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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 대농갱이의 전 수컷 집단의 유전육종을 위한 연구의 일환으로 대농갱이 자성발생성 집단을 생산하고 이들의 생존율 및 성장 분석과 함께 자성발생성 이배체 자손들의 성 비(sex ratio)를 분석함으로써 대농갱이의 유전학적 성 결정 기구를 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 유도된 자성발생성 이배체의 성비 분석을 위해 부화 10주째 2회에 걸쳐 무작위로 선발한 시료의 조직학적 분석을 수행하였다. 1차 분석의 경우 대조군 12마리 및 자성발생성 이배체 19마리를 분석하였고 2차 분석의 경우 대조군 및 자성발생성 이배체 각 30마리를 대상으로 암수 판별을 실시하였다. 각 그룹으로부터 표본된 개체들을 중성 포르말린 또는 Bouin's solution으로 고정한 후 24시간 후에 70% alcohol로 교체하였다.
- 각 그룹으로부터 표본된 개체들을 중성 포르말린 또는 Bouin's solution으로 고정한 후 24시간 후에 70% alcohol로 교체하였다.
- 85% 생리식염수로 50배 비율로 희석 후, 희석된 정액을 각 petri dish 바닥에 1 mm 두께가 되도록 도포하고 균일한 자외선 조사를 실시하였고 이때 자외선 조사량은 자외선 4,800 ergs/mm2로 하였다. 건식법에 의해 대농갱이 알과 불활성화된 동자개 정자를 인공 수정시켰으며 수정란의 제2극체 방출을 억제하기 위해서 수정 후 5분, 4℃에서 30분간 저온 처리를 수행하였다(Park et al., 2007). 처리 후 부화까지 25±0.
- 고정한 표본은 일반적인 조직학적 분석법에 의거하여 파라핀에 포매하였으며 5 µm두께로 조직절단기(Leica Co., Germany)를 이용하여 횡단 절단하였다.
- 대농갱이, Leiocassis ussuriensis의 유도된 자성발생성 이배체의 초기 생존율, 초기 성장 및 성비를 분석하였다. 대농갱이 자성발생성 이배체는 일반 대농갱이 이배체 대조군과 비교 시 부화 180일까지 생존 및 성장 형질에서 모두 차이를 나타내지 않았다(P>0.
- 5℃ 배양기를 이용하여 부화를유도하였다. 부화된 자어들을 대상으로 인 형성 부위(nucleolar organization regions; NORs) 염색법과 반수체 증후군의 표현 여부 분석을 통해 자성발생성 이배체 유도를 확인하였고, 부화 후 1주된 개체들을 대상으로 생존 및 성장 형질 평가에 이용하였다. 형질 평가를 위한 대조군으로서 동자개 이배체를 생산하여 비교하였다(see also Park et al.
- 유도된 자성발생성 이배체의 성비 분석을 위해 부화 10주째 2회에 걸쳐 무작위로 선발한 시료의 조직학적 분석을 수행하였다. 1차 분석의 경우 대조군 12마리 및 자성발생성 이배체 19마리를 분석하였고 2차 분석의 경우 대조군 및 자성발생성 이배체 각 30마리를 대상으로 암수 판별을 실시하였다.
- 이후 각 절편은 Harris’s haematoxylin과 eosin-phloxine B로 비교 염색하였고 작성한 조직 절편 슬라이드는 현미경하에서 난소 또는 수컷 생식소를 판별하였다.
- 자, 치어 사육은 50×35×25 cm (W×L×H) 규격인 45 ℓ 용량의 반순환 여과식 사각 수조를 이용, 3반복 실험 수조 당 최초 150마리의 자어를 수용하였고, 성장 측정을 위해 30일 간격으로 각 수조에서 10마리씩 표본 채취를 실시하였으며 이때 생존 개체의 계수를 통해 각 단계 별 생존율을 백분율로 평가하였다.
- , Japan)를 만복 공급하였다. 자성발생성 이배체와 대농갱이 이배체 대조군을 설정하여 생존율 및 성장률을 분석하였으며 채취된 표본을 대상으로 전장(total length) 및 체중(body weight)을 측정하였다. 전장은 해부현미경(Olympus Co.
- 자성발생성 이배체와 대농갱이 이배체 대조군을 설정하여 생존율 및 성장률을 분석하였으며 채취된 표본을 대상으로 전장(total length) 및 체중(body weight)을 측정하였다. 전장은 해부현미경(Olympus Co., Japan) 하에서 micrometer를 통하여, 또는 버어니어 캘리퍼스를 사용하여 0.01 mm단위까지 측정하였으며, 체중은 전자저울(Sartorius Co., Germany)을 사용하여 1 mg 단위까지 측정하였다. 대조군 대농갱이 이배체와의 유의차를 검정하기 위해서 Student’s t-test를 이용하였다.
- 자성발생성 이배체 유도를 위해서 선행 연구를 통해 확립된 조건을 이용하여 유전적으로 불활성화된 동자개 정자 시료를 준비하였다. 정자 불활성화를 위해 수집된 정액을 0.85% 생리식염수로 50배 비율로 희석 후, 희석된 정액을 각 petri dish 바닥에 1 mm 두께가 되도록 도포하고 균일한 자외선 조사를 실시하였고 이때 자외선 조사량은 자외선 4,800 ergs/mm2로 하였다. 건식법에 의해 대농갱이 알과 불활성화된 동자개 정자를 인공 수정시켰으며 수정란의 제2극체 방출을 억제하기 위해서 수정 후 5분, 4℃에서 30분간 저온 처리를 수행하였다(Park et al.
- 초기 생존율 및 성장 분석을 위해서 부화 후 난황 흡수기부터 30일 간격으로 180일까지 시험 사육을 실시하였다. 자, 치어 사육은 50×35×25 cm (W×L×H) 규격인 45 ℓ 용량의 반순환 여과식 사각 수조를 이용, 3반복 실험 수조 당 최초 150마리의 자어를 수용하였고, 성장 측정을 위해 30일 간격으로 각 수조에서 10마리씩 표본 채취를 실시하였으며 이때 생존 개체의 계수를 통해 각 단계 별 생존율을 백분율로 평가하였다.
- 부화된 자어들을 대상으로 인 형성 부위(nucleolar organization regions; NORs) 염색법과 반수체 증후군의 표현 여부 분석을 통해 자성발생성 이배체 유도를 확인하였고, 부화 후 1주된 개체들을 대상으로 생존 및 성장 형질 평가에 이용하였다. 형질 평가를 위한 대조군으로서 동자개 이배체를 생산하여 비교하였다(see also Park et al., 2007).
대상 데이터
- 자성발생성 이배체 유도를 위해서 선행 연구를 통해 확립된 조건을 이용하여 유전적으로 불활성화된 동자개 정자 시료를 준비하였다. 정자 불활성화를 위해 수집된 정액을 0.
데이터처리
- 대조군 대농갱이 이배체와의 유의차를 검정하기 위해서 Student’s t-test를 이용하였다.
- 성비 조사 결과는 χ2-test를 실시하였으며 P=0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 자, 치어 사육은 50×35×25 cm (W×L×H) 규격인 45 ℓ 용량의 반순환 여과식 사각 수조를 이용, 3반복 실험 수조 당 최초 150마리의 자어를 수용하였고, 성장 측정을 위해 30일 간격으로 각 수조에서 10마리씩 표본 채취를 실시하였으며 이때 생존 개체의 계수를 통해 각 단계 별 생존율을 백분율로 평가하였다. 기타 자세한 사육 방법은 Park et al. (2006)의 방법에 의거하여 실시하였다. 시험 사육기간 동안 수온은 23~25℃를 유지하였으며 알테미아 부화 유생 및 해산어 종묘생산용 배합사료(Higashimaru Co.
성능/효과
- 본 실험에서 유도된 자성발생성 이배체 대농갱이의 경우 역시 일반 대농갱이 암컷과 유사한 난모세포 성숙 정도를 나타내는 것으로 나타났으며 이후 부화 8개월에는 육안으로 쉽게 관찰 가능한 정상적인 모양과 크기의 난소를 갖고 있었고, 이들 난소조직에서는 정상적인 감수 분열이 일어나고 있었으며 일부 난황 형성도 관찰되었다(photograph not shown). 그러나 암수 성비에 있어서는 대조군 대농갱이의 경우 암수 비율이 정상적인 1:1 비율로 나타났으나 자성발생성 이배체 실험군의 경우 모두 암컷인 단성 집단(mono-sex population)으로 관찰되었다. 이는 대농갱이가 XX-YY형의 암컷 동형접합자(female homogamety; XX-♀: XY-♂)를 기본으로 하는 유전학적 성 결정 기구를 보유하고 있음을 강하게 뒷받침하는 결과로 판단된다.
- 05; Table 1). 대농갱이 대조군 암컷의 난소는 난소강(OC, ovarian cavity)이 존재하는 주변인기(oocyte in the perinucleus stage) 단계를 나타내었고, 자성발생성 이배체 난소 역시 대조군 암컷과 생식소 발달에 있어 큰 차이를 관찰할 수 없었다(Fig. 2).
- 본 실험 결과 유도된 자성발생성 이배체와 대농갱이 이배체 대조군간에는 초기 성장 및 생존 형질에 있어 유의적인 차이가 전혀 관찰되지 않았는데, 이러한 결과는 여러 어종들에서 보고된 바 있는 자성발생성 이배체들의 낮은 생존 및 성장률 결과와는 일치하지 않았다(Quillet et al., 1991; Pandian and Koteeswaran, 1998). 그러나 Kim et al.
- , 1996). 본 실험에서 유도된 자성발생성 이배체 대농갱이의 경우 역시 일반 대농갱이 암컷과 유사한 난모세포 성숙 정도를 나타내는 것으로 나타났으며 이후 부화 8개월에는 육안으로 쉽게 관찰 가능한 정상적인 모양과 크기의 난소를 갖고 있었고, 이들 난소조직에서는 정상적인 감수 분열이 일어나고 있었으며 일부 난황 형성도 관찰되었다(photograph not shown). 그러나 암수 성비에 있어서는 대조군 대농갱이의 경우 암수 비율이 정상적인 1:1 비율로 나타났으나 자성발생성 이배체 실험군의 경우 모두 암컷인 단성 집단(mono-sex population)으로 관찰되었다.
- 부화 10주 째 대농갱이 대조군의 암, 수 성비는 1:1 비율에서 거의 차이가 없는 (P>0.05) 정상 성비가 관찰된 반면 자성발생성 이배체들은 모두 암컷으로 판명되었다(P<0.05; Table 1).
- 자성발생성 이배체는 부화 10주째 암수 판별이 용이한 수준의 난모세포 발달 정도를 보였고 일반 대농갱이 암컷과 난소 발달에 있어 유사하였다. 부화 10주째 생식소 조직학적 분석 결과 일반 대농갱이 이배체 자손들은 1:1의 암수 비율을 나타낸 반면, 자성발생성 이배체 자손들은 모두 암컷으로 판별됨으로써 본 어종의 성 결정 기구는 XX-XY를 기본으로 하는 암컷 동형접합형인 것으로 나타났다.
- 유도된 자성발생성 이배체의 성장과 생존율을 비교하기 위하여 연령 180일까지의 전장과 체중의 성장을 조사한 결과, 분석한 모든 구간에서 자성발생성 이배체와 대농갱이 이배체 대조군간의 초기 생존율에 관한 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(P>0.05).
- 이에 실험이 종료되는 최종 180일째 자성발생성 이배체군과 대농갱이 대조군의 누적 생존율은 각각 평균 75.6±0.6% 및 78.0±1.0%로 유사하게 나타났다(P>0.05).
- , 2006). 자성발생성 개체들의 형질은 사용한 각각의 암컷의 유전형(maternal influence)에 의해 크게 영향 받을 수 있으며, 본 연구결과 자성발생성 이배체들과 대조군 이배체들간의 초기 생존 및 성장 형질에 차이가 없는 것은 본 실험에 사용한 암컷의 유전형에 의해 기인된 것으로 판단된다. 이에 향후 대농갱이의 순계 육종을 위해서는 다양한 암컷 개체별 인공처녀생식 유도와 함께 우량의 형질이 보다 많이 축적된 자성발생성 이배체 자손들의 가계 선발이 필요함을 잘 시사하고 있다.
후속연구
- , 2000). 대농갱이 역시 유사한 전략을 기반으로 육종학적 연구 개발이 이루어 질 수 있으리라 기대되며 앞으로 대농갱이를 대상으로 YY 유전자형의 개발을 위한 생리학적으로 성전환된 XY 암컷의 확보 및 XY 수컷으로부터 웅성발생성 처녀생식(induced androgenesis) 유도 조건의 확립에 관한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 자성발생성 개체들의 형질은 사용한 각각의 암컷의 유전형(maternal influence)에 의해 크게 영향 받을 수 있으며, 본 연구결과 자성발생성 이배체들과 대조군 이배체들간의 초기 생존 및 성장 형질에 차이가 없는 것은 본 실험에 사용한 암컷의 유전형에 의해 기인된 것으로 판단된다. 이에 향후 대농갱이의 순계 육종을 위해서는 다양한 암컷 개체별 인공처녀생식 유도와 함께 우량의 형질이 보다 많이 축적된 자성발생성 이배체 자손들의 가계 선발이 필요함을 잘 시사하고 있다.
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