[논문]콜린과 엽산 결핍이 흰쥐의 Genomic DNA 메틸화와 혈장 호모시스테인에 미치는 영향

문주애; 민혜선

[국내논문] 콜린과 엽산 결핍이 흰쥐의 Genomic DNA 메틸화와 혈장 호모시스테인에 미치는 영향
Genomic DNA Methylation Status and Plasma Homocysteine in Choline- and Folate-Deficient Rats 원문보기

韓國營養學會誌 = The Korean journal of nutrition．, v.40 no.1, 2007년, pp.14 - 23

문주애 (한남대학교 생명나노과학대학 식품영양학과) , 민혜선 (한남대학교 생명나노과학대학 식품영양학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Elevated plasma homocysteine (Hcy) is a risk factor for cognitive dysfunction and Alzheimer disease, although the mechanism is still unknown. Both folate and betaine, a choline metabolite, play essential roles in the remethylation of Hcy to methionine. Choline deficiency may be associated with low folate status and high plasma Hcy. Alterations in DNA methylation also have established critical roles for methylation in development of the nervous system. This study was undertaken to assess the effect of choline and folate deficiency on Hcy metabolism and genomic DNA methylation status of the liver and brain. Groups of adult male Sprague Dawley rats were fed on a control, choline-deficient (CD), folate-deficient (FD) or choline/folate-deficient (CFD) diets for 8 weeks. FD resulted in a significantly lower hepatic folate (23%) (p<0.001) and brain folate (69%) (p<0.05) compared to the control group. However, plasma and brain folate remained unaltered by CD and hepatic folate reduced to 85% of the control by CD (p<0.05). Plasma Hcy was significantly increased by FD $(18.34{\pm}1.62{\mu}M)$ and CFD $(19.35{\pm}3.62{\mu}M)$ compared to the control $(6.29{\pm}0.60{\mu}M)$ (p<0.001), but remained unaltered by CD. FD depressed S-adenosylmethionine (SAM) by 59% (p<0.001) and elevated S-adenosylhomocysteine (SAM) by 47% in liver compared to the control group (p<0.001). In contrast, brain SAM levels remained unaltered in CD, FD and CFD rats. Genomic DNA methylation status was reduced by FD in liver (p<0.05) Genomic DNA hypomethylation was also observed in brain by CD, FD and CFD although it was not significantly different from the control group. Genomic DNA methylation status was correlated with folate stores in liver (r=-0.397, p<0.05) and brain (r = -0.390, p<0.05), respectively. In conclusion, our data demonsoated that genomic DNA methylation and SAM level were reduced by folate deficiency in liver, but not in brain, and correlated with folate concentration in the tissue. The fact that folate deficiency had differential effects on SAM, SAH and genomic DNA methylation in liver and brain suggests that the Hcy metabolism and DNA methylation are regulated in tissue-specific ways.

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AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 엽산과 콜린영양 불균형에 의해 뇌 조직과 간 조직에서 일어나는 메티오닌 대사회로에서의 메틸기 대사과정에 나타나는 변화를 조사함으로써 호모시스테인혈증 및 뇌 조직 SAM과 SAH 수준과의 대사적 연관성을 분석하였다. 이들 메틸기 대사반응의 biomarker들의 상관성 연구는 인지능력 부전의 위험인자로 작용하는 혈장 호모시스테인 또는 SAM과 SAH 수준의 개선과 인지능력부전의 예방 및 치료연구를 위한 기초자료가 될 것이다.
본 연구에서는 메티오닌 대사회로에 관여하는 콜린과 엽산이 결핍되었을 때 호모시스테인 대사에 미치는 영향을 조사할 목적으로 혈장 호모시스테인, 메티오닌 대사회로와 관련된 SAM과 SAH, methionine synthase 활성, genomic DNA 메틸화 정도 및 엽산 영양상태를 분석하였다. 연구 결과 엽산결핍 식이군 (FD) 에서 엽산영양상태가 현저하게 저하되었으며 (Fig.
본 연구에서는 6주령 흰쥐를 대상으로 엽산 또는 콜린 결핍 식이를 8주간 급여한 후 간과 뇌조직내 메틸기 공여 물질인 SAM과 SAH의 수주 혈장 호모시스테인, 엽산 수준 및 세포 내 genomic DNA 메틸화 정도에 미치는 영향을 분석함으로써 콜린과 엽산결핍이 인지능력 저하의 위험인자 및 예측 인자로서의 호모시스테인혈증 및 DNA 메틸화에 미치는 영향을 조사하였다.

제안 방법

사육하였다. 사육실의 온도와 습도는 각각 20 ±1 ℃, 50 ± 5%로 유지하였으며 조명은 12시간 주기 (9 : GO- 21 : 00)로 조절하였고 물은 2차 증류수로 무제한 급여하였다.
실험 식이는 AIN-93M식이를 기준으로 실험군에 따라 control 식이, 콜린결핍 식이 (CD), 엽산결핍 식이 (FD), 콜린 및 엽산결핍 식이 (CDF)를 제공하면서 8주간 사육하였다 (Table 1). 식이 성분 중의 전분과 sucrose는 삼양사 제품을 사용하였으며, vitamin-free casein, AIN-93 mineral mix 와 folate-free vitamin mix 는 Dyets 사 제품을, 나머지 식이성분은 Sigma사 제품을 사용하였다.
식이 성분 중의 전분과 sucrose는 삼양사 제품을 사용하였으며, vitamin-free casein, AIN-93 mineral mix 와 folate-free vitamin mix 는 Dyets 사 제품을, 나머지 식이성분은 Sigma사 제품을 사용하였다. 식이 섭취량은 2일에 한 번씩 측정하였으며, 체중은 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 측정하였다. 식이효율 (Food efficiency ratio: FER)은 일정기간의 체중증가량을 동일기간 섭취한식이량으로 나누어 산출하였다.
식이 섭취량은 2일에 한 번씩 측정하였으며, 체중은 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 측정하였다. 식이효율 (Food efficiency ratio: FER)은 일정기간의 체중증가량을 동일기간 섭취한식이량으로 나누어 산출하였다.
실험기간이 종료되기 전날부터 동물을 12시간 절식시킨 상태에서 CQ 가스로 마취시킨 뒤 개복하여 심장 천자법으로 헤파린 처리된 주사기를 사용하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리 및 채취한 후 즉시 -70℃에 냉동 보관하였다.
채취한 혈액은 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리 및 채취한 후 즉시 -70℃에 냉동 보관하였다. 간과 뇌 조직을 적출한 후 무게를 측정하고 즉시 액체질소로 급속 냉동 시켜 -70℃에 냉동 보관하였다가 생화학적 분석에 사용하였다. 동물 조직의 생화학적 분석결과를 토대로 콜린과 엽산 결핍의 영향을 비교 .
간과 뇌 조직을 적출한 후 무게를 측정하고 즉시 액체질소로 급속 냉동 시켜 -70℃에 냉동 보관하였다가 생화학적 분석에 사용하였다. 동물 조직의 생화학적 분석결과를 토대로 콜린과 엽산 결핍의 영향을 비교 . 분석하였다.
분석하였다.四 간과 뇌조직의 엽산은 aultolysis 방법에 의해 polyglutamate chain을 분해한 후분석하였으며, 혈장엽산은 직접 미생물학적 분석법으로 분석하였다.
조직 분쇄액으로부터 준비된 상청액의 MS 활성에 의해 5-"CH₃-THF로부터 μ£]-methyl기를 호모시스테인으로 전이시켜 ["C]-methionine이 생성되도록 하였다. Bio Rad AG1-X minicolumn을 이용하여 5-14CH₃-THF 로부터 ["C]-methionine를 분리하였다.
Bio Rad AG1-X minicolumn을 이용하여 5-14CH₃-THF 로부터 ["C]-methionine를 분리하였다. 분리된 [14C] -me- thionine 의 방사능을 scintillation counter로 측정하여 MS 활성을 정량 분석하였다.
혈장 호모시스테인 농도는 Araki와 Sako의 HPLC법을“ 일부 수정한 방법을3》사용하여 분석하였다. 혈장 호모시스테인의 티올기와 ammonium 7—fluorobenzo-2-oxa-1, 3- diazole-4-sulphonate를 반응시켜 높은 형광성을 나타내면서 안정한 성질의 형광물질을 형성시킨 후 fluorescence detector로 정량하였다.
수정한 방법을3》사용하여 분석하였다. 혈장 호모시스테인의 티올기와 ammonium 7—fluorobenzo-2-oxa-1, 3- diazole-4-sulphonate를 반응시켜 높은 형광성을 나타내면서 안정한 성질의 형광물질을 형성시킨 후 fluorescence detector로 정량하였다.
측정하였다. 조직을 0.4 M perchloric acid 용액을 이용하여 분쇄한 후 원심분리하여 얻은 상청액을 당일 분석하였다. 상청 액은 centrifugal filter (Millipore사)로 여과한 후 분석 column에 주입하였으며, gradient mobile phase를 이용하여 분리하였다.
DNA 메틸화를 분석하였다. 반응조건은 다음과 같았다 DNA 0.5 "g, L- [methyl :, H] -SAM 3 *M (2 ”Ci), CpG methylase 3 units, Tris buffer (Tris—HC₁ 10 mM, pH 7.9, NaCl 120 mM, EDTA 10 mM, Dithiothreitol 1 mM) 를 혼합하여 총 30 “1 가 되도록 하였다. 이 혼합물을 두 벌씩 준비하여 30 ℃ 에서 1 시간동안 항온 유지하며 메틸화 반응이 진행되도록 하였다.
0, 70% ethanol, 99% ethanol 순으로 씻어 주었다. 마른 필터를 vial에 넣고 5 ml의 scintil- lant를 첨가하여 scintillation counter로 방사능을 측정하여 genomic DNA의 메틸화수준을 분석하였다. 각 시료의 blank 는 CpG methylase를 제외한 나머지 성분을 위와 동일하게 처리하여 준비하였다.
엽산은 MS에 의해 호모시스테인으로부터 메티오닌이 합성될 때 필요한 영양소이며, MS 활성은 혈장 호모시스테인 농도에 직접적인 영향을 주므로, 엽산과 콜린결핍 식이가 흰쥐의 간조직 MS 활성에 미치는 영향을 조사하였다 (Table 3). 콜린결핍 식이 (CD), 엽산결핍 식이 (FD), 그리고 콜란/엽산 결핍 식이 (CFD)는 간조직 MS 활성에 영향을 주지 않았。口.
분석하였다. 조직에서 분리 ■ 정제된 genomic DNA를 L- [methyl 3H] - SAM과 반응시켰으며, CpG methylase에 의해 메틸화 반응이 일어나도록 하였다. 이 실험에서는 L-[methyl 3H]-SAM 으로부터 [methyl 3H] group0! genomic DNA로 전이되는 양이 많을수록 genomic DNA의 메틸화 정도가 낮은 상태임을 나타낸다.
또한 이러한 결과로부터 뇌조직의 엽산보유가 다른 조직보다 효율적으로 이루어지는 것을 알 수 있었다. 일반적으로 엽산 영양상태를 크게 저하시킬 목적으로 succinylsulfathaizole 이나 methotrexate 등을 식이로 투여하는 방법이 사용되고 있으나, 본 연구에서는 일상적으로 인체에서 일어나는 조건과 유사한 실험조건을 동물연구에 부여할 목적으로 콜린 결핍 식이 만을 단독으로 적용하였다.
간과 뇌조직의 genomic DNA가 메틸화되어 있는 정도를 methyl group acceptance test를이용하여 분석하였다. 조직에서 분리 ■ 정제된 genomic DNA를 L- [methyl 3H] - SAM과 반응시켰으며, CpG methylase에 의해 메틸화 반응이 일어나도록 하였다.

대상 데이터

엽산 분석용 배지는 Difco사 제품 HPLC용 메탄올은 Mer- ckA} 제품, tributylphosphinee Fluka사 제품, 7-fluoro- benzo-2-oxa-l, 3-diazole-4-sulphonate (SBDF)는 Wako사 제품을 사용하였다. CpG methylase는 New Eng- land사 제품, ['‘H]S-adenosylmethioninee Perkin-Elmer 사 제품을 사용하였고, genomic DNA는 Qiagen사의 kit로 정제하였으며 그 밖의 분석시약은 Sigma사 제품을 사용하였다.
제품을 사용하였다. CpG methylase는 New Eng- land사 제품, ['‘H]S-adenosylmethioninee Perkin-Elmer 사 제품을 사용하였고, genomic DNA는 Qiagen사의 kit로 정제하였으며 그 밖의 분석시약은 Sigma사 제품을 사용하였다.
Sprague Dawley 종 숫컷 (6주령 170-L80 g) 32마리를 일본 Sic사에서 분양받아 체중에 따라 난괴법点 각 군당 8마리씩 4군으로 나누어 스텐레스 사육장에 한 마리씩 분리하여 사육하였다. 사육실의 온도와 습도는 각각 20 ±1 ℃, 50 ± 5%로 유지하였으며 조명은 12시간 주기 (9 : GO- 21 : 00)로 조절하였고 물은 2차 증류수로 무제한 급여하였다.
(Table 1). 식이 성분 중의 전분과 sucrose는 삼양사 제품을 사용하였으며, vitamin-free casein, AIN-93 mineral mix 와 folate-free vitamin mix 는 Dyets 사 제품을, 나머지 식이성분은 Sigma사 제품을 사용하였다. 식이 섭취량은 2일에 한 번씩 측정하였으며, 체중은 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 측정하였다.

데이터처리

0 프로그램을 이용하여 통계처리 하였다. 결과는 실험군별 평균과 표준오차로 나타내었고 실험군간의 차이는 이원배치 분산분석법 (two-way ANOVA) 으로 분석한 후 Duncan의 다중비교법으로 p < 0.05 수준에서 사후검정 하였다. 일부 변수들 사이의 관련성은 Pearson's correlation으로 분석한 다음 이에 대한 유의성을 검정하였다.
05 수준에서 사후검정 하였다. 일부 변수들 사이의 관련성은 Pearson's correlation으로 분석한 다음 이에 대한 유의성을 검정하였다.
DNA from liver and brain was prepared and DNA methylation was measured as described in methods. Values are the means ± S.E. of duplicate measurements carried exit on DNA from eight rats, Different letter above each bar indicates that it is significantly different at p<0.05 by two-way ANOVA and colculotion of Duneon's multiple-range test. NS: not significant, CD: Choline- deficient, FD: Folate-deficient, CFD: Choline & folate-deficient diet group.

이론/모형

시료의 엽산 함량은 Lactobacillus casei를 이용한 미생물학적 방법을 96-well에 적용시킨 방법으로 분석하였다.四 간과 뇌조직의 엽산은 aultolysis 방법에 의해 polyglutamate chain을 분해한 후분석하였으며, 혈장엽산은 직접 미생물학적 분석법으로 분석하였다.
단백질 농도는 Bradford's method로3™ 분석하였으며, 이때 bovine 혈청단백질을 표준용액으로 사용하였다.
간과 뇌조직내 SAM과 SAH의 농도는 Fell 등의 방법에制 의해 측정하였다. 조직을 0.
간과 뇌조직의 genomic DNA는 kit를 사용하여 정제한 다음, CpG methylase를 사용하여 Balaghi와 Wagner 방법으로 叫 DNA 메틸화를 분석하였다. 반응조건은 다음과 같았다 DNA 0.
엽산과 콜린결핍 식이를 급여하였을 때 나타나는 혈장 호모시스테인, 세포 내 genomic DNA 메틸화 및 엽산수준 사이의 대사적 관련성을 분석하기 위하여, 호모시스테인 및 DNA 메틸화와 SAM, SAH 및 엽산 농도와의 상관성을 Pearson 의 상관분석법으로 분석하여 Table 5에 제시하였다.
Methionine synthase 활성도는 Brot와 Weissbach 방법을 羽 일부 수정한 Kolhouse와 Allen의 방법에如 의해 측정하였다. 조직 분쇄액으로부터 준비된 상청액의 MS 활성에 의해 5-"CH₃-THF로부터 μ£]-methyl기를 호모시스테인으로 전이시켜 ["C]-methionine이 생성되도록 하였다.

성능/효과

호모시스테인혈증은 인지능력 저하로부터 치매에 이르기 까지 다양한 수준의 인지능력장애의 독립적인 위험인자로 작용하며, 혈중 호모시스테인 농도가 증가될수록 뇌경색과 치매의 위험이 높은 것으로 조사되었다.-" 호모시스테인은 메티오닌이 대사될 때 생성되는 비필수 황함유아미노산이며 호모시스테인이 대사되기 위해서는 엽산, 비타민 b12, 비타민 b6 및 콜린 등의 비타민이 필요하다/ 따라서 혈장 호모시스테인 농도는 이들 B-비타민들의 영양상태에 영향을 받는다.
같이 밝혀졌다. 흰쥐에게 콜린결핍 식이를 2주간 주었을 때, 간조직내 엽산함량이 31-40% 저하되었으며, 콜린을 다시 공급하였을 때 간 엽산함량이 정상수준으로 회복되었다 흰쥐에게 메티오닌과 콜린이 모두 결핍된 식이를 5주간 먹인 결과 간조직내 엽산함량이 대조군의 50% 수준으로 저하되어 이들 물질이 대사상 밀접하게 상호 관련되어 있었다."e 실험동물에게 항엽산제인 methotrexate를 투여하거나 무엽산식이로 tetrahydrofolate 결핍을 유도한 결과 간조직의 총콜린 및 phosphocholine 함량이 저하되었으므로 심한 엽산결핍이 콜린 저장량을 고갈시켰다.
090). 체중증가량도 식이섭취량과 유사한 경향을 나타내어 콜린과 엽산결핍 식이급여에 (CFD) 의해 성장이 유의적으로 저해되는 것으로 나타났으며, 체중 대비 간 무게 (liver wt/body wt ratio) 도 CFD군이 다른 실험군들 보다 높아 (p<0.05) 콜란/엽산결핍군에 지방간의 위험이 있었다.
1과 같았다. 엽산결핍 식이 (FD)를 6주령 adult rat에게 8주 동안 주었을 때 혈장의 엽산농도는 대조군의 18% 수준으로 크게 저하되었으며(P<0.05), 간의 엽산농도는 대조군의 23% 수준으로 현저히 저하되어 (p < 0.001) 심한 엽산 결핍 상태가 유도되었음을 알 수 있었다. 이와 대조적으로 뇌조직의 엽산 농도는 대조군의 69%수준으로 저하되었으므로 (p < 0.
001) 심한 엽산 결핍 상태가 유도되었음을 알 수 있었다. 이와 대조적으로 뇌조직의 엽산 농도는 대조군의 69%수준으로 저하되었으므로 (p < 0.05), 뇌조직 엽산 농도는 엽산결핍 식이에 의한 영향을 간조직 보다 덜 받는 것으로 조사되었다
콜린결핍 식이 (CD)를 8주간 공급한 결과 간 엽산 농도는 대조군의 85% 수준으로 저하되었으나 (p < 0.05) 혈장과 뇌 조직 엽산농도는 대조군과 유의적이 차이가 없었다 (Fig. 1). 이와 같이 8주간의 콜린결핍 식이급여에 의해 경미한 엽산 결핍 상태가 나타났으므로 심한 엽산결핍을 유도하기 위해서는 더 오랜 기간 동안 콜린결핍 식이를 주어야할 것으로 사료된다.
변화는 Table 3과 같았다. 엽산결핍 식이군 (FD) 의 혈장 호모시스테인 농도는 대조군의 2.9배를 나타내어 호모시스테인 혈증 (moderate homocysteinemia) 이 유발되었으므로(P < 0.001), 저조한 엽산영양상태가 호모시스테인의 재 메틸화 과정을 현저하게 저해함을 보여주었다. 콜린결핍 식이 (CD) 는 혈장 호모시스테인 농도에 영향을 주지 않았으며, 콜란/엽산 결핍군 (CFD) 의 혈장호모시스테인 농도는 엽산 결핍군과 유사한 수준을 나타내어 8주간의 콜린결핍 식이 공급이 adult rat의 호모시스테인 대사에 유의적인 영향을 주지 않았다
001), 저조한 엽산영양상태가 호모시스테인의 재 메틸화 과정을 현저하게 저해함을 보여주었다. 콜린결핍 식이 (CD) 는 혈장 호모시스테인 농도에 영향을 주지 않았으며, 콜란/엽산 결핍군 (CFD) 의 혈장호모시스테인 농도는 엽산 결핍군과 유사한 수준을 나타내어 8주간의 콜린결핍 식이 공급이 adult rat의 호모시스테인 대사에 유의적인 영향을 주지 않았다
엽산 (FD) 또는 콜란/엽산결펍 식이 (CFD) 급여는 간조직의 SAH 농도를 대조군의 147% 수준으로 증가시켰으며, 간조직 SAM 농도를 대조군의 41% 수준으로 저하시킴으로써 SAM/SAH 비율이 대조군의 약 30% 수준으로 저하되었다. 그러나 콜린결핍 식이군 (CD)의 간조직 SAH 와 SAM 농도는 대조군과 유의적인 차이가 없었다.
4). 이 결과로부터 이들 비타민 결핍이 SAM과 SAH 대사에 미치는 영향이 조직에 따라 특이적으로 차이가 있으며, 뇌조직의 SAM과 SAH의 농도는 엽산과 콜린 결핍에 의해 간조직 보다 덜 민감하게 영향을 받는 것을 알 수 있었다.
조직에서 분리 ■ 정제된 genomic DNA를 L- [methyl 3H] - SAM과 반응시켰으며, CpG methylase에 의해 메틸화 반응이 일어나도록 하였다. 이 실험에서는 L-[methyl 3H]-SAM 으로부터 [methyl 3H] group0! genomic DNA로 전이되는 양이 많을수록 genomic DNA의 메틸화 정도가 낮은 상태임을 나타낸다. Fig.
2에 제시한 바와 같이 콜린 결핍 (CD), 엽산 결핍 (FD) 및 콜란/엽산결핍 식이군 (CFD) 의 간조직 genomic DNA에 대조군보다 유의적으로 많은 [methyl 3H] group이 전이되었으므로 엽산/콜린결핍 식이는 간조직 DNA 메틸화를 유의적으로 저하시켰다. 따라서 8주간의 콜린 결핍 식이 급여가 메티오닌 대사회로에서 호모시스테인과 SAM, SAH농도에는 영향을 주지 않았지만 (Table 3, 4), 간 조직의 DNA 메틸화는 저해하는 것으로 나타났다 (Fig. 2). 뇌 조직의 DNA 메틸화 수준은 엽산과 콜린 결핍에 의해 저하되는 경향이었으나 대조군과 유의적인 차이는 없었다.
혈장 호모시스테인과 상관성이 높은 관련 변인은 혈장 엽산 (r = -0.739, p < 0.01), 간조직 엽산 (r = -0.795, p < 0.01) 및 간조직 SAM 농도 (r = -0.757, p < 0.01) 로서 높은 음의 상관관계를 나타내어, 조직내 엽산과 SAM 농도가 높을수록 혈장 호모시스테인 농도가 낮았다. 또한 혈장 호모시스테인은 간조직 SAH (r = 0.
01) 로서 높은 음의 상관관계를 나타내어, 조직내 엽산과 SAM 농도가 높을수록 혈장 호모시스테인 농도가 낮았다. 또한 혈장 호모시스테인은 간조직 SAH (r = 0.767, p < 0.01), 뇌조직 SAH (r = 0.443, p < 0.05) 와 높은 양의 상관성을 나타내어 혈장 호모시스테인이 높을수록 조직내 SAH 농도가 높은 경향을 보였다. 간과 뇌조직의 DNA 메틸화 정도는 각 조직의 엽산 농도와 상관되어 있었으며 (각각 r = -0.
05) 와 높은 양의 상관성을 나타내어 혈장 호모시스테인이 높을수록 조직내 SAH 농도가 높은 경향을 보였다. 간과 뇌조직의 DNA 메틸화 정도는 각 조직의 엽산 농도와 상관되어 있었으며 (각각 r = -0.390, p < 0.01; r = -0.397, p < 0.01) 엽산농도가 높을수록 DNA 메틸화 정도가 높았다. 간과 뇌조직의 DNA 메틸화 정도는 SAM과 SAH의 농도 및 혈장 호모시스테인 농도와는 상관관계를 나타내지 않아 다른 연구와차이가 있었다.
1), 이로 인해 혈장 호모시스테인이 크게증가되었고 (Table 3) 간조직의 SAM이 현저히 감소되고 SAH의 농도가 증가된다는 (Table 4) 종전의 연구 결과들이 확인되었다. 뇌조직의 호모시스테인 농도는 간조직과 비교할 때 모든 실험군에서 매우 낮은 수준이었으며, 본 연구에서 사용한 형광도 측정법으로는 분석이 불가능한 수준으로 낮았다.
콜린결핍식이 (CD)를 8주간 급여하였을 때 간조직의 엽산 농도는 대조군의 85% 수준으로 저하되었고, 혈장 및 뇌 조직 엽산농도에는 영향을 주지 않았으므로 콜린결핍이 경미하였음을 알 수 있었다 (Fig. 1). Selhub 등"에 의하면 2 주간 콜린결핍식이 급여시간 엽산농도가 대조군보다 31% 저하되어 본 연구와 비교할 때 단기간에 간 엽산농도가 더 많이 저하되었다.
항엽산제인 methotrexate는 뇌척수액의 엽산과 S-adenosylmethionine (SAM) 의 농도를 저하시키고 호모시스테인 농도를 증가시켰으므로, 洶 methotrexate에 의한 신경독성효과는 뇌조직의 엽산 고갈 및 호모시스테인 증가에 기인할 수 있음을 보여주었다. 뇌조직으로 호모시스테인이 운반되는 경로는 확실치 않으나, 동물연구에 의하면 호모시스테인은 단순확산과 운반체를 통한 운반방식에 의해 운반된다.
阳心 마우스를 대상으로 수행된 호모시스테인혈증 연구에서 뇌 조직의 blood-brain barrier가 호모시스테인에 의해 교란되었으며, '” 호모시스테인이 bidirectional cellular transporter 에 의해 혈장과 뇌조직 양방향으로 운반될 수 있는 것으로 보고되었다.'" 사람의 신경세포는 정상적인 조건에서 자체 내에서 호모시스테인을 합성할 수 있으며, 何 신경계 질환자들의 뇌척수액 호모시스테인 농도는 혈장 호모시스테인 농도에 비례하여 증가되었으나'"" 뇌척수액 호모시스테인 농도는 혈장보다 20~100배 낮은 수준이었다" 본 실험의 엽산결핍식이군에서 유도된 혈장 호모시스테인 농도는 18.34 “M로서 뇌조직의 호모시스테인 농도에 영향을 주기에는 낮은 수준인 것으로 사료된다. Fig.
1에 나타난 것과 같이 뇌 조직의 엽산 수준은 혈장이나 간과 달리 엽산이나 콜린 결핍식이에의해 경미하게 저하되었으며, 그 결과 SAM/SAH 및 DNA methylation에 유의적인 영향을 주지 않은 것으로 보인다. 또한 이러한 결과로부터 뇌조직의 엽산보유가 다른 조직보다 효율적으로 이루어지는 것을 알 수 있었다. 일반적으로 엽산 영양상태를 크게 저하시킬 목적으로 succinylsulfathaizole 이나 methotrexate 등을 식이로 투여하는 방법이 사용되고 있으나, 본 연구에서는 일상적으로 인체에서 일어나는 조건과 유사한 실험조건을 동물연구에 부여할 목적으로 콜린 결핍 식이 만을 단독으로 적용하였다.
Cystathionine ^-synthase 결손으로 인해 심한 호모시스테인혈증을 나타내는 어린 환자들을 (> 100 “M) betaine으로 치료하였을 때 혈장과 뇌척수액의 호모시스테인 농도가 저하되었다."' 콜린결핍식 이 군의 간 조직 내 엽산 농도는 대조군보다 약 15% 낮았으며 (Fig. 1), 혈장 엽산농도는 콜린결핍 식이급여에 의해 영향을 받지 않았으므로 엽산의 기능적 결핍증세인 호모시스테인혈증이 나타나지 않은 것으로 보인다. Table 5에 제시하였듯이 혈장과 간조직내 엽산농도와 혈장 호모시스테인 농도는 뚜렷한 역 관계를 보였으므로, 조직 의 엽산농도가 호모시스테 인 혈증의 가장 주요한 영향 요인임을 확인할 수 있었다.
결론적으로 엽산결핍 식이 급여는 저조한 엽산 영양상태, 호모시스테인혈증, 간조직의 SAH 농도 증가 및 SAM 농도 저하를 가져옴으로써 간조직 DNA 메틸화를 저해하는 것으로 나타났다. 그러나 엽산결핍식이는 뇌조직의 SAM, SAH 농도 및 DNA 메틸화에는 유의적인 영향을 주지 않았으므로 뇌조직의 메틸기 대사와 DNA 메틸화는 엽산 및 콜린 결핍에 덜 민감하게 영향을 받는 것으로 나타났다.
나타났다. 그러나 엽산결핍식이는 뇌조직의 SAM, SAH 농도 및 DNA 메틸화에는 유의적인 영향을 주지 않았으므로 뇌조직의 메틸기 대사와 DNA 메틸화는 엽산 및 콜린 결핍에 덜 민감하게 영향을 받는 것으로 나타났다. 메티오닌이충족된 식이조건에서 콜린 결핍은 메틸기 대사에 미치는 영향이 경미하여 혈중 호모시스테인농도와 간 및 뇌조직의 SAM, SAH에 유의적인 영향을 주지 않았다.
그러나 엽산결핍식이는 뇌조직의 SAM, SAH 농도 및 DNA 메틸화에는 유의적인 영향을 주지 않았으므로 뇌조직의 메틸기 대사와 DNA 메틸화는 엽산 및 콜린 결핍에 덜 민감하게 영향을 받는 것으로 나타났다. 메티오닌이충족된 식이조건에서 콜린 결핍은 메틸기 대사에 미치는 영향이 경미하여 혈중 호모시스테인농도와 간 및 뇌조직의 SAM, SAH에 유의적인 영향을 주지 않았다. 따라서 뇌조직의 메틸기 대사는 엽산과 콜린 결핍에 의해 간조직 보다 덜 민감하게 영향을 받으며, 간과 뇌조직의 메틸기 대사는 조직에 특이적인 방식으로 조절되는 것으로 사료된다.
메티오닌이충족된 식이조건에서 콜린 결핍은 메틸기 대사에 미치는 영향이 경미하여 혈중 호모시스테인농도와 간 및 뇌조직의 SAM, SAH에 유의적인 영향을 주지 않았다. 따라서 뇌조직의 메틸기 대사는 엽산과 콜린 결핍에 의해 간조직 보다 덜 민감하게 영향을 받으며, 간과 뇌조직의 메틸기 대사는 조직에 특이적인 방식으로 조절되는 것으로 사료된다.
메티오닌이충족된 식이조건에서 콜린 결핍은 메틸기 대사에 미치는 영향이 경미하여 혈중 호모시스테인농도와 간 및 뇌조직의 SAM, SAH에 유의적인 영향을 주지 않았다. 따라서 뇌조직의 메틸기 대사는 엽산과 콜린 결핍에 의해 간조직 보다 덜 민감하게 영향을 받으며, 간과 뇌조직의 메틸기 대사는 조직에 특이적인 방식으로 조절되는 것으로 사료된다.
엽산결핍 식이군의 혈장 엽산농도는 대조군의 18% 수준으로 저하되었으며 (p < 0.001) 간의 엽산농도는 대조군의 23% 수준(P < 0.001), 뇌의 엽산농도를 대조군의 70% 수준으로 저하되었다 (p < 0.05). 콜린결핍 식이를 급여하였을 때, 간 엽산농도는 85% 수준으로 저하되었으나 (p < 0.
엽산결핍 식이를 급여하였을 때 간의 SAH 함량은 대조군보다 47% 상승되고 (p < 0.001) SAMe 대조군보다 43% 저하되었고 SAM/SAH 비율은 대조군의 30% 수준으로 저하되어 (p < 0.001) 메틸기가 심각하게 결핍되었으며, 이로 인해 간조직의 DNA메틸화가 저해되었다. 그러나 콜린 결핍 식이 급여는 간과 뇌조직의 SAM과 SAH 농도에 영향을 주지 않았으며, 간조직의 DNA 메틸화는 저하시켰으나 뇌 조직의 DNA 메틸화에는 유의적인 영향을 주지 않았다.
이상에서와 같이 엽산결핍 식이급여로 인한 저조한 엽산 영양 상태는 호모시스테인혈증과 간조직의 SAH 농도 증가 및 SAM 농도 저하를 가져옴으로써 간조직 genomic DNA 메틸화를 저해하였으나, 뇌조직의 DNA 메틸화에는 영향을 주지 않았다. 그러나 콜린결핍 식이급여는 메티오닌 공급이 충분한 조건에서 메틸기 대사에 영향을 주지 않았지만, 간 조직 genomic DNA 메틸화를 유의적으로 저해하였다.

후속연구

이들 메틸기 대사반응의 biomarker들의 상관성 연구는 인지능력 부전의 위험인자로 작용하는 혈장 호모시스테인 또는 SAM과 SAH 수준의 개선과 인지능력부전의 예방 및 치료연구를 위한 기초자료가 될 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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