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문제 정의
- 본 연구는 백합 잎마름병에 관여하는 B. elliptica와 B. ci”erea의 형태적, 배양적 특성을 조사하고, 유전자 염기서열에 기초한 분자계통분석을 하며 병원성을 비교하기 위하여 실시하였다. 한국, 일본, 네덜란드의 주요 백합 재배지역에서 잎마름병에 걸린 백합으로부터 79개의 Botry- tis속 균주를 분리하였다.
- , 2004; Wright, 1928). 본 연구에서는 백합 잎마름병에 관여하는 B. ellip- 位u와 B. 瓦”erea의 형태적, 배양적 특성과 분자생물학적 특성을 비교하고 병원성 검정을 통하여 이들의 병원 학적 중요성을 검토하였다.
- 이 연구는 2003년에서 2005년 사이 국내외에서 수집한 백합 잎마름병균인 B. elliptica와 B. cinerea의 형태적, 배양적 특성을 비교하고 이들의 분류학적 위치를 정립하기 위하여 분자생물학적 기법을 이용한 계통발생학적 유연관계를 분석하였으며, 병원성 검정을 통해 두 종의 백합에 대한 병원성 차이를 명확히 하기 위해서 실시하였다.
제안 방법
- ciHerea)을 확인하였고, 이들은 형태적 특징에 따라 구분한 그룹과 동일하였다. A 그룹은 RPB2와 같이 잎마름병에 걸린 백합에서 분리한 20균주와 B. elliptica BE9714, BE0022 및 BE9610 reference 균주와 Botryotinia squamosa MUCL1107, PRI026이 포함되어 있고, 91% bootstrap 값에 의하여 지지되었으며 1~3개의 염기 치환에 의하여 두 개의 서로 다른 그룹으로 나누어졌다. B 그룹은 잎마름병에 걸린 백합에서 분리한 20균주와 Botryotina fuckeliana B0510, SAS56, SAS405, MUCL87 및 Bc7균주, Botryotinia pelargonii MUCL1152 reference 균주가 포함되어 있고 84% bootstrap 값에 의하여 지지되어진다.
- elliptica는 20 "의 분생포자 현탁액을 취하여 표면소독한 백합의 잎과 꽃잎의 뒷면에 점 접종하였다. B. cinerea는 분생포자 현탁액 접종과 분생포자 현탁액에 PDB를 1:1 비율로 혼합한 분생포자 PDB 현탁액 접종으로 나누어 실시하였다. 균주당 12개의 잎과 6개의 꽃잎을 사용하였고, 접종 후 포화습도를 유지하기 위하여 흡습여지가 깔린 플라스틱 상자(29X22X 12 cm) 에 넣어 20℃ 항온기에 두고 5일 후 병 발생정도를 Table 1의 발병지수에 따라 조사하였다.
- B. elliptica와 B. 에서 각각 6균주씩을 선발하여 병원성 검정 시험에 사용하였다. 병원성 검정은 백합의 잎과 꽃잎을 대상으로 실시하였다.
- RPB2와 HSP60 유전자의 PCR 산물은 Wizard PCR Preps DNA Purification Sys- tem(Promega, Madison, WI, US A)으로 정제하고, 염기서열 판독은 Solgent(대전)에 의뢰하였다. 염기서열 정렬 및 계통분석은 CLUSTAL X(Thompson et al.
- cinerea는 분생포자 현탁액 접종과 분생포자 현탁액에 PDB를 1:1 비율로 혼합한 분생포자 PDB 현탁액 접종으로 나누어 실시하였다. 균주당 12개의 잎과 6개의 꽃잎을 사용하였고, 접종 후 포화습도를 유지하기 위하여 흡습여지가 깔린 플라스틱 상자(29X22X 12 cm) 에 넣어 20℃ 항온기에 두고 5일 후 병 발생정도를 Table 1의 발병지수에 따라 조사하였다.
- , 1991). 그러나 Botrytis rDNA의 ITS 영역은 종간 변이가 적어 충분한 계통발생 학적 정보를 제공하지 못함으로(Holst-Jensen et al., 1998; Nielsen et al., 2001) 본 연구에서는 protein-coding 유전자인 时82와 HSP60을 이용하여 계통발생학적 분석을 실시하였다. B.
- 백합에서 분리한 79균주의 Botrytis를 V-8 juice agar 배지에서 배양한 후 광학현미경을 통하여 분생자경 및 분생포자의 특징을 조사하였던 바 그 특징에 따라 두 그룹으로 나뉘어졌다. 한 그룹(A)의 균주들은 분생자경이 긴실모양이고 중간 중간에 작은 가지를 형성하였고 그곳에 분생포자를 다발로 형성하였다.
- 에서 각각 6균주씩을 선발하여 병원성 검정 시험에 사용하였다. 병원성 검정은 백합의 잎과 꽃잎을 대상으로 실시하였다. 백합 품종은 잎의 접종 실험에는 Georgia와 Raizan, 꽃잎의 접종실험에는 Gelria 를 사용하였다.
- 분리 균주들의 형태적 특징을 조사하기 위해 V-8 juice agar 배지에 접종하고, 근자외선(NUV) 광이 1일 12시간씩 조사되는 20℃ 항온기에서 2~3주간 배양한 후, 분생자경 및 분생포자의 모양, 색, 크기 등을 광학현미경 (X 400) 으로 조사하였고 문헌상의 기술과 비교하였다.
- 모든 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromideS. 염색하였으며, 증폭 여부와 그 크기는 Ikb DNA Ladder (Promega)와의 비교를 통해 관찰하였다.
- 유전자 염기서열 분석에 사용한 40개 균주들의 RPB2 영역을 RPB2-6F와 fRPB2-7cR primer로 증폭하였다. 이들 균주에 대한 RPB2 영역의 PCR 결과 약 740 bp 크기의 증폭산물을 얻었으며 40 균주 모두 거의 동일한 크기를 나타내었다.
- 백합 품종은 잎의 접종 실험에는 Georgia와 Raizan, 꽃잎의 접종실험에는 Gelria 를 사용하였다. 접종실험은 온실에서 생육중인 백합 식물체 중에서 초장이 각각 125 cm, 155 cm인 건전한 Geor- gia와 Raizan의 잎과, 초장이 120 cm인 Gelria의 꽃잎을 따서 실내에서 실시하였다. 접종원을 준비하기 위하여 선발 균주들을 V-8 juice agar 배지에 접종한 후 근자외선광이 1일 12시간씩 조사되는 20℃ 항온기에서 B.
- 접종실험은 온실에서 생육중인 백합 식물체 중에서 초장이 각각 125 cm, 155 cm인 건전한 Geor- gia와 Raizan의 잎과, 초장이 120 cm인 Gelria의 꽃잎을 따서 실내에서 실시하였다. 접종원을 준비하기 위하여 선발 균주들을 V-8 juice agar 배지에 접종한 후 근자외선광이 1일 12시간씩 조사되는 20℃ 항온기에서 B. elliptica 는 3주간, B. cinereal 2주간 배양한 후 형성된 분생포자를 붓으로 모아 멸균 증류수로 분생포자 현탁액(5XI O’ spore/湖을 만들었다. B.
- 산, 제주도와 또한 일본 및 네덜란드의 백합 재배지에서 잎마름병에 이병된 백합의 잎, 꽃, 줄기를 채집하였다. 채집한 병든 조직을 멸균 증류수로 씻어내고 1% NaOCl 용액으로 2분간 표면 소독한 후 2매의 filter paper(No. 2) 가깔린 Petri dish에 옮기고 20℃ 항온기에서 2일간 배양하며 포자형성을 유도하였다. 병든 조직에 형성된 Botrytis 포자에서 단포자를 분리한 후 물한천(WA) 배지에 옮겨 20℃에서 3일간 배양하여 총 79균주를 분리하였다.
- 형태적 특징에 기초하여 동정한 B. elliptica와 B. cinerea 의 배양적 특징을 조사하기 위하여 각 종에서 3 균주씩을 택하여 PDA 배지에 접종, 15, 20, 25, 30℃의 온도에서암상태로 4일간 배양한 후 균총의 직경을 측정하였다.
대상 데이터
- Botrytis 균주를 분리하기 위하여 2003년부터 2005년까지 국내의 백합 재배지인 충남의 서산, 태안, 홍성, 아산, 경기도의 수원, 파주, 강원도의 강릉, 영월, 횡성, 인제, 화천, 전북의 남원, 익산, 정읍, 김제, 전남의 해남, 강진, 부 .산, 제주도와 또한 일본 및 네덜란드의 백합 재배지에서 잎마름병에 이병된 백합의 잎, 꽃, 줄기를 채집하였다.
- 병원성 검정은 백합의 잎과 꽃잎을 대상으로 실시하였다. 백합 품종은 잎의 접종 실험에는 Georgia와 Raizan, 꽃잎의 접종실험에는 Gelria 를 사용하였다. 접종실험은 온실에서 생육중인 백합 식물체 중에서 초장이 각각 125 cm, 155 cm인 건전한 Geor- gia와 Raizan의 잎과, 초장이 120 cm인 Gelria의 꽃잎을 따서 실내에서 실시하였다.
- 부 .산, 제주도와 또한 일본 및 네덜란드의 백합 재배지에서 잎마름병에 이병된 백합의 잎, 꽃, 줄기를 채집하였다. 채집한 병든 조직을 멸균 증류수로 씻어내고 1% NaOCl 용액으로 2분간 표면 소독한 후 2매의 filter paper(No.
- 수집 균주들의 분리 지역을 고려하여 B. elliptica 20균주, B. cinerea 20균주, 종 40개 균주를 선발하여 실험에 사용하였다. 사용 균주들을 PDA 배지에 전접종하여 20℃에서 3일간 배양 후 potato dextrose broth(PDB)에 접종, 20℃에서 3~5일간 정치 배양하여 균사체를 얻었다.
- ci”erea의 형태적, 배양적 특성을 조사하고, 유전자 염기서열에 기초한 분자계통분석을 하며 병원성을 비교하기 위하여 실시하였다. 한국, 일본, 네덜란드의 주요 백합 재배지역에서 잎마름병에 걸린 백합으로부터 79개의 Botry- tis속 균주를 분리하였다. 분생자경과 분생포자의 형태적 특징에 의하여 Botrytis 균들은 2개의 그룹으로 분리되었으며 이들은 각각 B.
데이터처리
- 판독은 Solgent(대전)에 의뢰하였다. 염기서열 정렬 및 계통분석은 CLUSTAL X(Thompson et al., 1997), PHY- DIT program version 3.2(Chun, 1995), PAUP4.0 10b (Swofford, 2002)를 이용하였고 불명확하게 정렬된 부분은 분석에서 제외하였으며, sequence gape missing data 로 처리하였다. Kimura, s 2-parameter model을 사용한 Neighbor-joining 방법을 사용하였고(Kimura, 1980), Parsimony 분석은 1,000 stepwise random addition replicate에 의한 heuristic search와 tree bisection reconnection(TBR) branch-swapping으로 조사하였다(Fitch, 1971).
이론/모형
- 0 10b (Swofford, 2002)를 이용하였고 불명확하게 정렬된 부분은 분석에서 제외하였으며, sequence gape missing data 로 처리하였다. Kimura, s 2-parameter model을 사용한 Neighbor-joining 방법을 사용하였고(Kimura, 1980), Parsimony 분석은 1,000 stepwise random addition replicate에 의한 heuristic search와 tree bisection reconnection(TBR) branch-swapping으로 조사하였다(Fitch, 1971). 각각의 분석은 PAUP*4.
- Kimura, s 2-parameter model을 사용한 Neighbor-joining 방법을 사용하였고(Kimura, 1980), Parsimony 분석은 1,000 stepwise random addition replicate에 의한 heuristic search와 tree bisection reconnection(TBR) branch-swapping으로 조사하였다(Fitch, 1971). 각각의 분석은 PAUP*4.0bl0을 이용한 1,000 bootstrap replications 을 수행하였고, Sclerotinia sderotiorunve Monilinia fmcti- ge”a가 outgroup으로 사용되었다(Holst-Jensen et al., 1998).
성능/효과
- 2 mm의 균사생장을 보였다. 30℃에서는 두 종 모두 균사 생장이 억제되었으며, 특히 B. ellip- tica의 경우 균사생장이 거의 일어나지 않았다(Fig. 2).
- , 2001) 본 연구에서는 protein-coding 유전자인 时82와 HSP60을 이용하여 계통발생학적 분석을 실시하였다. B. elliptica와 B. cinerea 40개 균주와 대조 균 10종이 분석에 사용되었고 RPB2, HSP60 유전자의 염기서열 분석에 의해 사용 균주들은 두 개의 그룹으로 뚜렷하게 구분이 되었다. 이러한 결과는 형태적 특징을 통해 분리된 그룹과 동일하였으며 이는 분자생물학 기법을 이용한 계통발생학적 분석이 전통적인 균류의 분류 방식을 지지해 주는 것을 의미한다.
- B. elliptica와 B. cinerea의 온도별 균사생장을 조사한 결과 B. cinerea가 B. elliptica에 비하여 모든 온도에서 빠른 균사 생장을 보였다. 균사생장 최적온도인 20℃에서 B.
- 모두 동일한 크기를 나타내었다. HSP60 유전자의 염기서 열을 정렬한 결과 977 characters 중 97 charac- ters(9.9%)는 parsimony-uninformative였고, 84 charac-ters(8.6%)는 parsimony-informative였다. 이들 염기서열을 바탕으로 parsimony 분석을 수행한 결과 3개의 most parsimonious 계통수(length = 231, CI = 0.
- cinerea로 동정되었다. RPB2와 HSP60의 염기서열 분석을 통해, 공시균주는 두 그룹으로 구분되었으며 이들은 형태적으로 동정한 그룹과 일치하였다. 포자 현탁액을 이용한 B.
- 9704) 를 얻었고, 모든 계통수에서 A 그룹(B. elliptical* B 그룹 (B. ciHerea)을 확인하였고, 이들은 형태적 특징에 따라 구분한 그룹과 동일하였다. A 그룹은 RPB2와 같이 잎마름병에 걸린 백합에서 분리한 20균주와 B.
- cinerea로 동정되었다. 균사생장 속도는 B. cinerea가 B. ㎛ca에 비해 빨랐으며 이러한 형태적, 배양적 특성에 기초하여 79개의 균주 중 54균주(68%)가 B. elliptica로, 25균주(32%)가 B. cinerea로 동정되었다. RPB2와 HSP60의 염기서열 분석을 통해, 공시균주는 두 그룹으로 구분되었으며 이들은 형태적으로 동정한 그룹과 일치하였다.
- elliptica에 비하여 모든 온도에서 빠른 균사 생장을 보였다. 균사생장 최적온도인 20℃에서 B. cinerecH 평균 75.6 mm의 균사 생장을 보였으며 B. elliptical 평균 56.2 mm의 균사생장을 보였다. 30℃에서는 두 종 모두 균사 생장이 억제되었으며, 특히 B.
- cinereaS. 밝혀짐으로, 백합 잎마름병에 관여하는 2종의 상대적 중요성이 밝혀졌다. B.
- 백합 꽃잎에 대한 병원성 검정을 실시한 결과, B. elliptica 는 균주간에 병원성의 차이를 나타내어 2균주(CNTO03067, 03042)는 발병지수 4의 강한 병원성을 나타내었으나 나머지 4균주들은 발병지수 3 이하의 병원성을 나타내었다. B.
- 백합 병반에서 수집한 79개의 Botrytis 균주들은 분생자경과 분생포자의 형태적 특징에 따라 B. elliptica와 B. cinereal 두 개의 그룹으로 나뉘었다. B.
- 병원성 검정의 결과 B. elliptical 백합 잎과 꽃에 모두 강한 병원성을 나타내었고 균주간 병원성에 차이를 보였다. Doss(1988)는 하부에 있는 잎들은 상부에 있는 어린잎보다 B.
- 한국, 일본, 네덜란드의 주요 백합 재배지역에서 잎마름병에 걸린 백합으로부터 79개의 Botry- tis속 균주를 분리하였다. 분생자경과 분생포자의 형태적 특징에 의하여 Botrytis 균들은 2개의 그룹으로 분리되었으며 이들은 각각 B. elliptica와 B. cinerea로 동정되었다. 균사생장 속도는 B.
- 사용 균주들의 HSP60 유전자를 PCR한 결과 970 bp의 증폭산물을 얻었으며 40 균주 모두 동일한 크기를 나타내었다. HSP60 유전자의 염기서 열을 정렬한 결과 977 characters 중 97 charac- ters(9.
- cinerea(Bhs, 1971; 홍, 2002)와 일치하였다(Table 2). 실험에 사용된 균주 중 68.4%(54균주)가 A 그룹인 B. elliptica에、속하였고 31.6%(25균주)가 B 그룹인 B. grea에 속하였다.
- 사용한 40개 균주들의 RPB2 영역을 RPB2-6F와 fRPB2-7cR primer로 증폭하였다. 이들 균주에 대한 RPB2 영역의 PCR 결과 약 740 bp 크기의 증폭산물을 얻었으며 40 균주 모두 거의 동일한 크기를 나타내었다. RPB2 유전자의 염기서열을 정렬한 결과 767 characters 중 72 charac- ters(9.
- 3%)는 parsimony-informative였다. 이들 염기서열을 바탕으로 parsimony 분석을 수행한 결과 3개의 most parsimonious 계통수(length = 176, CI = 0.9091, RI = 0.9890) 를 얻었고 모든 계통수에서 확연히 구분되는 A 그룹(8. elliptica)과 B 그룹(B. citierea、)을 확인하였으며, 이들 그룹은 형태적 특징에 따라 구분한 그룹과 동일하였다(Fig. 3). A 그룹은 잎마름병에 걸린 백합에서 분리한 20 균주, B.
- 6%)는 parsimony-informative였다. 이들 염기서열을 바탕으로 parsimony 분석을 수행한 결과 3개의 most parsimonious 계통수(length = 231, CI = 0.8650, RI = 0.9704) 를 얻었고, 모든 계통수에서 A 그룹(B. elliptical* B 그룹 (B.
- cinerea 40개 균주와 대조 균 10종이 분석에 사용되었고 RPB2, HSP60 유전자의 염기서열 분석에 의해 사용 균주들은 두 개의 그룹으로 뚜렷하게 구분이 되었다. 이러한 결과는 형태적 특징을 통해 분리된 그룹과 동일하였으며 이는 분자생물학 기법을 이용한 계통발생학적 분석이 전통적인 균류의 분류 방식을 지지해 주는 것을 의미한다. 그러나 이들 마커 역시 동일 그룹내에 유전적으로 유사한 일부 종들이 100%의 염기서열 상동성을 나타내었다.
- 그러나 백합 꽃잎에는 접종원에 영양원의 첨가와 관계없이 모두 병원성을 나타내었다. 이상의 결과를 종합할 때 B. elliptica가 백합 잎마름병의 주요 병원이지만 B. cinerea도 잎마름병에 부분적으로 관여하며 특히 꽃잎에는 B. elliptica와 병원성에 큰 차이가 없음을 알 수 있었다. 그러나 본 연구를 통하여 외국에서 보고된(Ellis, 1971; Farr et al.
- IB, ID, Table 2). 이상의 형태적 특징을 문헌과 비교한 결과 A 그룹은 문헌상의 B. elliptica(유 등, 1988; 홍, 2002)와 일치하였고 B 그룹은 B. cinerea(Bhs, 1971; 홍, 2002)와 일치하였다(Table 2). 실험에 사용된 균주 중 68.
- RPB2와 HSP60의 염기서열 분석을 통해, 공시균주는 두 그룹으로 구분되었으며 이들은 형태적으로 동정한 그룹과 일치하였다. 포자 현탁액을 이용한 B. elliptica와 B. cinereae 병원성 검정 결과 elliptica 균주들은 백합 잎과 꽃잎 모두에 병원성을 나타내었다. 그러나 B.
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