항생제 내성 및 감수성 Salmonella typhimurium 균주에 대한 개똥쑥 지상부 정유와 Kanamycin의 병용효과 In vitro Effects of Essential Oils from the Aerial Parts of Artemisia annua L. Against Antibiotic-Susceptible and -Resistant Strains of Salmenella typhimurium원문보기
The essential oil fraction from the aerial parts of A. annua was analyzed by GC-MS. As the results, caryophyllene oxide (11.7%), caryophyllene (7.54%), camphor (7.32%), 1,8-cineol (4.98%), and borneol (3.99%) were confirmed as the main components of the oil fraction. The effects of this oil and its ...
The essential oil fraction from the aerial parts of A. annua was analyzed by GC-MS. As the results, caryophyllene oxide (11.7%), caryophyllene (7.54%), camphor (7.32%), 1,8-cineol (4.98%), and borneol (3.99%) were confirmed as the main components of the oil fraction. The effects of this oil and its main components on antibiotic-susceptible and -resistant strains of Salmonella enteritidis and S. typhimurium were assessed. A. annua oil fraction significantly inhibited all strains of the two Salmonella species examined, with minimum inhibiting concentrations (MICs) ranging from 2.0 mg/ml to 8.0 mg/ml. Among the main components of the oil, borneol and camphor showed relatively strong inhibiting activity with MICs between 1.0 mg/ml and 4.0 mg/ml. The MICs of caryophyllene and caryophyllene oxide were higher than 16 mg/ml. The combination effects of the oils with kanamycin were evaluated using a checkerboard microtiter assay. Against S. typhimurium KCCM11862 and CCARM8009 strains, the oil fraction of A. annua, camphor, and 1,8-cineol exhibited significant synergistic with kanamycin with fractional inhibitory concentration (FIC) indices in the range of 0.085 to 0.375. In conclusion, a combination of kanamycin and A. annua oil or its main component, camphor, and cineol, may be useful for reducing the minimum effective dose of antibiotic required for the treatment of resistant S. typhimurium infections.
The essential oil fraction from the aerial parts of A. annua was analyzed by GC-MS. As the results, caryophyllene oxide (11.7%), caryophyllene (7.54%), camphor (7.32%), 1,8-cineol (4.98%), and borneol (3.99%) were confirmed as the main components of the oil fraction. The effects of this oil and its main components on antibiotic-susceptible and -resistant strains of Salmonella enteritidis and S. typhimurium were assessed. A. annua oil fraction significantly inhibited all strains of the two Salmonella species examined, with minimum inhibiting concentrations (MICs) ranging from 2.0 mg/ml to 8.0 mg/ml. Among the main components of the oil, borneol and camphor showed relatively strong inhibiting activity with MICs between 1.0 mg/ml and 4.0 mg/ml. The MICs of caryophyllene and caryophyllene oxide were higher than 16 mg/ml. The combination effects of the oils with kanamycin were evaluated using a checkerboard microtiter assay. Against S. typhimurium KCCM11862 and CCARM8009 strains, the oil fraction of A. annua, camphor, and 1,8-cineol exhibited significant synergistic with kanamycin with fractional inhibitory concentration (FIC) indices in the range of 0.085 to 0.375. In conclusion, a combination of kanamycin and A. annua oil or its main component, camphor, and cineol, may be useful for reducing the minimum effective dose of antibiotic required for the treatment of resistant S. typhimurium infections.
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문제 정의
그래서 이 식물의 정유 분획을 이용하거나 정유중의 타 성분으로부터 활성성분을 개발하기 위한 연구가 추진되고 있다. 본 논문에서는 개똥쑥을 수증기 증류하여 얻은 정유 분획의 조성을 GC-MS로 분석하고, 이 정유로부터 장관계통 감염균의 주류를 이루는 Salmonella 속 균 중에서 특히 감염된 동물을 통하여 사람에게로 이차적으로 전파되어 여러가지 질병을 유발시키는 Salmenella iyphimuriume S. enteritidis 내성균에 대한 억제 효과를 실험하고, 또한 이 중 개똥쑥 정유에 대해 보다 강한 감수성을 나타낸 Salmenella 切ph初nwium의 kanamycin 내성 및 감수성 균주에 대한 개똥쑥 정유 분획 및 주성분과 kanamycin 의 병용효과를 실험한 결과, 현저한 상승효과를 확인하였기에 그 결과를 보고한다.
본 연구에서는 개똥쑥의 정유로부터 , 감염된 동물을 통하여 사람에게로 이차적으로 전파되어, 특히 사육과정에서 항생제를 투여한 가축을 재료로 한 식품 등을 먹을 경우, 기존의 항생제로 치료되기 어려운 여러가지 질병을 유발시키는 S. e派澜d代와 Salmenella typhimurium 내성균에 대한 억제물질을 개발하는 것을 목표로 실험을 시행하였는데, 그 결과는 다음과 같다.
5£)그러나 기존항생제에 전반적으로 약한 정유의 항균활성은 치료제로의 개발 가능성을 떨어뜨리고 있다. 이에 대한 해결방안 중 하나가 정유와 기존 항생제의 병용에 의한 상승작용을 이용하는 것이다.9-世
p data-page="1">전 세계적으로 급속히 증가하는 내성균의 출현은 인류의 미래를 위협하고 있으며, 새로운 치료제의 개발의 필요성을 가중시켰다. 이 중 장관계통 감염균의 주류를 이루며, 동, 식물성 식품이나 감염된 동물을 통하여 사람에게로 이차적으로 전파되어 여러 가지 질병을 유발시키는 Salmonella 속 다제 내성균의 빠른 증가 속도는 나날이 더욱 큰 문제로 부각되고 있다.
제안 방법
댠i다 작거나 같을 때 synergistic effect7} 있는 것으로, 0>5와 4 사이면 indifferent 또는 additive로, 4보다 클 때 antagonistic effect로 판정하였다.'& 이어 실험한 96 well plate 상에서 균 생장을 억제 시킨 최소한의 배합농도 각각의 수치로 isobologram 을 그려 곡선의 휘어진 상태로 병용효과를 판정하였다.
96 well plate의 각 well의 가로 방향으로 최고농도 50mg/m/ 에서 최저농도가 0.78 II回m/에 이르도록 2% Tween 80을 포함한 배지로 단계적으로 희석한 개똥쑥 정유 분획, camphor 또는 1, 8-cineol 50 p/를 넣고 세로방향으로는 이와 유사한 방법으로 항생제를 각각 DMSO(99%)에 녹인 배수 희석액을 제조하여, 각각 한 농도의 sample을 각 well 마다 5씩 첨가하였다. 여기에 Mcferland 0.
Kanamycin, norfloxacine dimethylsulfoxide①MS。® 용매로, amphicilline 증류수를 용매로 하여, 2mg/mZ부터 8단계 까지의배수 희석액을 제조하였다. 각각 한 농도의 sample을 각 well 마다 5 ]北씩을 주입하고, 균액 100 讨, 배지 95 를 첨가하고, 정유와 같은 조건에서 배양하였다. 사용한 용매와 Tween 80이 시료의 항균력에 영향을 미치지 않았음을 대조실험을 통해 확인하였다.
이에 정유와 기존항생제의 병용에 의한 효과상승을 유도하여, 안전하고 강력한 항균제를 개발 하는 방법이 연구되고 있다. 본 연구에서는 개똥쑥 정유와 항생제와의 병용효과를 checkerboard microtiter test를 행하였는데, 대상 항생제로는 본 실험에 사용한 균주에 대한 감수성과 내성이 뚜렸이 구분되는 kanamycin을 선택하여, S. typhimurium 3종 strain에 대해 실험하였다. 정유 주성분 중에서는 다량함유 되어 있으나 활성이 약한 caryophyllene oxide 와 caryophyllene를 실험대상에서 배제하고, 다음으로 함량이 높고, 앞의 두 성분 보다 활성이 높은 1, 8-cineol과 camphor를 선택하여 실험하였다.
수증기 증류에서 얻은 개똥쑥 정유와 주성분인 borneol, camphor, caryophyllene, caryophyllene oxide 및 1, 8-cineol을에탄올과 소량의 Tween 80을 가하여 현탁시킨 후 syringe filter 로 무균 여과하여, 최고농도 50mg/mZ에서 최저농도가 0.78 mg/ m/에 이르도록 단계적으로 희석하여 96 well plate의 각 well에 100 略 주입한 후 균액을 100 畦 첨가하였다. 이것을 shaking incubator(100 rpm)에 넣고 36℃에서 24시간 배양한 후, 육안으로 관찰하여 균의 성장이 억제된 최저농도(MUC)를 판별하였다.
78 II回m/에 이르도록 2% Tween 80을 포함한 배지로 단계적으로 희석한 개똥쑥 정유 분획, camphor 또는 1, 8-cineol 50 p/를 넣고 세로방향으로는 이와 유사한 방법으로 항생제를 각각 DMSO(99%)에 녹인 배수 희석액을 제조하여, 각각 한 농도의 sample을 각 well 마다 5씩 첨가하였다. 여기에 Mcferland 0.5의 탁도로 조절한 S. typhimurium 각 strain의 현탁액 145 以를 가하고, 위와 같은 조건으로 배양한 후 균이 억제된 최소농도의 배합비율을 관찰하였다. 가장 효율적2로 나타난 배합농도의 결과를 Table m의 각주에 기록된 공식에 대입하여 fractional inhibiting concentrmtion(FIC)를 산출하여 FIC index 가 0.
78 mg/ m/에 이르도록 단계적으로 희석하여 96 well plate의 각 well에 100 略 주입한 후 균액을 100 畦 첨가하였다. 이것을 shaking incubator(100 rpm)에 넣고 36℃에서 24시간 배양한 후, 육안으로 관찰하여 균의 성장이 억제된 최저농도(MUC)를 판별하였다. Kanamycin, norfloxacine dimethylsulfoxide①MS。® 용매로, amphicilline 증류수를 용매로 하여, 2mg/mZ부터 8단계 까지의배수 희석액을 제조하였다.
typhimurium 3종 strain에 대해 실험하였다. 정유 주성분 중에서는 다량함유 되어 있으나 활성이 약한 caryophyllene oxide 와 caryophyllene를 실험대상에서 배제하고, 다음으로 함량이 높고, 앞의 두 성분 보다 활성이 높은 1, 8-cineol과 camphor를 선택하여 실험하였다. Table HI에 정리된 바와 같이 kanamycin과 개똥쑥 정유 또는 주성분인 camphor, 1, 8-cineol의 병용은 S.
추출한 정유의 조성은 정유의 조성은 Hewlett-Packard 6890 GC와 Hewlett-Packard 5973 MSD 분석기기에 2% 용액(ether) 1 以씩을 주입하여 아래와 같은 조건에서 분석하였다. 측정된 각 peak의 mass spectrume computer에 저장된 mass data(PBM Search of Library file: Data: Wiley L.
대상 데이터
S. enteritidis KCCM12201, S. enteritidis CCARM8010, S. enteritidis CCARM8011, S. typhimurium KCCM11862, S. typhimurium CCARM8007, S. typhimurium CCARM8009를한국미 생물보존센터 (KCCM)와 항생제내성 균주은행 (CCARM)에서 분양받아서, Muller-Hinton I 액체배지에 (BD) 배지에 현탁하고, McFarland 0.5 Standard와 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1X104~]05cFU/m/가 되게 만들어서 MIC 측정과 checkerboard titer test에 사용하였다.
경상북도 영천 지역의 들판에 야생하는 개똥쑥의 지상부를 8 월말 채취하여 건조한 것(6.2 kg)을 수차에 나누어 simultaneous steam distillation-extraction apparatus(SDE) 장치에서 5시간 수증기 증류하고, 수집된 ether층과 수층을 ether로 추출한 것을 합하여 , 감압 농축하여 정유를 채취하였다. 표본(CHR3)은 덕성여자대학교 약학대학 식물표본실에 보관하였다 .
데이터처리
以씩을 주입하여 아래와 같은 조건에서 분석하였다. 측정된 각 peak의 mass spectrume computer에 저장된 mass data(PBM Search of Library file: Data: Wiley L.)와 비교하여 구조를 동정하였다. Carrier gas: He (0.
이론/모형
enteritidis 3종 strain에 대해 균 생장 최소억제농도(MIC)를 측정한 결과를 Table Ⅱ에 정리하였다. 기존의 항생제에 대한 내성 감수성에 대한 MIC 판정기준은 NCCLS 2007년도 판用에 보고 된 바를 적용하였다, 본 실험에 사용한 6종의 Salmonella strain 은 모두 norfloxacin에 대하여 감수성 G 4)을, amphicillin에 대해서는 내성(232)을 나타내었다. Kanamycin에 대하여는 S.
성능/효과
개똥쑥 정유의 구성 성분 중 가장 강력한 항균작용을 나타낸 성분은 borneol로 1 mg/m/의 MIC를나타내었다. Camphor의 MIC는 2 mg/mZ~4 m以!nZ로 borneol 의약 2배 정도였으며, 1, 8-cineole 4mg/mZ~16mg/m/의 MIC로 borneol 이나 camphor에 비해 상대적으로 약한 항균력을 보였다. 전반적으로 개똥쑥 정유의 항 Sal%邮血 작용에 있어서 ■ 항생제 감수성 균주와 내성 균주가 구분될 만한 차이는 확인되지 않았다.
typhimurium 각 strain의 현탁액 145 以를 가하고, 위와 같은 조건으로 배양한 후 균이 억제된 최소농도의 배합비율을 관찰하였다. 가장 효율적2로 나타난 배합농도의 결과를 Table m의 각주에 기록된 공식에 대입하여 fractional inhibiting concentrmtion(FIC)를 산출하여 FIC index 가 0.댠i다 작거나 같을 때 synergistic effect7} 있는 것으로, 0>5와 4 사이면 indifferent 또는 additive로, 4보다 클 때 antagonistic effect로 판정하였다.'& 이어 실험한 96 well plate 상에서 균 생장을 억제 시킨 최소한의 배합농도 각각의 수치로 isobologram 을 그려 곡선의 휘어진 상태로 병용효과를 판정하였다.
개똥쑥 정유분획은 실험한 모든 항생제에 대한 감수성 및 내성 Salmonella 균주에 대해 억제효과를 보였는데, 균주에 따른 MIC(2 m以mZ~8 mg/mZ)에 있어서의 현저하게 큰 차이는 나타나지 않았다. 이 정유에서 가장 함유율이 높은 caryophyllene oxide 는 MIC가 >16 이상 이었고, caryophyllene 또한 约16으로 나타나, 이들 성분은 정유 분획의 항균작용에 거의 기여하지 않는 것。로 판단되었다.
전반적으로 개똥쑥 정유의 항 Sal%邮血 작용에 있어서 ■ 항생제 감수성 균주와 내성 균주가 구분될 만한 차이는 확인되지 않았다. 결과적으로 개똥쑥 정유분획이나 일부 주성분들은 항생제 감수성 균주 뿐 아니라 내성 균주에 대한 억제제로 사용될 수 있음을 시사하였다. 본 연구에 있어서의 Salmonella 억제 실험 결과는 Rasooli 등22)이 개똥쑥 정유로 수종 곰팡이에 대하여 실험했을 때와 비교하면, 효과가 낮은 것으로 판단되지만 이외에도 많은 경우에 정유가 박테리아보다 곰팡이에 더 강한 항균력을 나타내는 것이 보고되어 있다.
병용에 의한 synergism로 가장 큰 것으로 나타났다. 결론적으로 개똥쑥 지상부 정유 분획과 그 주성분인 borneol, camphor 및 1, 8-cineole 본 실험에 사용한 S. enteritidis 및 S. typhimurium pneumoniae 항생제 감수성 및 내성 균주 모두에 항균작용을 나타냄을 확인하여, 이 정유의 항생제 내성 Salmonella 균주 감염에의 이용 가능성을 제시하였다. 또한 정유와 항생제와의 병용시에 나타나는 항균효과의 현저한 synergisme 항생제사용을 줄여, 내성균 발생억제에 기여할 수 있을 것이 기대된다.
함량이 높았다. 그 외 비교적 적은 양이지만 국화과 특유의 성분인 vulearone B(2.39%), vulgarol B(0.82%), chrysanthenyl acetate(0.38%) 및 chamazulene(0.38%)°] 확인되었다. 본 연구에서 분석한 개똥쑥 정유에서는 Ma 등'°이 보고한 artemisia ketone 이나 arteannuic acid는 확인되지 않았고, bomeol(15.
5%)가 주성분으로 확인되었다. 그러나 이 같은 정유조성의 차이는 식물의 자생조건, 채취 시기, 추출조건 등 여러가지 요인에 의해 흔히 나타나는 결과이며, 따라서 같은 종의 개똥쑥이라도, 실험 시료에 따라 활성실험의 결과에 많은 차이가 있을 수 있다는 것이 예측되었다.
사용한 용매와 Tween 80이 시료의 항균력에 영향을 미치지 않았음을 대조실험을 통해 확인하였다. 대조실험에서는 시료를 제외하고 균과 용매, Tween 80를 본 실험과 같은 조건에서 배양하여, 균만을 배양했을 때와 비교하여 균 생장에 첨가한 Tween 80이 영향을 주지 않음을 확인하였다.
185S. 병용에 의한 synergism로 가장 큰 것으로 나타났다. 결론적으로 개똥쑥 지상부 정유 분획과 그 주성분인 borneol, camphor 및 1, 8-cineole 본 실험에 사용한 S.
각각 한 농도의 sample을 각 well 마다 5 ]北씩을 주입하고, 균액 100 讨, 배지 95 를 첨가하고, 정유와 같은 조건에서 배양하였다. 사용한 용매와 Tween 80이 시료의 항균력에 영향을 미치지 않았음을 대조실험을 통해 확인하였다. 대조실험에서는 시료를 제외하고 균과 용매, Tween 80를 본 실험과 같은 조건에서 배양하여, 균만을 배양했을 때와 비교하여 균 생장에 첨가한 Tween 80이 영향을 주지 않음을 확인하였다.
Camphor의 MIC는 2 mg/mZ~4 m以!nZ로 borneol 의약 2배 정도였으며, 1, 8-cineole 4mg/mZ~16mg/m/의 MIC로 borneol 이나 camphor에 비해 상대적으로 약한 항균력을 보였다. 전반적으로 개똥쑥 정유의 항 Sal%邮血 작용에 있어서 ■ 항생제 감수성 균주와 내성 균주가 구분될 만한 차이는 확인되지 않았다. 결과적으로 개똥쑥 정유분획이나 일부 주성분들은 항생제 감수성 균주 뿐 아니라 내성 균주에 대한 억제제로 사용될 수 있음을 시사하였다.
11%(w/w)였다. 추출한 정유를 GC-MS로 분석한 결과 총 85종의 성분이 확인되었다. Table I에 정리된 바와 같이 개똥쑥 정유에 가장 많이 함유된 성분은 sesquiterpene 화합물인 caryophyllene oxide(11.
후속연구
또한 정유와 항생제와의 병용시에 나타나는 항균효과의 현저한 synergisme 항생제사용을 줄여, 내성균 발생억제에 기여할 수 있을 것이 기대된다. 그러나 앞으로 좀더 광범위하게 수집된 많은 내성균주 strain에 대한 실험이 필요할 것으로 생각된다.
typhimurium pneumoniae 항생제 감수성 및 내성 균주 모두에 항균작용을 나타냄을 확인하여, 이 정유의 항생제 내성 Salmonella 균주 감염에의 이용 가능성을 제시하였다. 또한 정유와 항생제와의 병용시에 나타나는 항균효과의 현저한 synergisme 항생제사용을 줄여, 내성균 발생억제에 기여할 수 있을 것이 기대된다. 그러나 앞으로 좀더 광범위하게 수집된 많은 내성균주 strain에 대한 실험이 필요할 것으로 생각된다.
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