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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 외래종인 Daphnia magna (이하 D. magna)국내종인 Simocephalus mix- fus(이하 S. mixtus)를 이용하여 살충제(carbaryl), 살균제 (benomyl), 제초제(amitrole)가 물벼룩에 미치는 영향을 파악하고, 물벼룩 종에 따른 농약 독성의 감수성 차이를 밝히며, 심장박동의 변화와 (IC50)유영저 해를(EC50)동시에 테스트하여 상호연관관계를 밝히고 그 특성을 연구하고자 하였다.
제안 방법
- 보는 것이다. LCso이나 LTsoe 독성물질 처리를 규제하는 직접적인 안전농도라 할 수 없으며치사 수준이 아닐지라도 수서생물의 생체기능을불구로 만들거나 기능상의 장애를 줄 수도 있기 때문에 ECso과 IC50을 생물의 저해성 판단을 위하여사용하였다.
- 저해농도를 말한다. 각 시험 농도마다 lOOmL 유리비커에 희석 시험액을 넣은 후 생후 24시간 이내의 어린 물벼룩을 5개체씩 넣었으며, 동영상 촬영을 위해 24시간 이전의 어린물벼룩을 slide glass 에 올려놓고 물벼룩의 움직임을 없애기 위해 소량의 액만 남긴 뒤 현미경(Axiolab, Zeiss)에 장착된디지털카메라(DSC-F717, Sony)를 사용하여 동영상 촬영을 하였다. 각각 다른 5개의 농도에 물벼룩을 노출시켜 1시간, 6시간, 24시간, 48시간 후의 심장박동변화를 알아보기 위해 촬영된 동영상을 Adrenalin(프로그램) 0.
- 8, 용존산소(Dissolved Oxygen)는 6이상, 광 조건은 16시간 light/8시간 dark로 유지하였다. 각 시험 농도마다 lOOmL 유리비커에 희석 시험액을 넣은 후 생후 24시간 이내의어린 물벼룩을 5개체씩 넣어 48시간 후의 유영저해수(치사포함)를 관찰 기록하였다.
- 각 시험 농도마다 lOOmL 유리비커에 희석 시험액을 넣은 후 생후 24시간 이내의 어린 물벼룩을 5개체씩 넣었으며, 동영상 촬영을 위해 24시간 이전의 어린물벼룩을 slide glass 에 올려놓고 물벼룩의 움직임을 없애기 위해 소량의 액만 남긴 뒤 현미경(Axiolab, Zeiss)에 장착된디지털카메라(DSC-F717, Sony)를 사용하여 동영상 촬영을 하였다. 각각 다른 5개의 농도에 물벼룩을 노출시켜 1시간, 6시간, 24시간, 48시간 후의 심장박동변화를 알아보기 위해 촬영된 동영상을 Adrenalin(프로그램) 0.2배속으로 관찰하였다. 그외 실험 조건은 급성유영저해시험 조건과 동일하게 실시하였다.
- mixtus의 경우 시험에 사용한 20마리중 19마리가 사망함을 알 수 있었다. 그래서 본 연구에서는용매 사용으로 인한 영향을 무시할 수 없어 100% 물을 사용하여 25℃ 및 30℃ 의 온도에서 48시간 동안 magnetic stirrer를 사용하여 교반시켜 용해하였다. carbaryl의 경우 30℃ 물에 대한 용해도가 0.
- 급성독성 실험의 농도 설정을 위하여 예비실험을실시하고, 결과에 근거하여 100% 물벼룩에 저해가관찰되는 최저농도와 저해가 전혀 관찰되지 않는농도사이를 본 실험의 농도범위로 설정 하였다. 예비실험을 통해 설정된 농도범위는 D.
- 독성물질의 유입으로 인하여 생물이 사망하거나, 사망하지 않더라도 생물의 생체기능을 불구로 만들며 기능상의 장애를 줄 수 있기 때문에 본 연구에서는 치사수준이 아닌 저해수준으로서 ECso과 IC50 값을 비교했다. 하지만 심장박동을 이용한 IC50 값이 저해수준이 아닌 치사 수준에 가까웠기때문에 두 값을 직접적으로 비교 하기는 힘들었다.
- 행하였다. 배양액의 조제방법은 Table 2의 방법에 따라 제조된 stock solution No l~No 4를 각각 20mL, 20mL, 40mL, lOOOmL를 취하여 혼합한 후 증류수를 넣어 18.2 L로 하여 24시간동안 강력히 폭기 하였다. D.
- 1 ~4pg/L, amitrole 4~70 倨/L 이다. 설정된 각 농도의 범위를 다시 5단계로나누어 본 실험을 실시하였으며, 동일한 실험을 3회실시하여 평균값으로 ECsj 및 IC50 산정하였다.
- 본 연구에서는 2mL의 아세톤을 용매로 농약을 녹인 후 시험농도까지는 배양액으로 희석하여 사용하였다. 이때 용매로 사용한 아세톤이 물벼룩에 미치는 영향을 고려하기 위하여 2mL 아세톤을 배양액으로 희석하고, 다시 농도를 20您/1가 되도록 희석하여 아세톤의 영향이 전혀 없는 대조군과 48시간 후의 변화를 관찰 하였다. 그 결과 D.
대상 데이터
- 본 시험의 경우 결과의 신뢰성을 위해 시험 대상물질 마다 3회 이상의 시험을 실시하여 그 평균치로서 분석결과자료로 이용하였다.
- 유통되는 농약의 종류는 130여종인데 이중에는 1종의 화합물을 용제에 녹이거나 분말로 사용하는 것도 있으나, 2종 혹은 3 종 이상을 섞어 사용하는(2) 것이 대부분이다. 본실험에서는 살충제 1종 (carbaryl), 살균제 1종 (benomyl), 제초제 1종 (amitrole)을 선택하여 실험하였다.
- 우리나라의 경우 ami- trolee 환경부 유해화학물질관리법의 유독물, 노동부의 산업안전관리법에 관리대상 물질로 분류되며, benomyle 농림부의 농약관리법, 노동부의 산업안전관리법, 보건복지부의 식품위생법에 관리대상 물질로 분류되고 있다. 사용된 농약은 순도 98% 이상의 독일제 Dr. Ehrenstorfer GmbH사의 표준시 약을사용하였으며, 대략적인 이 . 화학적인 특성은 Table 3과 같다.
- 실험에 사용된 농약은 세계생태보전기금(WWF) 분류 내분비계장애물질 목록 67종 중 carbaryl, be- nomyl, amitrole이 포함되며, 일본 후생성 분류 내분비계장애물질 목록 142종 중에도 carbaryl, be- nomyl, amitrole이 포함된다. 우리나라의 경우 ami- trolee 환경부 유해화학물질관리법의 유독물, 노동부의 산업안전관리법에 관리대상 물질로 분류되며, benomyle 농림부의 농약관리법, 노동부의 산업안전관리법, 보건복지부의 식품위생법에 관리대상 물질로 분류되고 있다.
데이터처리
- 본 연구의 ECsoe Microsoft Excel 통계 프로그램으로 구하였으며, 각 농약에 대한 D. m理no와 S mixms의 ECsoe Table 10에 나타내었다. ECso 을 통해 나타난 물벼룩에 미치는 농약 독성은 종에 관계없이 carbaryl이 가장 강하고 그 다음이 benomyl, amitrole 순이었다.
이론/모형
- 배양액의 조제는 USEPA (1993)의 Hard constituted Water Medium 방법에 의하여 행하였다. 배양액의 조제방법은 Table 2의 방법에 따라 제조된 stock solution No l~No 4를 각각 20mL, 20mL, 40mL, lOOOmL를 취하여 혼합한 후 증류수를 넣어 18.
- 급성유영저해시험은 유해물질이 첨가된 시험수내에서 시험생물인 물벼룩의 24시간 또는 48시간 후의 유영저해 정도를 살펴보는 것이다. 본 실험 에서는 48시간의 급성 유형 저 해시 험을 실시 하였는데 시험의 절차등은 OECD Guideline for Testing of Chemicals 202를 기본으로⑹ 하고, 기타 국내외의 시험법도”° 참고 하였다.
- Senedesmus sp.의 배지는 USEPA법에 따랐으며 pH 7.5±0.1로 조정하였다. 만들어진 배양액은고압 멸균한 멸균수를 사용하여 lmL/100mL로 접종시켜 25℃ 400ft/c 아래의 형광등에서 배양하였으며, Magnetic stirrer로 교반을 시켜 조류(algae) 가 정치되지 않도록 하였다.
성능/효과
- 1) 독성 실험에 있어 실험액의 제조에 물이 아닌다른 용매를 사용할 경우 그 용매로 인한 저해가있음을 알 수 있으므로 EC50와 IC50 값은 용매에따라 고려되어야 한다.
- 2) D. magnet와 S. m诙句s에 의한 농약의 독성도는 종에 상관없이 carbaryl > benomyl > amitrole 순이었다
- 3) 본 연구에서 사용된 농약(carbaryl, benomyl, amitrole)의 종류에 관계없이 ECe과 ICsoe 국내종인 S. mix如s가 외국종인 D. ma期a보다 감수성이민감하다.
- 4) 실험에서 사용한 두 종류의 물벼룩에 대하여 EGoe 신뢰성 있게 구할 수 있었다.
- 5) 농약에 노출된 물벼룩은 사망하기 직전까지심장박동 수가 반 이하로 감소되는 경향이 적어 저해수준(ICG이라기보다는 치사수준(LCso)에 가깝다고 할 수 있다. 따라서 본 연구의 ECso과 ICso의 직접적인 비교는 힘들다.
- Benomyl에 노줄된 두 종류의 물벼룩은 carbaryl 에 노출된 것과 비슷한 경향으로 나타났으며, D. magna는 benomyl에 노출 후 48시간 경과 하였을때 농도 100//g/L에서 심장박동수가 32% 감소하였으며, 130/zg/L 일 때는 사망하여 심장박동을 측정할 수 없었다.
- ECso 을 통해 나타난 물벼룩에 미치는 농약 독성은 종에 관계없이 carbaryl이 가장 강하고 그 다음이 benomyl, amitrole 순이었다. D. magnaer S. mixtus 의 ECso을 비교 했을 때 국내종인 S. mixtus가 D. m花ra보다 그 값이 현저하게 낮았다.
- D. magna는 노출 1시간 후에 심장박동수가 조금 증가하였다가 6시간 이후부터 감소하는 경향을보였으며, S. mixtus는 노출 후 꾸준히 감소하는경향을 보였다.
- ECso이나 IC50을 통하여 국내종인 S. mixtus가 D. -magna보다 독성물질에 대한 감수성이 민감하다는것을 알았다. 감수성이 민감하다는 것은 독성실험에 있어 더 낮은 농도에도 감지가 가능하다는 것을의미하므로 현재 4대강 상수원에서 사용 중인 물벼룩 D.
- S. mixtus도 amitrole에 노출 후 48시간이 경과하였을 때 농도 4(0g/L에서 박동수가 43% 감소하였으며, 70/zgZL 일때는 54% 감소하였다.
- S. mix切s의 먹이 공급 중단으로 인한 심장 박동수의 감소는 9%였다. carbaryl의 농도가 0.
- mix切s의 먹이 공급 중단으로 인한 심장 박동수의 감소는 9%였다. carbaryl의 농도가 0.1/zg/L 이고 노출 후 48시간이 경과 하였을 때 박동수는초기보다 19% 감소하였고, 0.4陽/L 일 때 27% 감소, 0.7您/L 일 때 40% 감소, l“g/L 일 때는 47% 감소하였으며, 7/zg/L 일 때는 사망하여 심장박동을측정할 수 없었다.
- magna는 carbaryl의 농도가 0昭/L 일때 심장박동수가 조금씩 감소하여 48시간이 경과한 후에 10%가 감소하였는데 먹이 공급의 중단으로 인한박동수 감소라 판단된다. carbaryl의 농도가 10俺 ZL 일때 시간에 따른 심장박동의 변화를 대조군과비교할 때 큰 차이를 보이지 않았으나, 농도가 30 昭/L 이고 노출 후 48시간이 경과 하였을 때 박동수는 초기보다 25% 감소하였다. carbaryl의 농도가 50//g/L 이상 일 때는 사망하여 심장박동을 측정할수 없었다.
- -magna보다 독성물질에 대한 감수성이 민감하다는것을 알았다. 감수성이 민감하다는 것은 독성실험에 있어 더 낮은 농도에도 감지가 가능하다는 것을의미하므로 현재 4대강 상수원에서 사용 중인 물벼룩 D. magna를 국내종인 S mixtus로 교체할 수 있거나 또는 동시에 사용할 수 있음을 보여주고 있다.
- 1~6에서 보았듯이 농약에 노출된 물벼룩은 사망하기 전까지박동수가 반 이하로 줄어드는 경향을 찾아보기 힘들었다. 결과적으로 본 연구에서는 24시간 IC50과 48시간 ICso을 정확하게 구하는 것은 힘들었다 IC50 이 사망하기 이전에 어떤 물질이 미치는 저해영향을 파악보기 위한 것이므로 본 연구에서 구한 48시간 ICa)은 큰 의미를 부여하기 힘들며 오히려치사수준에 더욱 가까운 값이라 판단된다.
- 이때 용매로 사용한 아세톤이 물벼룩에 미치는 영향을 고려하기 위하여 2mL 아세톤을 배양액으로 희석하고, 다시 농도를 20您/1가 되도록 희석하여 아세톤의 영향이 전혀 없는 대조군과 48시간 후의 변화를 관찰 하였다. 그 결과 D. mcigna의 경우 대조군과 비교했을 때 특별한 점은 관찰 되지 않았으나, S. mixtus의 경우 시험에 사용한 20마리중 19마리가 사망함을 알 수 있었다. 그래서 본 연구에서는용매 사용으로 인한 영향을 무시할 수 없어 100% 물을 사용하여 25℃ 및 30℃ 의 온도에서 48시간 동안 magnetic stirrer를 사용하여 교반시켜 용해하였다.
- mixtusS. 노출 후 48시간이 경과 하였을 때 benomyl 농도 L0“g/L에서 심장박동수가 39% 감소하였으며, 4.0ug/L 일 때는 44% 감소하였다.
후속연구
- 직접적인 비교를 위해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요하며, 또한 실험방법이나 조건 등이 통일 되어할할 것이다.
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