichems, Korea)를 이용하여 요소호기 검사 실시하였다. 13c-urea의 섭취 전(To)과 섭취 30분 후(Ti)의 13CO2의 농도 변화 (P=31CO2 (Ti-T0))가 4% 이상일 때 양성으로 판정하였다.
- H. pylori kit에 의한 감염의 유무와 감염 강도를 판정하기 위해 요소호기검사를 실시하였다. 13C-urea 75 mg을 물 100 ml에 용해 시 켜 섭취하게 한 후 자연호흡으로 호기를 채취하여 Helikit (Isodiagnostika, Canada) 와 HeliView (Medichems, Korea)를 이용하여 요소호기 검사 실시하였다.
- 1-d)과 urease, catalase 그리고 oxidase 반응을 조사하였다. H. pylori로의 최종 판정은 H. pylori의 urease A 유전자 (ureA)의 존재를 PCR 증폭을 통해 확인하였다. DNA 분리는 Pitcher et.
- ureA 유전자 증폭을 위해 primer로는 HEPY1 (2811-2840; 5Z-GCG GCT GAA TTG ATG CAA GAA GG3) 와 HYPY2 (3310-3333; 5'-GCC ATG AAA ACC ACG CTC TTT AGC-3')를 사용하였다. PCR을 위한 reaction mixture의 구성은 template DNA 10 ng, 200 |iM dNTP, 10 mM Tris-HQ (pH 9.0), 40 mM KC1, 0.15 mM MgQz, 3 mM MgSOg 20 pg BSA, 1U Taq polymer- ase 그리고 HEPY1 와 HEPY2 각각 0.5 ㎛로 총부피를 50 μl로 하였다. PCR증폭은 GenAmp™ PCR System 9700 (Applied Biosystem)을 이용하였으며 전 변성은 94℃에서 3분간 수행하였고, 변성 (94℃, 30초), 복원 (50℃, 30초), 신장 (72℃, 40초) 반응을 총 30회 반복하고 후신장 (72℃, 10분)을수행하였다.
- 5 ㎛로 총부피를 50 μl로 하였다. PCR증폭은 GenAmp™ PCR System 9700 (Applied Biosystem)을 이용하였으며 전 변성은 94℃에서 3분간 수행하였고, 변성 (94℃, 30초), 복원 (50℃, 30초), 신장 (72℃, 40초) 반응을 총 30회 반복하고 후신장 (72℃, 10분)을수행하였다. PCR 산물은 1% agarose ge에 전기영동 한후 517 bp 크기를 확인하였다.
- 이때 곰팡이와 그람 양성균의 생장을 억제하기 위해 배지에 vanco mycin (10 mg/1), amphotericin B (10 mg/1), nalidixic acid (5 mg/1)를 첨가하였다[23].검체가 도 말된 배지를 37℃에서 10%의 CO2 농도가 유지된 미호기 성 상태에서 7일간 배 양하였다. 분리균은 brain heart infusion egg yolk agar (BHIE)에계대 배양하여 붉은 집락을 형성시켰다(Fig.
- 성별로는 남자 9명, 여자 17명이었다. 대상자의 된장섭취는 2003년 8월 18일부터 6주간에 걸쳐 실시하였다. 제1군(14명)은 하루 1회 5 g씩 3회 (1일 총 15 g) 를, 제2군(12명)은 1회 10 g 씩 3회(1일 총 30 g) 를섭취하였다.
- 대상자들의 된장섭취 여부는 매일 확인하였다. 된장의 섭취가 H. pylori에 의한 감염 강도에 미치는 효과는 된장 섭취 전후 실시하였다.
- pylori의 생장을 억제하였다. 된장의 섭취효과를 측정하기 위해 무자각 증상의 H. pylori 보균자를 대상으로 실시하였으며, H. pylori 감염 농도는 A13C (TrTo)값(P)으로 판정하였다. 1일 30 g (10 gx3회)씩 6주간 섭취한 지원자들의 섭취 전·후의 P값은 58 에서 28로 감소하여 H.
- pylori의 감염과 위염의 위험을 줄이는데 효과적이라는 보고 들[1, 12, 19]의 경우는 일상적인 식사 습관에 따른 자료를 임상적 소견과 비교 분석한 자료들이다. 본 연구는 위장관 증상은 없으나 H. pylori에 감염된 지원자들이 일정 기간 규칙적으로 된장을 섭취한 후 요소호기 검사를 통해 감염 강도를 간접적으로 측정하였다. 즉, 된장의 섭취가 H.
- 배양하였다. 분리된 세균의 동정은 Vitek card (BAC) (bioMerieux, France)으로 1차 동정하고, 동정되지 않는 세균의 경우 API 50CHB와 API 50CHL (bioMerieux, France) 를 이용하여 동정하였다.
- pylo- n.성 위염 치료에 대한 효과는 요소호기 검사를 통해 판정하였다.
- 1y).세균 집락을 그람염색(Fig. 1-d)과 urease, catalase 그리고 oxidase 반응을 조사하였다. H.
- 보균자를 선발하기 위해 혈청학적 검사를 통해 양성반응을 보인 42명을 2차 선발하였다. 실험에 대한 목적과 방법 등을 설명한 후 동의를 얻은 후 혈청 분석과 호기 검사를 실시하였다. 실험 대상자의 혈청 분석은 Rapid EASY TEST H.
- 멸균된 여과지 디스크에 50-1,000 μ1의 상층액을 흡수시켜 60℃ 건조기에서 24시간 건조시켰다. 우혈청(10%)이 첨가된 Mueller-Hinton agar (BBL)에 분리균과 대조균을 각각 도말한 후 건조된 여과지를 접종하여 37℃에서 5일간 배양한 후 한천 확산 방법으로 억제환의 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로는 0.
- 우혈청(10%)이 첨가된 Mueller-Hinton agar (BBL)에 분리균과 대조균을 각각 도말한 후 건조된 여과지를 접종하여 37℃에서 5일간 배양한 후 한천 확산 방법으로 억제환의 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로는 0.85% 생리식 염수 1 ml와 10% formalin 100 μl를 동일한 방법으로 각각 여과지에 흡수시켜 사용하였다.
- pylori성 위염 치료에 대한효과를 밝히는 데 있다. 재래식 방법으로 제조된 된장 추출물과 이 된장으로부터 분리된 미생물의 H. pylori에 대한 항균 능력을 분석하였다. 그리고 된장의 섭취 시 H.
- 재래식 방법으로 제조된 된장에 존재하는 세균의 분리를 위한 배지로는 각각 5% 혈액을 첨가한 tryptic soy agar (TSA) 와 nutrient agar (NA), Sabourand dextrose agar (SDA)를 사용하였으며 평판도말법을 이용하여 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 분리된 세균의 동정은 Vitek card (BAC) (bioMerieux, France)으로 1차 동정하고, 동정되지 않는 세균의 경우 API 50CHB와 API 50CHL (bioMerieux, France) 를 이용하여 동정하였다.
- 대상자의 된장섭취는 2003년 8월 18일부터 6주간에 걸쳐 실시하였다. 제1군(14명)은 하루 1회 5 g씩 3회 (1일 총 15 g) 를, 제2군(12명)은 1회 10 g 씩 3회(1일 총 30 g) 를섭취하였다. 된장섭취는 식사 시야채와 동시에 섭취하도록 하였다.
- 멸균된 여과지 디스크에 흡수시켰다. 환자의 위 점막으로부터 분리된 H.pylori와 대조균주에 대한 생장 억제능은 위와 동일한 방법으로 실시하였다.
대상 데이터
- pylori kit (Asan, Korea)와 Plato 장비(Rosys, Switzerland)를 이용한 EIA 방법[2이을 이용하였다. 2차 대상자에 대해 "C-요소 호기검사를 실시하여 A13C fTi-To) 값(P)이 38 이상자인 26명을 최종 실험 대상자로 선발하였다. 26명의 대상자는 20대 23명, 30대 2명, 40대 1명 이 었다.
- 2차 대상자에 대해 "C-요소 호기검사를 실시하여 A13C fTi-To) 값(P)이 38 이상자인 26명을 최종 실험 대상자로 선발하였다. 26명의 대상자는 20대 23명, 30대 2명, 40대 1명 이 었다. 성별로는 남자 9명, 여자 17명이었다.
- [2기의 방법으로 추출하였다. ureA 유전자 증폭을 위해 primer로는 HEPY1 (2811-2840; 5Z-GCG GCT GAA TTG ATG CAA GAA GG3) 와 HYPY2 (3310-3333; 5'-GCC ATG AAA ACC ACG CTC TTT AGC-3')를 사용하였다. PCR을 위한 reaction mixture의 구성은 template DNA 10 ng, 200 |iM dNTP, 10 mM Tris-HQ (pH 9.
- 된장 추출물과 된장으로부터 분리된 균이 H. pylori의 생장을 억제시키는지 여부를 표준균주인 H. pylori ATCC 26695와 위궤양 환자의 조직으로부터 분리한 H. pylori 균주를 대상으로 실시하였다. 된장 추출물과 된장으로부터 분리된 대부분의 세균은 H.
- 보균자를 선발하기 위해 혈청학적 검사를 통해 양성반응을 보인 42명을 2차 선발하였다. 실험에 대한 목적과 방법 등을 설명한 후 동의를 얻은 후 혈청 분석과 호기 검사를 실시하였다.
- 본 연구에 사용된 된장은 순수한국산 콩과 천일염을 사용하고 방부제를 첨가하지 않은 기존의 재래식 제조과정으로 제조된 제품을 선정하여 실험하였다. 된장 25 g을 멸균 증류수 20 ml에 희석하여 잘 섞은 후원심분리(3, 000rpm, 15분) 시 켰다.
- 26명의 대상자는 20대 23명, 30대 2명, 40대 1명 이 었다. 성별로는 남자 9명, 여자 17명이었다. 대상자의 된장섭취는 2003년 8월 18일부터 6주간에 걸쳐 실시하였다.
- l-a, b). 세균의 분리는 우혈청(100 ml/1)이 첨가된 Mueller-Hinton agar 배지 (BBL)를 이용하였다. 이때 곰팡이와 그람 양성균의 생장을 억제하기 위해 배지에 vanco mycin (10 mg/1), amphotericin B (10 mg/1), nalidixic acid (5 mg/1)를 첨가하였다[23].
- 위장에 관련된 증상이 없는 성인 남녀 100명의 자원자를 선정하였다. 보균자를 선발하기 위해 혈청학적 검사를 통해 양성반응을 보인 42명을 2차 선발하였다.
- PCR 산물은 1% agarose ge에 전기영동 한후 517 bp 크기를 확인하였다. 이때 대조균으로는 H. pylori ATCC 26695를 사용하였다.
이론/모형
- 실험에 대한 목적과 방법 등을 설명한 후 동의를 얻은 후 혈청 분석과 호기 검사를 실시하였다. 실험 대상자의 혈청 분석은 Rapid EASY TEST H. pylori kit (Asan, Korea)와 Plato 장비(Rosys, Switzerland)를 이용한 EIA 방법[2이을 이용하였다. 2차 대상자에 대해 "C-요소 호기검사를 실시하여 A13C fTi-To) 값(P)이 38 이상자인 26명을 최종 실험 대상자로 선발하였다.
성능/효과
- 1일 15 g의 된장을 섭취한 자원자의 경우 13C-요소 호기 검사 결과된장 섭취전의 P=38-80으로 평균 P=59 이었으며, 된장 섭취 후의 P=30-68으로 평균 P=50으로서 약 15.3%의 감소 효과가 있었다. 1일 30 g의 된장을 섭취한 자원자의 경우 섭취 전의 P=40-82으로 평균 P=58이었으며, 된장섭취 후의 P=1440으로 평균 P=28로서 약 51.
- pylori 감염 농도는 A13C (TrTo)값(P)으로 판정하였다. 1일 30 g (10 gx3회)씩 6주간 섭취한 지원자들의 섭취 전·후의 P값은 58 에서 28로 감소하여 H. pylorie 밀도가 낮아졌음을 입증하였다. 즉, 된장이 위 점막에서 H.
- 3%의 감소 효과가 있었다. 1일 30 g의 된장을 섭취한 자원자의 경우 섭취 전의 P=40-82으로 평균 P=58이었으며, 된장섭취 후의 P=1440으로 평균 P=28로서 약 51.7%의 감소 효과가 있었다(Fig. 4).
- Bacillus sphaericus, B. licheniformis, B. megaterium, B. stear- othermophilus, B. firmus와 B. lentuse: 각각 19-32 mm의 억 제 환을 나타냈으며, Alcaligenes faecalis, Acinetobacter Iwoffii/ju- nii, Morganella morgani& 18-26 mm의 억제환을 나타냈다. 또한 미동정된 세균 중 6개 균주도 평균 24 mm의 억제 환을 나타내 총 69개 분리균의 액체 배양액이 H.
- 된 장 추출물은 H. pylori의 생장을 억제하였으며, H. pylori ATCC 26695와 분리균에 대한 억제에는 큰 차이가 나타나지 않았다. 음성대조군으로 사용한 생리식염수와 formalin에 의해서는 억제환이 나타나지 않아(Fig.
- 된 장으로부터 분리된 세균의 95균주를 Vitek card (BAQ GNI)Z API 50CHB, API 50CHL을 이용하여 동정한 결과 그람양성 간균은 Bacillus 속 10종, 그람 음성 간균은 Alcaligenes 속, Adnetobacter 속 그리고 Morganella 속이 각각 1종 동정되었으며, 9개의 세균은 동정되지 않았다(Table 1). Bacillus sphaericus, B.
- lentuse: 각각 19-32 mm의 억 제 환을 나타냈으며, Alcaligenes faecalis, Acinetobacter Iwoffii/ju- nii, Morganella morgani& 18-26 mm의 억제환을 나타냈다. 또한 미동정된 세균 중 6개 균주도 평균 24 mm의 억제 환을 나타내 총 69개 분리균의 액체 배양액이 H. pylori의 생장을 억제하였다(Table l)(Fig. 3-d). 즉, 된장의 발효 과정에 관여하는 많은 세균들의 대 사산물이 H.
- 1-c).분리된 균은 생리적 시험과 염색을 통해 확인하였으며 (Fig. l-d)z H. pylori에 특이적인 ureA 유전자의 DNA 절편을 확인하여 H. pylori로 동정하였다(Fig. 2).
- pylori ATCC 26695와 분리균에 대한 억제에는 큰 차이가 나타나지 않았다. 음성대조군으로 사용한 생리식염수와 formalin에 의해서는 억제환이 나타나지 않아(Fig. 3-a) 억제환은 된장 추출물에 의한 것임을 확인하였다. 된장 추출물 100 μ1가 홉수된 여과지의 억제환은 직경 14 mm이며 농도에 따라 억제환의 크기가 증가하여 500 μ1 이상 흡수된 여과지는 50 mm 이상의 억제환을 형성하였다(Fig.
- pylori 의 감염의 위험을 줄이는 동시에 감염 세균의 밀도를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다. 이상의 결과로부터, 된장의 발효 과정에 관여하는 미생물의 대사산물이 H. pylori의 생장을 억제할 수 있으며, 된장의 섭취가 H. pylori에 의한 감염의 치료에 보조적인 요법으로 가능하다고 할 수 있다.
- 조직검체를 우혈청과 vancomycin, amphotericin B 그리고 nalidixic acid가 첨가된 Miller-Hinton agar 배지에서 배양한 결과 이슬방울 모양의 특징적인 무색 투명한 집락 이형성 되었다(Fig. 1-c).분리된 균은 생리적 시험과 염색을 통해 확인하였으며 (Fig.
- 3-d). 즉, 된장의 발효 과정에 관여하는 많은 세균들의 대 사산물이 H. pylori의 생장을 억제하는 것을 확인하였다. 대사산물 중 어떠한 성분이 H.
- pylori에 감염된 지원자들이 일정 기간 규칙적으로 된장을 섭취한 후 요소호기 검사를 통해 감염 강도를 간접적으로 측정하였다. 즉, 된장의 섭취가 H. pylori 의 감염의 위험을 줄이는 동시에 감염 세균의 밀도를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다. 이상의 결과로부터, 된장의 발효 과정에 관여하는 미생물의 대사산물이 H.
- pylorie 밀도가 낮아졌음을 입증하였다. 즉, 된장이 위 점막에서 H. pylori의 생장을 억제하는 것을 확인하였다.
- 3-b, c). 즉, 전통적 방법으로 제조된 된장의 물 추출물은 H. pylori의 생장을 억제함을 확인하였다.
후속연구
- pylori의 생장을 억제하는 것을 확인하였다. 대사산물 중 어떠한 성분이 H. pylori의 생장 억제물질로 작용하는지에 대한 연구가 더 필요하다고 사료된다.
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