흰가루병 생물적 방제용 중복기생균 Ampelomyces quisqualis 94013의 대량배양 Mass Cultivation of A Hyperparasite, Ampelomyces quisqualis 94013 for Biological Control of Powdery Mildew원문보기
Ampelomyces quisqualis 94013(AQ94013)는 오이 흰가루병에 대한 생물적 방제를 위하여 효과적인 기생균으로 선발되었다. AQ94013균의 대량배양기술을 개발하기 위하여 보리쌀, 쌀, 기장, 현미, 수수, 볍씨의 6종의 곡류를 이용하여 실험하였다. 그 중에서 보리쌀은 AQ94013의 생장과 포자형성에 가장 좋은 배지였다. 대량배양의 최적온도는 $25^{\circ}C$이였으며, $20^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$ 순이었다. 암배양 보다 광을 하루에 12시간 주기로 조사한 보리쌀배지에서 포자수가 적어서 광은 AQ94013의 포자형성을 억제하였다. 그러나 $30^{\circ}C$에서 형성된 포자는 오이 흰가루병균(Sphaerotheca fusca)에 대하여 30일간 기생력을 유지하였다. 보리 AQ94013의 배양방법은 30l-발효조를 이용하여 쌀분말(40g/l)을 첨가한 보리쌀분말액체배지에서 $25^{\circ}C$에서 5일간 암배양이 포자대량배양에 매우 효과적이었다.
Ampelomyces quisqualis 94013(AQ94013)는 오이 흰가루병에 대한 생물적 방제를 위하여 효과적인 기생균으로 선발되었다. AQ94013균의 대량배양기술을 개발하기 위하여 보리쌀, 쌀, 기장, 현미, 수수, 볍씨의 6종의 곡류를 이용하여 실험하였다. 그 중에서 보리쌀은 AQ94013의 생장과 포자형성에 가장 좋은 배지였다. 대량배양의 최적온도는 $25^{\circ}C$이였으며, $20^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$ 순이었다. 암배양 보다 광을 하루에 12시간 주기로 조사한 보리쌀배지에서 포자수가 적어서 광은 AQ94013의 포자형성을 억제하였다. 그러나 $30^{\circ}C$에서 형성된 포자는 오이 흰가루병균(Sphaerotheca fusca)에 대하여 30일간 기생력을 유지하였다. 보리 AQ94013의 배양방법은 30l-발효조를 이용하여 쌀분말(40g/l)을 첨가한 보리쌀분말액체배지에서 $25^{\circ}C$에서 5일간 암배양이 포자대량배양에 매우 효과적이었다.
An isolate of Ampelomyces quisqualis 94013(AQ94013) was selected as an effective agent for biological control against cucumber powdery mildew. In order to develop mass production technique, six cereal media made with barley, rice, mille and brown rice, sorghumand rice seed were tested. Among them, b...
An isolate of Ampelomyces quisqualis 94013(AQ94013) was selected as an effective agent for biological control against cucumber powdery mildew. In order to develop mass production technique, six cereal media made with barley, rice, mille and brown rice, sorghumand rice seed were tested. Among them, barley medium was the best for the growth and conidial production of AQ94013. Optimum temperature for the mass production of AQ94013 was $25^{\circ}C$ and followed by $20^{\circ}C$ and $30^{\circ}C$. Light radiation inhibited conidial production of AQ94013 since number of conidia formed on barely medium under continuous light or 12 hrs alternative light were much less than cultured in darkness. Tthe conidia produced on the medium at $30^{\circ}C$ maintained the parasitic ability to Sphaerotheca fusca for 30 days. A culture method of AQ94013 in barley liquid medium with adding barely power(40 g/l) in darkness for five days at $25^{\circ}C$using a 30 l-fermenter was very effective for mass production of conidia.
An isolate of Ampelomyces quisqualis 94013(AQ94013) was selected as an effective agent for biological control against cucumber powdery mildew. In order to develop mass production technique, six cereal media made with barley, rice, mille and brown rice, sorghumand rice seed were tested. Among them, barley medium was the best for the growth and conidial production of AQ94013. Optimum temperature for the mass production of AQ94013 was $25^{\circ}C$ and followed by $20^{\circ}C$ and $30^{\circ}C$. Light radiation inhibited conidial production of AQ94013 since number of conidia formed on barely medium under continuous light or 12 hrs alternative light were much less than cultured in darkness. Tthe conidia produced on the medium at $30^{\circ}C$ maintained the parasitic ability to Sphaerotheca fusca for 30 days. A culture method of AQ94013 in barley liquid medium with adding barely power(40 g/l) in darkness for five days at $25^{\circ}C$using a 30 l-fermenter was very effective for mass production of conidia.
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문제 정의
대량배양 시 보다 손쉬운 포자수거를 위해서는 고체배지보다 액체배양이 유리하기 때문에 효과적인 배양조건을 찾아보고자 하였다. 보리쌀액체배지를 보리쌀분말의 양을 다르게 넣고 제조하여 AQ94013의 포자현탁액 (5.
가설 설정
Measurement was made after 15 days' incubation at 25℃ in darkness. b)In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 1% level by DMRT.
0><107/m/) of AQ94013 was inoculated on barley medium and cultured for ten days at 30℃. b)Altemating cycles of 12 hr fluorescent light and 12 hr darkness. c, In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 1 % level by DMRT.
Measurement was made after 15 days' incubation at 25℃ in darkness. b)In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 1% level by DMRT.
0xl06/mZ) of AQ94013 was inoculated in each 100 mZ-barely liquid medium in 500 mZ-flasks and shaking-cultured by 150 rpm at 25℃. b)In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by DMRT.
3xl07/m/) of AQ94013 was inoculated on each barely medium in 500 m/-flasks. c) In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by DMRT.
b)Altemating cycles of 12 hr fluorescent light and 12 hr darkness. c, In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 1 % level by DMRT.
제안 방법
배양. 60 mesh체로 거른 보리쌀분말을 1 /당 20 g의 비율로 첨가하여 12/의 액체배지를 제조하여 30/발효조(한국발효기, KF-30L)에 넣은 다음 멸균후, pH를 6.5로 조절하고, 멸균한 배지에 포자현탁액(1.0X IO**포자/mZ)을 220 ml 넣은 다음, 25℃에서 (산소량: 3 //min, 200 rpm) 7일간 배양하였다. 그 후 20 m/의 배양물을 채취하여 플라스크 배양에서와 같은 방법으로 포자수를 조사하였다.
5 cm 크기로 잘라내어 직경 9 cm 의 유리페트리디쉬에 살균수를 적신 여과지 3매를 깔고, 잘라낸 오이잎을 넣었다. AQ94013균주를 처리한 오이잎 절편을 샤레에 4매씩 균주당 3 페트리디쉬씩 처리한 다음, 25℃항온기에서 형광등을 14시간 주기로 비추면서 처리 8일 후 해부현미경(40배)하에서 흰가루병의 병반면적율을 조사하였다.
AQ94013의 발효조 배양. AQ94013의 실용화를 위하여 301발효조(한국발효기)가 이용하여 최적 pH 6.5로 조절한 보리액체배지에서 AQ94013을 배양일수별로 포자형성 량을 조사하였다. 배양 4일 후에 배지의 색이 흑갈색으로 변하면서 분생포자각이 성숙되기 시작하여 5.
0X IO**포자/mZ)을 220 ml 넣은 다음, 25℃에서 (산소량: 3 //min, 200 rpm) 7일간 배양하였다. 그 후 20 m/의 배양물을 채취하여 플라스크 배양에서와 같은 방법으로 포자수를 조사하였다.
8 mm 밖에 생장하지 못할 정도로 생육이 매우 느린 균이다(Lee 등, 2005). 그리고 이 균을 배지에 치상한 부분과 31일 후에 자란부분에서 분생포자각이 형성되지만 치상부위의 분생포자각내의 분생포자(병포자)는 노화되어서 흰가루병균에 기생력이 매우 저조하여 실내실험을 비롯한 포장실험 등에 필요한 신선하며 기생력이 높은 A. quisqualis 94013균주의 대량 배양이 필요하여 보리를 비롯한 8종의 곡류를 사용하였고, 추가로 배양온도별 포자형성과 형성된 포자의 오이 흰가루병균에 대한 기생력을 조사하였다. 대량배양용 유기물로 선발한 보리쌀을 분말하여 첨가량별 액체배지를 제조하여 플라스크 및 발효조에서 배양하여 적정 첨가량을 구명하였다.
quisqualis 94013균주의 대량 배양이 필요하여 보리를 비롯한 8종의 곡류를 사용하였고, 추가로 배양온도별 포자형성과 형성된 포자의 오이 흰가루병균에 대한 기생력을 조사하였다. 대량배양용 유기물로 선발한 보리쌀을 분말하여 첨가량별 액체배지를 제조하여 플라스크 및 발효조에서 배양하여 적정 첨가량을 구명하였다.
영향 조사. 멸균한 보리쌀 100g이 담긴 500ml 삼각플라스크에 공시 균주의 포자현탁액 (2.0X107 포자/mZ)을 Im/씩 접종하여 배양온도를 3UC로 하고 암처리와 형광등(20W)이 12시간 주기로 조사되는 항온기에서 12일 배양 후 각각 형성된 포자수를 조사하였다.
AQ94013의 포자형성량 조사. 배양하여 포자형성한 곡류를 1 g씩 3반복으로 정 량하여 10 m/ 멸균수가 담긴 시험관에 넣고 30분간 진탕 후 hemacytometer를 이용하여 처리 구당 5반복씩 조사하였다.
보리쌀 배지에서의 배양온도 및 배양기간별 포자형성량을 조사하기 위하여 멸균한 보리쌀 100 g이 담긴 500 ml 삼각플라스크에 공시균주의 포자현탁액(1.3XIO'포자/mZ)을 Im/씩 접종하여 20, 25와 30℃(3의 항온기에서 각각 7일, 10일, 14일간 배양 후에 형성된 포자수를 조사하였다.
보리쌀곡립배지에서 배양한 포자의 흰가루병균에 대한기생력 평가. 보리쌀배지에서 배양 온도 및 기간별로 배양된 배 양물로부터 포자현탁액 (6.
평가. 보리쌀배지에서 배양 온도 및 기간별로 배양된 배 양물로부터 포자현탁액 (6.0X106 포자/m/)을 조제하여 오이 흰가루병균에 대한 기생력을 검정하였다. 오이 재배 는 온실에서 바로커 상토와 원예 용장기 육묘용 상토를 l:l(v/v) 비율로 혼합하여 직경 10 cm 포트에 담은 후 은성백다다기오이를 파종하여 제 3 본엽 출아 시기에 이병 된 식물체로부터 수거한 흰가루병균(Sphaerotheca fused)을 접종하여 7일 후 병반이 형성된 오이식물체에 중복기생균의 포자현탁액 농도(1X106포자/mZ)로 분무처리한 다음, 제 1 본엽을 직경 2.
AQ94013의 액체배양시 보리쌀분말 적정농도구명. 보리쌀분말을 물 1 1당 10g, 20g, 40g, 60g, 80 비율로 250 m/ 삼각플라스크에 100 m/씩 넣은 다음, 멸균 후포자 현탁액 (3.0X105 포자/m/)을 lm/씩 접종하여 25℃(2에서 150rpm으로 10일간 진탕배양후 포자수를 hemacytometer로 조사하였다. 피펫을 사용하여 보리쌀 분말 액체배지의 배양물 5 ml를 채취하여 균질기로 마쇄한 다음, 1를 9 ml 멸균수가 담긴 시 험관에 희석 하여 처리 당 5 반복으로 포자수를 조사하였다.
쌀, 보리쌀 등 6종의 곡류배지를 공시하여 250 mZ 삼각플라스크에 곡류를 50 g씩 담고 멸균수를 20mZ를 첨가하여 2회 멸균 후 AQ94013의 포자 현탁액(7.0Xl06/m/)을 3씩 접종한 다음, 24<>C 배양기에서 15일간 배양 후 형성된 포자수를 조사하였다.
0X106 포자/m/)을 조제하여 오이 흰가루병균에 대한 기생력을 검정하였다. 오이 재배 는 온실에서 바로커 상토와 원예 용장기 육묘용 상토를 l:l(v/v) 비율로 혼합하여 직경 10 cm 포트에 담은 후 은성백다다기오이를 파종하여 제 3 본엽 출아 시기에 이병 된 식물체로부터 수거한 흰가루병균(Sphaerotheca fused)을 접종하여 7일 후 병반이 형성된 오이식물체에 중복기생균의 포자현탁액 농도(1X106포자/mZ)로 분무처리한 다음, 제 1 본엽을 직경 2.5 cm 크기로 잘라내어 직경 9 cm 의 유리페트리디쉬에 살균수를 적신 여과지 3매를 깔고, 잘라낸 오이잎을 넣었다. AQ94013균주를 처리한 오이잎 절편을 샤레에 4매씩 균주당 3 페트리디쉬씩 처리한 다음, 25℃항온기에서 형광등을 14시간 주기로 비추면서 처리 8일 후 해부현미경(40배)하에서 흰가루병의 병반면적율을 조사하였다.
AQ94013의 접종 적정농도 구명. 접종농도와 배양온도별 포자형성량을 조사하기 위하여 보리쌀배지에 공시균주의 포자현탁액을 I X 103 포자/m/부터 1X107 S-A/ml 까지 조절하여 5단계로 1 m/씩 접종한 다음, 20℃(2, 25℃, 30℃(2의 항온기에서 각각 14일간 배양 후에 형성된 포자수를 조사하였다.
처리한 4 quisqualis 균에 의해서 감염된 오이 흰 가루 병균을 자세히 관찰하면 흰가루병균의 분생자경이 비정상적으로 구부러져 있으며 분생자경의 밑부분에 A. quisqualis 균의 갈색내지 황백색의 분생포자각이 형성되어 흰 가루 병균의 균총이 갈색 내지 흑갈색으로 나타나는데 흰 가루 병균의 균총이 갈변한 면적을 제외한 순수 흰가루병 반의 면적을 조사하였다.
0X105 포자/m/)을 lm/씩 접종하여 25℃(2에서 150rpm으로 10일간 진탕배양후 포자수를 hemacytometer로 조사하였다. 피펫을 사용하여 보리쌀 분말 액체배지의 배양물 5 ml를 채취하여 균질기로 마쇄한 다음, 1를 9 ml 멸균수가 담긴 시 험관에 희석 하여 처리 당 5 반복으로 포자수를 조사하였다.
대상 데이터
AQ94013균의 대량배양기술을 개발하기 위하여 보리쌀, 쌀, 기장, 현미, 수수, 볍씨의 6종의 곡류를 이용하여 실험하였다. 그중에서 보리쌀은 AQ94013의 생장과 포자형성에 가장 좋은 배지였다.
보리쌀분말 배지를 이용한 AQ94013의 발효조 배양. 60 mesh체로 거른 보리쌀분말을 1 /당 20 g의 비율로 첨가하여 12/의 액체배지를 제조하여 30/발효조(한국발효기, KF-30L)에 넣은 다음 멸균후, pH를 6.
보리쌀분말 배지를 이용한 AQ94013의 발효조 배양. 60 mesh체로 거른 보리쌀분말을 1 /당 20 g의 비율로 첨가하여 12/의 액체배지를 제조하여 30/발효조(한국발효기, KF-30L)에 넣은 다음 멸균후, pH를 6.
Ampelomyces quisqualis 94013균주(AQ94013). 팥 흰가루병 균(Sphaerotheca aseo)에서 분리 한 흰가루병 균의 기생균 AQ94013은 오이 흰가루병 방제효과가 가장 우수한 균주로 선발하였으며, 이 AQ94013균주를 PDA 배지에 배양하여 1(TC에 보관하면서 실험에 사용하였다.
성능/효과
배양온도 및 배양일수별 AQ94013의 오이 횐가루병균에 대한 기생성. AQ94013의 보리쌀배지에서의 배양온도 및 배양일수별 오이 흰가루병균에 대한 감염활성을 조사한 결과, 2(TC에서 배양한 경우에는 보통 16일간 포자의 활성이 유지되고, 25P에서 배양한 경우에는 12일까지 포자의 활성이 유지되었다(Table 3), 301에서 배양한 경우에는 포자의 활성이 매우 높고, 30일간 활성이 유지되어 실험에 사용할 때는 3VC에서 배양하여 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다. 포자형성량을 고려할 때는 25℃에서는 다른 온도에서보다 포자형성이 빨리 이루어지나 포자의 활성은 일찍 소실되는 것으로 나타나 25℃ 에서 대량배양 후 포장적용시에는 보통 12일 이내에 사용하는 것이 적합할 것으로 여겨진다.
Ampelomyces quisqualis 94013(AQ94013)는 오이 흰가루병에 대한 생물적 방제를 위하여 효과적인 기생 균으로 선발되었다. AQ94013균의 대량배양기술을 개발하기 위하여 보리쌀, 쌀, 기장, 현미, 수수, 볍씨의 6종의 곡류를 이용하여 실험하였다.
2X108 포자/mZ를 형성하였다(Table 4). 그 후로 배양일수가 경과되면서 포자형성수도 증가되었지만, 경제적인 배양일수는 5일이라고 판단되었다.
그리고 3TC에서는 거의 포자가 형성되지 않았다(데이타 미제시). 또한 배양일수가 늘어나면서 포자형성 량이 증가되었으나, 장기간 배양하였을 때에는 후막포자같은 균사가 형성되었으며 (Fig. 4C), 25℃에서 가장 많은 포자가 형성되어 이 온도가 포자형성을 위한 최적 온도로 생각되었다.
보리쌀 배지를 이용하여 AQ94013을 형광등 조사구와 암 배양 구로 구분하여 30℃에서 10일간 배양 후 포자형성량을 조사한 결과, 광처리구보다 암배양구에서 약 9.5배 정도 많은 포자가 형성되었으며(Table 2), 암배양에서 배양된 보리쌀의 표면에 AQ94013의 분생포자각과 균사체가 형성되어 흑갈색으로 나타내어 형광등 조사구(Fig. 4F-1)에서보다 많은 분생포자각이 형성됨을 알 수 있었다(Fig. 4F-2). 배양온도 및 배양일수별 AQ94013의 오이 횐가루병균에 대한 기생성.
AQ94013의 적정 접종농도. 보리쌀배지에 AQ94013의 포자 접종농도를 1X1O3~1X107으로 조절하여 배양한 결과, 포자의 접종농도가 높을수록 많은 양의 포자가 형성되었다(Fig. 2). 25℃에서 12일간 배양하였을 때, IX IO, 포자 접종구는 4.
대량배양 시 보다 손쉬운 포자수거를 위해서는 고체배지보다 액체배양이 유리하기 때문에 효과적인 배양조건을 찾아보고자 하였다. 보리쌀액체배지를 보리쌀분말의 양을 다르게 넣고 제조하여 AQ94013의 포자현탁액 (5.0X106 포자/m/)을 접종한 다음, 25℃에서 10일간 진탕 배양 후 포자수를 조사한 결과, 보리쌀분말의 함량이 10 g, 20 g, 60 g과 80 g를 첨가한 구에서는 모두 IV포자/m/가 형성되었으나, 보리쌀분말 40g를 첨가한 액체배지에서 1.4X108포자 /m/ 가 형성되어 보리쌀분말의 적정함량이라고 사료되었다(Fig. 3). 보리쌀분말액체배지에서 배양한 AQ94013균주는 균사체내에 원형 내지 타원형의 분생포자각이 형성되었으며(Fig.
곡립배지종류. 보리쌀을 비롯한 6종의 곡립배지에서 AQ94013을 접종한 후 25℃에서 15일간 암상태에서 배양하여 포자형성량을 조사한 결과, 보리쌀배지에서는 2.6X 10개, 쌀배지에서는 2.2X10%의 포자가 형성되었으나 기장, 현미, 수수와 볍씨에서는 보리배지에서 보다 매우 적은 1~i8/g 포자가 형성되었다(Table 1). AQ94013을 보리쌀배지에서 배양한 경우에는 보리쌀 표면이 흑갈색으로 변하였고 확대하여 보면 AQ94013의 흑갈색이 분 생포 자각이 서로 뭉쳐서 형성되어 있었다(Fig.
대 량배양의 최적 온도는 25℃(2이였으며, 20℃와 30℃ 순이었다. 암배양 보다 광을 하루에 12시간 주기로 조사한 보리쌀배지에서 포자수가 적어서 광은 AQ94013의 포자형성을 억제하였다. 그러나 30℃에서 형성된 포자는 오이 흰가루병균(ca)에 대하여 30일간 기생력을 유지하였다.
참고문헌 (18)
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