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문제 정의
- 본 연구에서는 애집거미 센서리로돕신에서 추출한 NpSR Ⅱ의 전기-광학적 특성을 연구 관측하였다. 가시광선 영역에서 흡수도를 측정한 결과 450-550 nm에서 흡수정도가 크게 측정되었고, 498 nm에서 흡수가 가장 많이 이루어진 것으로 측정되었다.
제안 방법
- 이용하여 측정하였다. 25 % NaCl 수용액에 함유된 순수한 NpSR I[의 반응특성 측정에 앞서, 반응특성에 대조군으로 순수한 25 % NaCl 수용액을 만들어 측정하였다. 그런 다음, 밝은 환경과 어두운 환경에서 빛의 유무에 따른 NpSR Ⅱ의 반응 정도를 측정하였다.
- 발현, 분리, 및 정제되었다. NpSR II 유전자를 가진 플라즈미드를 대장균에 형질전환을 통하여 삽입하여 대장균을 키웠다. 1 mM 頂TG와 0.
- 02 % (+)-L-arabinose를 넣어 대량발현을 유도하여 30 ℃, 200 rpm으로 24시간동안 진탕기에서 배양되었다. NpSR II가 발현된 세포들을 원심분리기를 통하여 모은 뒤, 첫 번째로 고주파음을 이용하여 세포를 파괴하고 초고속 원심분리기를 이용하여 세포에서 세포막을 분리하였다. 분리된 세포막에 1 % DM (n-Dodecyl-B-D-Maltopyranoside)를 처 리 하여 막 단백질을 미소결정 상태로 유지시켰다.
- 이를 이용하여, 생물학적 시료인 NpSR II 막단백질에 대해 비접촉, 비파괴적으로 빛의 파장에 따른 반응특성을 마이크로파 반사계수(Sn)로 측정하여 알아보았다. NpSR Ⅱ에 대해 동일 파장 대역에서 흡수도를 통해 얻은 광순환 반응특성과 마이크로파에 대한 반응 특성결과를 비교하였다. 그 결과, 두 부분에서 기존의 흡수도를 통한 광순환 특성과 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
- 02 % DM)로 약 1/1000배로 희석한 후 다시 농축하여 흡수스펙트럼, 광주기 측정, 그리고 근접 장 마이크로파를 이용한 측정에 사용하였다. NpSR Ⅱ의 가시광 영역에서의 반응특성을 관측하기 위하여 80 %의 농도로 농축하여 실험에 적합하도록 한 후 광 흡수 장치 (Shimadzu UV-2450) 를 이용하여 흡수도를 측정하였다. 그림 2에 측정된 NpSR Ⅱ의 흡수스펙트럼을 나타내었다.
- NpSR Ⅱ의 전기-광학적 특성을 측정하기 위하여 근접장 마이크로파 현미경을 이용하였다. 마이크로파를 이용한 근접장 마이크로파 현미경 시스템은 다른 측정 장비에 비해 시스템의 구성이 간단하고 작동을 위한 조작이 쉽다.
- 근접장 마이크로파 현미경은 공진기의 형태에 따라 동축선 공진기, 도파관 공진기, 유전체 공진기가 사용되고 있다. [5-14], 본 연구에서는 안정적이고 Q 인자가 높은 유전체 공진기를 사용한 근접장 마이크로파 현미경을 이용하여 특수한 파장 빛에 반응하는 NpSR II의 광순환 특성에 대해 마이크로파 반사계수(Su) 를 측정하여 반응특성을 비교하였다.
- 2 mm인 원기둥 모양의 유전체가 위치하고 유전율이 29인 Ba(ZrTa)<?3로 이루어졌다. 공진기의 반응 특성은 공진기 내부와 연결된 외부의 연결나사를 이용하여 공진기의 공진주파수에서 Q 인자가 최대가 되도록 조절하였다. 근접장 마이크로파 현미경 시스템에서는 거리조절센서로서 튜닝폭 (CFS308, [17]) 을 사용하였다.
- 이러한 전자계는 공진기에 연결된 공진기 내부 커플링 루프에 의해 전계 및 자계의 특성에 따라 구분되어 측정에 사용된다. 공진기의 반응특성은 공진기 내부와 연결된 외부의 정밀 튜닝 연결나사를 이용하여 공진기의 공진주파수에서 Q 인자가 최대가 되도록 조절하였다. 공진기 내부의 마이크로파는 내부와 연결된 외부의 팁이 부착된 튜닝폭을 통해 팁 끝단으로 전달된다.
- 측정과정에서 광원으로는 Xenon Arc Lamp (68911, 280 W)를 사용하였고 모노크로메터 (SDMC1-02)를 이용하여 분광된 광원을 일정 시간 간격으로 NpSR Ⅱ에 비추었다. 그런 다음, 근접 장 마이크로파 현미경 시스템으로 빛의 파장에 따른 반응 특성에 대해 마이크로파 반사계수를 측정하였다.
- 25 % NaCl 수용액에 함유된 순수한 NpSR I[의 반응특성 측정에 앞서, 반응특성에 대조군으로 순수한 25 % NaCl 수용액을 만들어 측정하였다. 그런 다음, 밝은 환경과 어두운 환경에서 빛의 유무에 따른 NpSR Ⅱ의 반응 정도를 측정하였다. 그 결과를 그림 4에 나타내었다.
- 파장에 따른 NpSR Ⅱ의 흡수정도에 따른 반응특성 측정에 근접 장 마이크로파 현미경 시스템을 이용하였다. 따라서 NpSR Ⅱ의 마이크로파에 대한 반응 특성을 알아보기 위해 파장대역에 따라 마이크로파 반사 계수를 측정하였다. 그 결과를 그림 6에 나타내었다.
- 마이크로파를 이용한 NpSR Ⅱ의 반응특성을 측정하기 위한 실험장치로서 그림 3과 같이 근접 장 마이크로파 현미경 시스템을 구성하였다. 그림 3에서 네트웍 에널라이져로부터 마이크로파가 유전체 공진기로 전달되고 공진기 내부에 위치한 유전체를 중심으로 전자계가 형성된다.
- 빛의 파장에 따른 NpSR Ⅱ의 광 반응특성을 측정하기 위한 전 과정으로 빛의 유무에 따른 NpSR II의 변화 및 반응특성을 근접장 마이크로파 현미경을 이용하여 측정하였다. 25 % NaCl 수용액에 함유된 순수한 NpSR I[의 반응특성 측정에 앞서, 반응특성에 대조군으로 순수한 25 % NaCl 수용액을 만들어 측정하였다.
- 실험은 다른 상태로 에너지가 변환되는 것을 막고 반응정도를 정확히 측정하기 위하여 NpSR II가 충분히 암순응을 할 수 있는 시간 간격을 두고 측정하였다. 그림 6에서 보여 지듯이 NpSR II (X max=500 nm) 상태, NpSR IPO (Xmax=540-550 nm)상태의 반응특성이 측정되었다.
- 근접장 마이크로파 현미경 시스템은 거리조절장치를 통해, 팁이 시료표면에 최대한 근접했을 때 발생할 수 있는 문제점을 방지하도록 제작되었다. 이를 위해, 팁과 시료 사이의 일정 거리를 유지하도록 록인암프와 피드백 시스템을 통해 팁과 시료 사이의 거리를 10 nm로 유지하였다. 측정과정에서 광원으로는 Xenon Arc Lamp (68911, 280 W)를 사용하였고 모노크로메터 (SDMC1-02)를 이용하여 분광된 광원을 일정 시간 간격으로 NpSR Ⅱ에 비추었다.
- 튜닝폭 거리조절 센서를 이용하여 거리 조절이 가능한 근접장 마이크로파 현미경을 제작하였다. 이를 이용하여, 생물학적 시료인 NpSR II 막단백질에 대해 비접촉, 비파괴적으로 빛의 파장에 따른 반응특성을 마이크로파 반사계수(Sn)로 측정하여 알아보았다. NpSR Ⅱ에 대해 동일 파장 대역에서 흡수도를 통해 얻은 광순환 반응특성과 마이크로파에 대한 반응 특성결과를 비교하였다.
- 그 결과, 두 부분에서 기존의 흡수도를 통한 광순환 특성과 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 즉, NpSR II (Xmax=500 nm) 상태, NpSR II-O (Xmax=540-550 nm) 상태의 반응특성이 근접장 마이크로파 현미경 시스템으로 측정되었다. 이러한 결과로부터 로돕신처럼 빛에 반응특성을 보이는 시료에도 근접장 마이크로파 현미경의 응용 연구가 가능함을 확인하였다.
- 이를 위해, 팁과 시료 사이의 일정 거리를 유지하도록 록인암프와 피드백 시스템을 통해 팁과 시료 사이의 거리를 10 nm로 유지하였다. 측정과정에서 광원으로는 Xenon Arc Lamp (68911, 280 W)를 사용하였고 모노크로메터 (SDMC1-02)를 이용하여 분광된 광원을 일정 시간 간격으로 NpSR Ⅱ에 비추었다. 그런 다음, 근접 장 마이크로파 현미경 시스템으로 빛의 파장에 따른 반응 특성에 대해 마이크로파 반사계수를 측정하였다.
- 용출시 사용된 250 mM 이미다졸을 제거하기 위하여 Amicon Ultra 튜브 농축기를 이용하였다. 측정버퍼 (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.0, 0.02 % DM)로 약 1/1000배로 희석한 후 다시 농축하여 흡수스펙트럼, 광주기 측정, 그리고 근접 장 마이크로파를 이용한 측정에 사용하였다. NpSR Ⅱ의 가시광 영역에서의 반응특성을 관측하기 위하여 80 %의 농도로 농축하여 실험에 적합하도록 한 후 광 흡수 장치 (Shimadzu UV-2450) 를 이용하여 흡수도를 측정하였다.
- 가시광선 영역에서 흡수도를 측정한 결과 450-550 nm에서 흡수정도가 크게 측정되었고, 498 nm에서 흡수가 가장 많이 이루어진 것으로 측정되었다. 튜닝폭 거리조절 센서를 이용하여 거리 조절이 가능한 근접장 마이크로파 현미경을 제작하였다. 이를 이용하여, 생물학적 시료인 NpSR II 막단백질에 대해 비접촉, 비파괴적으로 빛의 파장에 따른 반응특성을 마이크로파 반사계수(Sn)로 측정하여 알아보았다.
- 이때, 에너지를 흡수하는 파장에서 peak이 나타나고 한 사이클이 끝나면 원래 상태인 NpSR II (Xmax=500 nm) 상태로 되돌아가므로 500 nm 부분은 음의 특성 곡선으로 측정된다. 파장에 따른 NpSR Ⅱ의 흡수정도에 따른 반응특성 측정에 근접 장 마이크로파 현미경 시스템을 이용하였다. 따라서 NpSR Ⅱ의 마이크로파에 대한 반응 특성을 알아보기 위해 파장대역에 따라 마이크로파 반사 계수를 측정하였다.
대상 데이터
- 카르복시 말단에 6개의 히스티딘이 붙어있는 NpSR II를 친화크로마토그래피 방법의 일종인 IMAC (Immobilized metal affinity chromatography) 방법으로 N产-NTA 수지 (Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 용출시 사용된 250 mM 이미다졸을 제거하기 위하여 Amicon Ultra 튜브 농축기를 이용하였다. 측정버퍼 (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.
이론/모형
- 공진기의 반응 특성은 공진기 내부와 연결된 외부의 연결나사를 이용하여 공진기의 공진주파수에서 Q 인자가 최대가 되도록 조절하였다. 근접장 마이크로파 현미경 시스템에서는 거리조절센서로서 튜닝폭 (CFS308, [17]) 을 사용하였다. 거리조절센서로 사용되는 튜닝 폭은 외부 캔 길이 8.
- 분리된 세포막에 1 % DM (n-Dodecyl-B-D-Maltopyranoside)를 처 리 하여 막 단백질을 미소결정 상태로 유지시켰다. 카르복시 말단에 6개의 히스티딘이 붙어있는 NpSR II를 친화크로마토그래피 방법의 일종인 IMAC (Immobilized metal affinity chromatography) 방법으로 N产-NTA 수지 (Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 용출시 사용된 250 mM 이미다졸을 제거하기 위하여 Amicon Ultra 튜브 농축기를 이용하였다.
성능/효과
- 그 결과를 그림 4에 나타내었다. 25 % NaCl 수용액에 NpSR II가 함유된 경우 기준(25 % NaCl)보다 반사계수(Sn)가 크게 측정되었다. 반사계수(SG는 시료의 물리적 성질 특성에 따라 달라지며 이것의 측정결과는 시료의 유전율 변화에 따른 것이다.
- 가시광선 영역에서 흡수도를 측정한 결과 450-550 nm에서 흡수정도가 크게 측정되었고, 498 nm에서 흡수가 가장 많이 이루어진 것으로 측정되었다. 튜닝폭 거리조절 센서를 이용하여 거리 조절이 가능한 근접장 마이크로파 현미경을 제작하였다.
- 또한, 어두운 환경보다 밝은 환경에서 NpSR II 의 반사계수(Sii)가 크게 측정되었다. 이는 빛에 민감하게 반응하는 NpSR II 분자가 밝은 환경에서 여기되어 중간체 (NpSR II-O)를 만들며 어두운 환경보다 상대적으로 큰 반사계수 값이 측정됨을 알 수 있다.
- 즉, NpSR II (Xmax=500 nm) 상태, NpSR II-O (Xmax=540-550 nm) 상태의 반응특성이 근접장 마이크로파 현미경 시스템으로 측정되었다. 이러한 결과로부터 로돕신처럼 빛에 반응특성을 보이는 시료에도 근접장 마이크로파 현미경의 응용 연구가 가능함을 확인하였다. 근접장 마이크로파 현미경을 이용한 연구는 .
- 그러나 475 nm 근처의 특성곡선은 NpSR II-N (Xmax=485 nm) 상태이거나 아니면 이제까지의 방법으로 측정할 수 없었던 단백질 분자 내의 진동을 측정한 것일 수 있다. 지금까지의 내용을 종합해보면 특별한 파장의 빛을 받으면 NpSR Ⅱ의 레티날 및 단백질의 구조변화가 일어나며 마이크로파 반사계수를 측정한 결과의 반응 정도와 비교한 결과 광순환 특성과 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
후속연구
- 더불어 근접장 마이크로파 현미경 시스템은 빛의 유무에 따른 시료의 마이크로파 반응특성에 대해 3차원 영상도 가능하게 한다. 따라서 빛에 대한 로돕신의 반응특성이 갖는 전자기적 변화에 대해 근접장 마이크로파 이미지를 얻는다면 전자기적 변화과정에 대한 확인이 가능할 것으로 기대한다.
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