활성화된 단핵구 및 대식세포의 항원제시기능에 대한 Kaempferitrin의 조절 효과 Modulatory Effect of Kaempferitrin, a 3,7-Diglycosylflavone, on the LPS-Mediated Up-regulation of Surface Co-stimulatory Molecules and CD29-Mediated Cell-cell Adhesion in Monocytic- and Macrophage-like Cells원문보기
Kaempferitrin, isolated from Kenaf (Hibiscus cannabinus), was examined to evaluate its modulatory effects on antigen-presenting cell functions of macrophages/monocytes such as phagocytosis of foreign materials, up-regulation of costimulatory molecules (CD40, CD80 and CD86), adhesion molecule activat...
Kaempferitrin, isolated from Kenaf (Hibiscus cannabinus), was examined to evaluate its modulatory effects on antigen-presenting cell functions of macrophages/monocytes such as phagocytosis of foreign materials, up-regulation of costimulatory molecules (CD40, CD80 and CD86), adhesion molecule activation, and antigen processing and presentation. Kaempferitrin strongly blocked up-regulation of CD40, CD80 and CD86, but not pattern recognition receptor (PRR) (e.g., TLR2). It also suppressed functional activation of CD29 (${\beta}1$-integrins), as assessed by cell-cell adhesion assay, required for T cell-antigen-presenting cell (APC) interaction. Furthermore, this compound did not block a simple activation of CD29, as assessed by cell-fibronectin adhesion assay. However, the compound did not diminish phagocytic uptake, an initial step for antigen processing, and ROS generation in RAW264.7 cells. In particular, to understand molecular mechanism of kaempferitrin-mediated inhibition, the regulatory role of LPS-induced signaling events was examined using immunoblotting analysis. Interestingly, this compound dose dependently suppressed the phosphorylation of $I{\kappa}B{\alpha}$, Src, Akt and Syk, demonstrating that it can negatively modulate the activation of these signaling enzymes. Therefore, our data suggested that kaempferitrin may be involved in regulating APC function-relevant immune responses of macrophages and monocytes by regulating intracellular signaling.
Kaempferitrin, isolated from Kenaf (Hibiscus cannabinus), was examined to evaluate its modulatory effects on antigen-presenting cell functions of macrophages/monocytes such as phagocytosis of foreign materials, up-regulation of costimulatory molecules (CD40, CD80 and CD86), adhesion molecule activation, and antigen processing and presentation. Kaempferitrin strongly blocked up-regulation of CD40, CD80 and CD86, but not pattern recognition receptor (PRR) (e.g., TLR2). It also suppressed functional activation of CD29 (${\beta}1$-integrins), as assessed by cell-cell adhesion assay, required for T cell-antigen-presenting cell (APC) interaction. Furthermore, this compound did not block a simple activation of CD29, as assessed by cell-fibronectin adhesion assay. However, the compound did not diminish phagocytic uptake, an initial step for antigen processing, and ROS generation in RAW264.7 cells. In particular, to understand molecular mechanism of kaempferitrin-mediated inhibition, the regulatory role of LPS-induced signaling events was examined using immunoblotting analysis. Interestingly, this compound dose dependently suppressed the phosphorylation of $I{\kappa}B{\alpha}$, Src, Akt and Syk, demonstrating that it can negatively modulate the activation of these signaling enzymes. Therefore, our data suggested that kaempferitrin may be involved in regulating APC function-relevant immune responses of macrophages and monocytes by regulating intracellular signaling.
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문제 정의
병리적으로는 이들 활성산소종 유래 라디칼이 과량으로 분비될 경우 노화나 암 및 염증 질환의 발생과 깊은 관련이 있어 ROS의 라디칼 소거능을 가지는 플라보노이드류 같은 항산화제들은 관련 질환의 치료 효능이 있는 것으로 보고되고 있다.2" 따라서, kaempferitrin이 대식세포 내에서 유도되는 라티칼 발생에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 그러나, Fig.
특별히 이들 과정을 조절하는 단백질은 CD18(p2-integrins) 및 CD29(pi-integrins) 등과 같은 adhesion molecule들로 알려져 있으며, 실제로 이들 단백질의 기능을 선택적으로 저해하는 특이항체 처리시 APC 기능매개에 의한 T cell 증식과정이 억제된 것으로 보고 되었다.23)따라서 APC 기능 수행에 필수적인 costimulatory molecule의 막표면 발현을 매우 효과적으로 억제한 kaempferitrin이 adhesion molecule의 활성조절은 어떤 영향을 나타내는지 조사하고자 하였다.
특별히 약常적으로 효능이 강한 플라보노이드 류에서 강한 세포독성이 나타난다는 것과 비교 시, ") 상대적으로 본 화합물이 우수하고 다양한 면역약리 작용을 보일 경우, 세포독성 측면에서 다른 플라보노이드류 보다 약물학적인 장점을 가질 것으로 판단된다. 따라서 면역약리학적 효능을 조사하기 위해, 활성화된 단핵구 및 대식세포를 이용하여 kaempferitirin의 조절능을 연구하여보았다.
하지만 renal cellular membrane 의 보호작용, 9)glucose transporter 조절을 통한 항당뇨 작용mm 및 항산화 작용, (2) 염증유발 물질(종양괴사인자 및 일산화질소 등) 분비 억제를 통한 항염증 작용'3)등이 kaempferitrin에 의해서 매개되는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 대식세포 및 단핵구에 의해 수행되는 내재성 면역반응에 관한 kaempferitrin 의 조절효과를 검증하고자 하였다. 특히 염증반응 이후 진행되는 대식세포 및 단핵구의 항원제시기능(antigen presentation function)에 대한 kaempferitrin의 조절 기능에 초점을 맞춰 연구하였기에 이를 보고하고자 한다.
본 연구자는 adhesion molecule인 CD29의 기능적 활성을 검증하기 위해서 U937 cell 및 CD29 활성 유도 항체를 이용하여, CD29 활성 매개성 세포세포간 유착 모델을 확립한 바 있다.⑹ 이들 모델은 CD29의 기능 매개에 의한 세포간 상호작용을 확인할 수 있는 실험법이므로, 본 연구에서 kaempferitrin의 효과 검증에 적용하여 보았다.
본 연구에서는 대식세포 및 단핵구에 의해 수행되는 내재성 면역반응에 관한 kaempferitrin 의 조절효과를 검증하고자 하였다. 특히 염증반응 이후 진행되는 대식세포 및 단핵구의 항원제시기능(antigen presentation function)에 대한 kaempferitrin의 조절 기능에 초점을 맞춰 연구하였기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
3A). 따라서, 본 연구에서는 Kaempferitrin이 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 높게 발현되는 CD40, CD8。, 및 CD86의 세포막단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 FACS 실험을 통해 조사하였다. 흥미롭게도, 이들 증가된 CD40, CD80, 및 CD86 발현양은 kaempferitrin 처리시 감소하는 것을 확인할 수가 있었다(Fig.
구성되어져 있다.24)따라서, kaempferitrin에 의한 세포간 유착과정 억제가 어떤 과정의 간섭에서 기인하는지 확인하기 위해 먼저 CD29 단백질 자체의 활성을 측정할 수 있는 세포-matrix protein(fibronectin)간의 유착실험 모델을 이용하여 연구하였다. 흥미롭게도, kaempferitrine U937 세포가 fibronectin에 유착되는 현상을 억제하지 못한 것으로 나타났다(Fig.
호중구) 매개에 의한 식세포 작용으로 알려져 있다.2D 특별히 이 과정은 세균들을 제거하기 위한 과정이면서 동시에 APC 의 항원가공 및 제시 기능을 위해 필수적인 전단계 이므로 kaempferitrin의 조절작용을 조사하여 보았다. 그러나 Fig.
그리고 형광으로 표지 된 particle FITC-dextran(2 mg/m/)을 세포에 처리하고 빛을 차단하여 30분간 배양하였다. Cold-PBS로 세포를 세척하여 미 탐식 된 입자를 제거하고 3.7% formaldehydes 고정 후 flow cytometer로 형광정도를 측정하였다.⑸
있다.⑹ 이들 모델은 CD29의 기능 매개에 의한 세포간 상호작용을 확인할 수 있는 실험법이므로, 본 연구에서 kaempferitrin의 효과 검증에 적용하여 보았다. Fig.
5, 25, 50, 100 및 200 μM)별로 세포 생존에 미치는 영향을 MTT assay법을 이용하여 분석하였다.「(4) 96- well plate에 1X10。개의 RAW264.7 세포를 plating하고 kaemp- feritrin을 농도 별로 처리하였다. 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다.
01 M HC1)을 분주하였다. 세포 생존율은 MTT7} formazan任로 환원된 양을 570nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였다.
Blocking한 plate를 RPMI1640 배지로 세 번 세척 후, kaempferitrin이 처리된 세포용액 100 \d 을 fibronectin-coated plate로 옮겨 넣고, 4시간 추가 배양을 실시하였다. 세포-Hbronectin 간 유착 정도는 0.1% crystal violet 용액을 첨가한 후 15분 동안 반응시키고, 10% acetic acid를 처리한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.⑸
세포성 면역활성 효과를 검증하기 위한 선행실험으로서, kaempferitrin 농도(0, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μM)별로 세포 생존에 미치는 영향을 MTT assay법을 이용하여 분석하였다.「(4) 96- well plate에 1X10。개의 RAW264.
7 세포Qxi06ceHs/m/)를 12-well plate에 1 ml/well 씩 분주 후 18시간 동안 전배양하였다. 앞의 실험 방법에서와 같이 kaempferitrin 또는 약물(각종 단백질의 억제자)과 LPS를 처리하여 S시간 배양 후, 세포를 회수흐}여 , 96 well round plate에 세포 수를 일정하게 분주하였다. 그리고 FACS buffer(2% FBS in PBS)로 세척하였다.
7 세포(5x l06cells/m/)를 6-well plate의 해당 well 에 Im/ 분주하고, 배지 3m/을 더한 후 18시간 동안 전 배양하였다. 앞의 실험 방법에서와 같이 kaempferitrin을 30분 전처리하고, LPS를 2분, 30분 처리한 후, 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 lysis buffer(함유조성: 20 mM Tris-HCl, pH 7.
우선 kaempferitrin의 세포독성 효과를 알아보기 위해 최대 200 gM 농도까지 대식세포 및 단핵구 암세포주에 24시간 동안처리흐卜였다. Fig.
Membrane을 5% BSA blocking buffer에서 반응시킨 후 특정 단백질에 특이한 1차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 2차 항체를 1시간 동안 추가적으로 처리한 후, ECL chemiluminescence로 반응 정도를 확인하였다.
3B)으로 보아, kaempferitrine 효과는 costimulatory molecule의 발현양 조절에만 관련되어 있는 것으로 판단된다. 한편 가장 발현변화가 큰 CD80을 이용하여 발현 증가 시 필수적인 세포 내 신호전달 과정을 조사하였다. Fig.
대상 데이터
세포배양을 위한 배양용 배지 RPMI1640 media, fetal bovine serum(FBS) 그리고 항생 제 (penicillin/streptomycin) 는 Hyclone(Hyclone, South Logan, UT USA)사 제품을 사용하였다. Human Hbronectine BD Biosciences(San Jose, CA USA)를 사용했고, CD80 (MEM-233, purified IgGl), CD86(BU63, purified IgGl), CD29(MEM 101A, IgGl, ascites)과 CD43(161-46, ascites, IgGl)는 각각 V Horejsi와 R Villela로부터 제공받았다. Src, Akt, JAK-2, Syk 및 IkBci에 대한 phospho-specific 항체는 Cell Signaling l&hnologies사 제품을 사용하였다.
RAW264.7 세포를 penicillin(100 IU/m/) 및 streptomycin (100 μg/m/)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 2 X l06cells/m/의 농도로 조절한 후, 6 well plate에 1 ml를 분주하고, 5% CO2 및 37℃에서 18시간 동안 전 배양하였다.15) 전배양 후 배지를 제거하고, PBS 495 B를 분주하였다.
Human Hbronectine BD Biosciences(San Jose, CA USA)를 사용했고, CD80 (MEM-233, purified IgGl), CD86(BU63, purified IgGl), CD29(MEM 101A, IgGl, ascites)과 CD43(161-46, ascites, IgGl)는 각각 V Horejsi와 R Villela로부터 제공받았다. Src, Akt, JAK-2, Syk 및 IkBci에 대한 phospho-specific 항체는 Cell Signaling l&hnologies사 제품을 사용하였다. 그밖에 MTT(3-[4, 5- dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphinyltetrazolium bromide)를 포함한 화학 시약은 Sigma 제품(St.
7 및 U937 세포들은 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 배지는 penicillin(100IU/m/) 및 streptomycin(100 瞄/m/)과 10% FBS가 포함된 RPMI 1640을 사용하였다.
7 세포와 인간 단핵구 세포주인 U937 세포를 사용하였다. 세포배양을 위한 배양용 배지 RPMI1640 media, fetal bovine serum(FBS) 그리고 항생 제 (penicillin/streptomycin) 는 Hyclone(Hyclone, South Logan, UT USA)사 제품을 사용하였다. Human Hbronectine BD Biosciences(San Jose, CA USA)를 사용했고, CD80 (MEM-233, purified IgGl), CD86(BU63, purified IgGl), CD29(MEM 101A, IgGl, ascites)과 CD43(161-46, ascites, IgGl)는 각각 V Horejsi와 R Villela로부터 제공받았다.
이 실험에서는 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포와 인간 단핵구 세포주인 U937 세포를 사용하였다. 세포배양을 위한 배양용 배지 RPMI1640 media, fetal bovine serum(FBS) 그리고 항생 제 (penicillin/streptomycin) 는 Hyclone(Hyclone, South Logan, UT USA)사 제품을 사용하였다.
데이터처리
각 data는 얻어진 결과는 평균土표준편차로 나타낸 것이며, 그룹 간의 통계적 유의성은 SAS package를 이용하여 P<0.05 수준에서 Duncan의 다중비교법에 의해 분석하였다.
이론/모형
4, 2 mM EDTA, 2 mM ethyleneglycotetraacetic acid, 50 mM P-glyc- erophosphate, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM dithio- threitol, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 10 a protinin, 10 ng/m! pepstatin, 1 mM benzimide, and 2 mM hydrogen peroxide)를 처리하여 total cell lysate를 조제하였다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동하고, wet-blotting transfer 방법을 이용하여 PVDF membrane으로 단백질을 transfer하였다. Membrane을 5% BSA blocking buffer에서 반응시킨 후 특정 단백질에 특이한 1차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다.
25 mM)를 처리하여 20분 배양하였다. 라디칼 소거 정도는 flow cytometer를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
게다가, 사람의 단핵구인 U937 세포에도 동일 조건에서 전혀 세포독성 효과를 유도하지 않았다(data not shown). 특별히 약常적으로 효능이 강한 플라보노이드 류에서 강한 세포독성이 나타난다는 것과 비교 시, ") 상대적으로 본 화합물이 우수하고 다양한 면역약리 작용을 보일 경우, 세포독성 측면에서 다른 플라보노이드류 보다 약물학적인 장점을 가질 것으로 판단된다. 따라서 면역약리학적 효능을 조사하기 위해, 활성화된 단핵구 및 대식세포를 이용하여 kaempferitirin의 조절능을 연구하여보았다.
특별히 관련 신호전달 단백질은 non-receptor type tyrosine kinases(Src, Syk 및 JAK2), phosphoinositide-3-kinase(PI3K), Akt(protein kinase B) 및 mitogen-activated protein kinases(MAPK) 등으로 구성되어 있다.5) 이들 단백질의 활성은 최종적으로 NF-kB 및 AP-1과 같은 transcription factor의 활성과 밀접한 관련이 있으며, 이들의 활성은 염증 및 내재성 면역반응 관련 단백질의 발현을 매개하게 된다.6, 7)
7에서 보여지듯이, kaempferitrine- SNP에 의해 유리되는 라디칼을 중화시키지 못하는 것으로 나타났다. 반면에 대조군으로 사용된 토코페롤은 강력하게 라디칼 생성을 억제하는 것으로 나타났다(data not shown).
그러나 본 화합물은 식세포작용, 라디칼 소거능은 매우 미약한 것点 나타났다. 세포- foronectin간 유착과정 및 CD80 발현에 대한 kinase 저해제 처리 효과 등의 결과를 고려해 볼 때, kaempferitrin의 면역약리 작용은 세포 표면 단백질의 활성억제 보다는 NF-kB, Src, Akt 및 Syk를 포함하는 신호전달 과정 억제를 통해 진행되는 것으로 사료된다. 향후 보다 자세한 신호전달 억제 기전에 관한 추가연구를 진행하고자 한다.
또한 200 |iM에서는 Akt 및 Syk kinase의 인산화 과정을 억제한 것으로 나타났다. 이는 LPS 신호전달 과정시 각 신호전달 단백질의 인산화 과정이 이들 단백질의 활성과 비례한다는 관점에서 볼 때 본 약물은 NF-kB 및 Src 활성을 강력하게 억제할 것으로 판단되며, 이외에도 Akt 및 Syk 등의 활성도 고농도에서는 억제하는 것2로 추측된다. 반면에, 25 및 50 μM 농도에서는 Akt 인산화과정을 증가시킨 것으로 볼 때, 저농도의 kaempferitrine 인산화 과정을 조절하는 세포 내 효소(예를 들면, phosphatase 등) 활성에 영향을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
5에서 볼 수 있듯이, kaempferitrin 은 농도 의존적으로 CD29 기능을 억제한 것으로 나타났다. 즉 kaempferitrine 100 및 200 에서 강력히 CD29 매개성 세포 간 유착현상을 억제하였다. 그러나, CD43 매개에 의한 세포 간 유착 현상은 억제하지 않았다(Fig.
24)따라서, kaempferitrin에 의한 세포간 유착과정 억제가 어떤 과정의 간섭에서 기인하는지 확인하기 위해 먼저 CD29 단백질 자체의 활성을 측정할 수 있는 세포-matrix protein(fibronectin)간의 유착실험 모델을 이용하여 연구하였다. 흥미롭게도, kaempferitrine U937 세포가 fibronectin에 유착되는 현상을 억제하지 못한 것으로 나타났다(Fig. 6). 즉 본 결과는 kaempferitrin의 세포간 유착현상 억제는 adhesion molecule인
따라서, 본 연구에서는 Kaempferitrin이 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 높게 발현되는 CD40, CD8。, 및 CD86의 세포막단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 FACS 실험을 통해 조사하였다. 흥미롭게도, 이들 증가된 CD40, CD80, 및 CD86 발현양은 kaempferitrin 처리시 감소하는 것을 확인할 수가 있었다(Fig. 3A). 게다가 kaempferitrin達 활성화된 대식세포에서 초기에 발현되는 CD69 의 상승정도도 억제하는 것冬 나타나 초기 대식세포 활성 자체를 억제할 가능성이 있는 것으로 판단되었다.
후속연구
즉, 이 경우 kaempferitrin 은 세포 내 보다는 세포막에 존재하는 단백질의 활성 조절을 통한 세포 내 신호전달 과정에 참여할 가능성이 더 클 것으로 사료된다. 이들 가능성은 추가적인 관련 연구를 통해 구체적点 확인 할 예정이다. 그럼에도 불구하고 현재까지의 결과로 볼 때, kaempfer- itrin에 의한 내재성면역 조절은 활성화된 면역세포들이 갖는 신호전달 현상조절을 통해 매개되는 것으로 판단된다.
세포- foronectin간 유착과정 및 CD80 발현에 대한 kinase 저해제 처리 효과 등의 결과를 고려해 볼 때, kaempferitrin의 면역약리 작용은 세포 표면 단백질의 활성억제 보다는 NF-kB, Src, Akt 및 Syk를 포함하는 신호전달 과정 억제를 통해 진행되는 것으로 사료된다. 향후 보다 자세한 신호전달 억제 기전에 관한 추가연구를 진행하고자 한다.
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