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문제 정의
- 이 18B-GA는 항궤양, 항종양, 항간 독성, 면역조절효과 등의 생리활성효과가 있는 것으로 보고된바 있다.”43)본 연구에서 18|3-GA의 항관절염 작용기전 조사를 위해 NO(Nitric oxide) 생성억제효과와 CD4 + T-lymphocyte 증식억제 효과를 검색하였는데, 이러한 방법을 선정하게 된 배경은 다음과 같다. 관절염형성과정에는 macrophage, B-lymphocyte, mast cells, fibroblast-like synoviocyte 등의 과다 활성으로 인해 분비되는 염증유발물질이 관여하고, 妇6)CD4+ T-lymphocyte 증식에서 발생되는 염증성 cytokine 분비 또한 관절염을 유발하는 것으로 알려져 있다.
- 이 연구를 위해, 청열해독(淸熱解毒)에 적용되는 한약재에 대한 문헌고찰을 통해서 항염효과를 가질 것으로 예상되는 Glycyrrhizae Radix(감초)의 주요성분인 18[3-glycyrrhetinic acid (18§-GA)의 항염증효과를 조사하였다. 18伊GA는 pentacyclic triterpene으로 p-amyrin 계열에 속하는 성분으로, 项 이 성분은 triterpene 배당체로 감초의 지표성분인 glycyrrhizin의 비당부 (aglycone)이기도 하다(Fig.
- p data-page="1">최근 전 세계적으로 천연물(natural product)의 효능에 대하여 많은 연구가 진행되고 있으며, 국내에서도 국가적 차원에서 천연물에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구의 일환으로, 본 연구에서는 천연물을 선정하여 감염성관절염에 대한 항염증 효과를 조사하고자 하였다.
- %19)그러므로 CD4+ T-cell을 조절하는 물질은 항관절염 효과가 있을 것으로 예상된다. 이를 근거로 하여 , 본 연구에서는 180-GA의 CD4 + T-lymphocyte 증식억제작용과 함께 NO 생성억제작용에 따른 감염성관절염치료 및 예방효과를 검색하기위해, 감염성 진균 중에서 가장 많은 문제를 야기하는 Candida albicanse: 사용하여 in-vivo 조건하에서 조사하였다.
- 있다. 이를 근거로 하여 180-GA의 항관절염 작용기전을 조사하기 위해서 이 감초성분의 T-lymphocyte 증식억제에 대한 효과를 검색하였다. 즉, T-lymphocyte의 증식을 촉진하는 것으로 알려진 concanavalin A(Con A)로 처리한 다음에 이 감초성분을 투여해서 180-GA의 T-lymphocyte 증식억제효과를 측정하였다.
제안 방법
- 18|3-GA가 나타내는 항관절염효과의 작용기전을 검색하기 위해 우선적으로 관절염 발병시 염증부위로 이동하여 부종을 유발하는 macrophage와 활성된 macrophage에 의한 NO 생성에 대하여 180-GA의 NO 생성억제효과를 조사하였다. 실험결고)■, 180-GA로 처리한 macrophage에서의 NO 생성량은 감소되었으나 LPS만으로 처리한 macrophage(양성대조군)과 비교할 때 그 효과가 현저하지는 않았다(Fig.
- C. 의 세포벽분리는 본 연구실의 이전 연구에서 보고한 방법을 사용하였다.緋22)이 방법을 간략히 기술하면 다음과 같다.
- 緋22)이 방법을 간략히 기술하면 다음과 같다. GYEP(glucose-yeast extract peptone) 액체배지에 배잉1한; C. albicans 균을 수집하여 disodium EDTA(0.1 M; pH 7.5)와 trisodium EDTA(0.1 M; pH 9.0)로 연속 처리하고 0.3 M 2-mercaptoethanol로 30분 동안 실온에서 처리한 후 상등액을 수집하여 투석막(Sigma, St. Louis, MO, USA; membrane cut-off = 12,000 Da)에 넣고 멸균된 탈 이온수를 투석 액으로 하여 3일 동안 투석하였다. 투석이 완료된 후 투석막 내부물질을 동결건조(Eyela FD-1000, Tokyo, Japan同여 분말화 하였다.
- 18I3-GA의 항관절염효과를 검색하였다. 간략히 기술하면, 1 ml CFA(Complete Freund's Adjuvant; GibcoBRL, NY, USA)와 Im/ DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline solution; Sigma) 에 용해한 C. albicans cell wall(CACW; 1 mg)을 혼합하여 sonicator(Sonics & Materials Inc, CT, USA)로 유화시킨 후 syringe를 이용하여 50 pZ/mouse 용량으로 생쥐의 오른쪽 발바닥(footpad)에 피하주사하여 족부종을 유발시킨 후 이 생쥐에게 哪-GA를 1회 1 mg/mouse 농도로 3일에 한번씩 3회 복강 내로 투여하였다. 음성대조군 생쥐에게는 18p-GA 대신 희석액으로 사용한 DPBS를 투여하였다.
- 예방효과를 검색하기 위하여 족 부종 유발을 시작한 날짜(0 일)를 기점으로 하여 -9, -6, -3 일에 18p-GA를 먼저 투여하고 마지막 약물투여 3일 후에 상기 방법에 따라 족부종을 유발하기 위해 CACW와 CFA의 혼합물(CACW/CFA) 을 접종하였다. 그리고 치료효과를 검색하기 위해서 CACW/CFA 을 상기 방법처럼 생쥐에 접종하고 3, 6, 9일에 18伊GA를 투여하였다. 족부종의 정도는 3일에 한번씩 dial calipers(Mitatoyo Co.
- 후 본 실험에 사용하였다. 본 실험에서는 이 splenocytes (5 X106 cells/well)°l] concanavalin A(5 mg/m/; C2010; Sigma)를 투여하고 다양한 농도(5~80 nN)의 18&-GA를 첨가하였다. 이를 동일한 배양조건에서 72시간 배양한 다음 CCK-8(Cell Count Kit-8; Dojindo Lab; Japan)를 투여하고 3시간 더 배양한 후에 Tlymphocytes의 증식억제효과를 검색하였다.
- 본 연구실의 이전 실험에 사용한 방법1)을 통해 188-GA의 NO 생성억제여부를 검색하였다. 즉, RAW264.
- 본 연구실의 이전 연구에서 정립된 관절염동물모델°을 사용하여 18I3-GA의 항관절염효과를 검색하였다. 간략히 기술하면, 1 ml CFA(Complete Freund's Adjuvant; GibcoBRL, NY, USA)와 Im/ DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline solution; Sigma) 에 용해한 C.
- 각 그룹은 생쥐 5마리씩2로 구성하였다. 부종억제정도는[(약물투여군의 일정시간 후의 평균 부종율-대조군의 일정시간후의 평균 부종율)/대조군의 일정시간 후의평균부종율]X100으로 계산하여 부종억제율(%)로 환산하였다.
- 음성대조군 생쥐에게는 18p-GA 대신 희석액으로 사용한 DPBS를 투여하였다. 예방효과를 검색하기 위하여 족 부종 유발을 시작한 날짜(0 일)를 기점으로 하여 -9, -6, -3 일에 18p-GA를 먼저 투여하고 마지막 약물투여 3일 후에 상기 방법에 따라 족부종을 유발하기 위해 CACW와 CFA의 혼합물(CACW/CFA) 을 접종하였다. 그리고 치료효과를 검색하기 위해서 CACW/CFA 을 상기 방법처럼 생쥐에 접종하고 3, 6, 9일에 18伊GA를 투여하였다.
- albicans cell wall(CACW; 1 mg)을 혼합하여 sonicator(Sonics & Materials Inc, CT, USA)로 유화시킨 후 syringe를 이용하여 50 pZ/mouse 용량으로 생쥐의 오른쪽 발바닥(footpad)에 피하주사하여 족부종을 유발시킨 후 이 생쥐에게 哪-GA를 1회 1 mg/mouse 농도로 3일에 한번씩 3회 복강 내로 투여하였다. 음성대조군 생쥐에게는 18p-GA 대신 희석액으로 사용한 DPBS를 투여하였다. 예방효과를 검색하기 위하여 족 부종 유발을 시작한 날짜(0 일)를 기점으로 하여 -9, -6, -3 일에 18p-GA를 먼저 투여하고 마지막 약물투여 3일 후에 상기 방법에 따라 족부종을 유발하기 위해 CACW와 CFA의 혼합물(CACW/CFA) 을 접종하였다.
- 3일~ 15일 기간)에는 2 mg 18p-GA로 처리했을 경우 lmg 180-GA로 처리했을 때보다 더 높은 치료 효과를 보였다. 이 항 감염성관절염 효과의 작용기전을 조사하기 위해서 먼저 macrophage에서 생성되는 NO의 양을 대조군의 경우와 비교하였다. 결과적으로 18J3-GA가 macrophage의 활성을 억제하여 NO 생성을 감소시킴을 Griess 시험법으로 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서는 이 splenocytes (5 X106 cells/well)°l] concanavalin A(5 mg/m/; C2010; Sigma)를 투여하고 다양한 농도(5~80 nN)의 18&-GA를 첨가하였다. 이를 동일한 배양조건에서 72시간 배양한 다음 CCK-8(Cell Count Kit-8; Dojindo Lab; Japan)를 투여하고 3시간 더 배양한 후에 Tlymphocytes의 증식억제효과를 검색하였다.
- 그리고 치료효과를 검색하기 위해서 CACW/CFA 을 상기 방법처럼 생쥐에 접종하고 3, 6, 9일에 18伊GA를 투여하였다. 족부종의 정도는 3일에 한번씩 dial calipers(Mitatoyo Co., IL, USA)로 측정하였다. 각 그룹은 생쥐 5마리씩2로 구성하였다.
- 검색하였다. 즉, RAW264.7 monocyte/macro-phage cell line을 RPMI 1640 배지 (Sigma)에 배양한 후 다양한 농도의 180-GA로 처리하고, Griess 시약을 사용하여 NO 생성억제 유무를 검색하여 항염증효과 여부를 조사하였다.
- 이를 근거로 하여 180-GA의 항관절염 작용기전을 조사하기 위해서 이 감초성분의 T-lymphocyte 증식억제에 대한 효과를 검색하였다. 즉, T-lymphocyte의 증식을 촉진하는 것으로 알려진 concanavalin A(Con A)로 처리한 다음에 이 감초성분을 투여해서 180-GA의 T-lymphocyte 증식억제효과를 측정하였다. 실험 결과, 40 mM의 농도에서는 거의 80% 이상의 T-lymphocyte의 증식억제 효과가 있었으며(F<0.
- Louis, MO, USA; membrane cut-off = 12,000 Da)에 넣고 멸균된 탈 이온수를 투석 액으로 하여 3일 동안 투석하였다. 투석이 완료된 후 투석막 내부물질을 동결건조(Eyela FD-1000, Tokyo, Japan同여 분말화 하였다. 추출한 세포벽은 desiccator안에 저장보관 하였다.
대상 데이터
- 180-GA는 Sigma에서 구입하였으며, 실험에 사용하기 전에 endotoxin 오염여부를 상업용 endotoxin 검색 kit(Sigma)을 사용하여 endotoxin 혼재유무를 확인한 후에 본 실험에 사용하였다.
- 6~7 주령의 BALB/c 암컷생쥐 (Charles River Lab, NY, USA) 를 사용하였으며 멸균된 사료(Orient Inc, Seoul, Korea) 및 물을 제공하고, 실험동물이 이를 자유롭게 먹도록 하였다. 구입한 생쥐는 실험실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험하였고, 동물.
- 6주령의 Balb/c 암컷생쥐에서 splenocyte를 무균조작으로 채취하여 RPMI 1640 배지에 넣고 35℃ CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 본 실험에 사용하였다. 본 실험에서는 이 splenocytes (5 X106 cells/well)°l] concanavalin A(5 mg/m/; C2010; Sigma)를 투여하고 다양한 농도(5~80 nN)의 18&-GA를 첨가하였다.
- Thickness of the edema was measured by a dial gauger in arbitrary unit (AU). Each group contained five mice. Bar indicates SE.
- 구입한 생쥐는 실험실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험하였고, 동물. 관리는 동덕여자대학교 동물관리규정에 따라 실험동물을 관리하였다.
데이터처리
- )로 계산하였다. 각 군 간의 유의성 검증은 Student's t-test를 사용하였고 값이 5% 미만일 때에 유의성이 있는 것2로 판정하였다.
- 실험결과는 평균土표준오차(Mean土S.E.)로 계산하였다. 각 군 간의 유의성 검증은 Student's t-test를 사용하였고 값이 5% 미만일 때에 유의성이 있는 것2로 판정하였다.
이론/모형
- 6沥如MS로 기인되는 감염성 관절염에 대한 효과는 아직 보고된 바가 없다. 그러므로 본 연구에서는 이에 대한 조사를 위해서 본 연구실에서 고안한 기존의 감염성 관절염 동물모델을 사용하였다. 염증을 유발시키기 위해서 CFA 를 병용한 이유는 관절염 형성을 증진시키기 위함이었다.
성능/효과
- 4). 10mM의 180-GA 농도로 처리했을 경우에는 대략 40%의 NO 생성이 억제되었다(F< 0.05)(Fig. 4).
- 염증을 유발시키기 위해서 CFA 를 병용한 이유는 관절염 형성을 증진시키기 위함이었다.D 이 C. albicans 기인성 관절염 Balb/c 생쥐(동물)모델을 사용하여 조사한 결과, 180-GA는 감염성 관절염에 대해서 예방효과 뿐만 아니라 치료효과도 있음이 규명되었다. 치료효과의 경우에는 농도 의존적으로 항 관절염효과가 관측되었고, 관절염 유발이 증가해서 감소되는 기간(Fig.
- 이 항 감염성관절염 효과의 작용기전을 조사하기 위해서 먼저 macrophage에서 생성되는 NO의 양을 대조군의 경우와 비교하였다. 결과적으로 18J3-GA가 macrophage의 활성을 억제하여 NO 생성을 감소시킴을 Griess 시험법으로 확인할 수 있었다. 이 결과를 고찰할 때, 관절염이 유발되면 macrophages가 그 관절염 발생부위로 유입되어 부종이 형성되고, 1522)자극된 macrophage에서 NO가 생성 분비되어서 주변의 세포와 조직을 파괴하기 때문에 통증이 야기되는데, 1423)이 감초 성분은 관절염부위에 유입된 macrophages로부터 NO 생성을 억제하여 C.
- 3). 또한 1耶-GA의 농도가 증가하면 더 높은 항관절염 치료효과가 관측되어 이 효과는 농도 의존적임을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 그러므로 180-GA의 항 감염성관절염의 작용기전은 NO 생성억제와 함께 T-cell의 증식억제에 의한 것으로 고려되어 진다. 본 연구결과를 종합하면, 천연물에서 획득되는 감초의 180-GA 성분이 C. albicans로 기인되는 관절염의 치료에 효과가 있다는 사실과 그 작용기전이 규명되었고, 이는 18B-GA가 부작용이 심한 기존의 Candida성 관절염 치료제를 대신할 수 있는 방안으로 사용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 본 연구실에서는 이 결과를 바탕으로 하여, 더욱 효과적인 180-GA의 전달을 위해 이 성분을 liposome에 포접시킨 제형을 개발하여 항 감염성 관절염 효과를 증대시키는 연구가 현재 진행 중에 있다.
- 생쥐에 족부종을 먼저 유발시킨 다음에 약물(18I3-GA)을 투여하여 치료효과를 검색한 결과에서도 180-GA의 감초성분은 항 관절염 효과가 검색되었다(Fig. 3). 하지만 예방효과의 결과와 비교 할 때, C.
- 생쥐에180-GA 또는 DPBSfmf 먼저 투여하고, 이후 C. albicans 세포벽으로 족부종을 유발시킨 예방효과조사결과에서 18伊GA를 투여받은 생쥐는 성분대신 DPBS를 투여 받은 대조군에 비해서 족부종이 감소되었다(Fig. 2). 즉, 관측 6일째는 음성대조군과 비교할 때 대략 15% 정도의 족부종 감소가 있었으며 12일, 15일에는 35%과 38% 정도로 족부종이 억제되어 C.
- 즉, T-lymphocyte의 증식을 촉진하는 것으로 알려진 concanavalin A(Con A)로 처리한 다음에 이 감초성분을 투여해서 180-GA의 T-lymphocyte 증식억제효과를 측정하였다. 실험 결과, 40 mM의 농도에서는 거의 80% 이상의 T-lymphocyte의 증식억제 효과가 있었으며(F<0.05), 이 억제효과는 농도 의존적이었다(Fig. 5).
- 실험결고)■, 180-GA로 처리한 macrophage에서의 NO 생성량은 감소되었으나 LPS만으로 처리한 macrophage(양성대조군)과 비교할 때 그 효과가 현저하지는 않았다(Fig. 4). 10mM의 180-GA 농도로 처리했을 경우에는 대략 40%의 NO 생성이 억제되었다(F< 0.
- 2). 이 180-GA의 항관절염효과는 총30일의 관찰기간 종료 때까지 음성대조군 생쥐의 족부종과 비교 했을 때 그 억제정도가 전반적으로 지속적 点 유지됨을 알 수 있었으며, 반복실험에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
- 2). 즉, 관측 6일째는 음성대조군과 비교할 때 대략 15% 정도의 족부종 감소가 있었으며 12일, 15일에는 35%과 38% 정도로 족부종이 억제되어 C. albiccms로 유발된 감염성관절염에 대해 180-GA가 항 관절염 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다(F<0.05)(Fig. 2). 이 180-GA의 항관절염효과는 총30일의 관찰기간 종료 때까지 음성대조군 생쥐의 족부종과 비교 했을 때 그 억제정도가 전반적으로 지속적 点 유지됨을 알 수 있었으며, 반복실험에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
- albicans 기인성 관절염 Balb/c 생쥐(동물)모델을 사용하여 조사한 결과, 180-GA는 감염성 관절염에 대해서 예방효과 뿐만 아니라 치료효과도 있음이 규명되었다. 치료효과의 경우에는 농도 의존적으로 항 관절염효과가 관측되었고, 관절염 유발이 증가해서 감소되는 기간(Fig. 2 참조. 3일~ 15일 기간)에는 2 mg 18p-GA로 처리했을 경우 lmg 180-GA로 처리했을 때보다 더 높은 치료 효과를 보였다. 이 항 감염성관절염 효과의 작용기전을 조사하기 위해서 먼저 macrophage에서 생성되는 NO의 양을 대조군의 경우와 비교하였다.
- 3). 하지만 예방효과의 결과와 비교 할 때, C. albicans 기인성 관절염에 대한 관절염치료효과는 다소 떨어짐이 관측되었다(Fig. 2 & 3). 한편, 족부종 염증이 가장 절정에 이르는 6일째서부터 18일째 까지의 기간 동안에 음성대조군과 비교했을 때 대략 20% 정도의 족부종 감소가 유지됨을 알 수 있었다(F<0.
- 2 & 3). 한편, 족부종 염증이 가장 절정에 이르는 6일째서부터 18일째 까지의 기간 동안에 음성대조군과 비교했을 때 대략 20% 정도의 족부종 감소가 유지됨을 알 수 있었다(F<0.05)(Fig. 3). 또한 1耶-GA의 농도가 증가하면 더 높은 항관절염 치료효과가 관측되어 이 효과는 농도 의존적임을 알 수 있었다(Fig.
후속연구
- albicans로 기인되는 관절염의 치료에 효과가 있다는 사실과 그 작용기전이 규명되었고, 이는 18B-GA가 부작용이 심한 기존의 Candida성 관절염 치료제를 대신할 수 있는 방안으로 사용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 본 연구실에서는 이 결과를 바탕으로 하여, 더욱 효과적인 180-GA의 전달을 위해 이 성분을 liposome에 포접시킨 제형을 개발하여 항 감염성 관절염 효과를 증대시키는 연구가 현재 진행 중에 있다.
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