인체의 바이러스 감염 방어기전에서 T 림프구는 중요한 역할을 한다. 하지만, 만성 C형 간염 바이러스의 일차적 복제장소인 간염 환자의 간에서 분리된 HCV 특이 T 림프구는 심각한 기능결핍을 보인다. 이러한 T 림프구 기능결핍의 이유로는 PD-1, CTLA-4 등 면역억제 물질의 발현, 또는 간에서 특이적으로 유도되는 면역내성(immune tolerance)이 있으나, 간세포(hepatocytes)와 HCV 특이 T 림프구의 상호작용에 대해서는 명확하게 확립되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 HLA(human leukocyte antigen) A2+ 간암세포주(human hepatoma cell line; huh7.5)가 항원제시(antigen presentation)를 통해 효과적으로 HCV 특이 T 림프구를 활성화시키며 간암세포주(huh7.5) 표면의 PD-L (program death ligand) 1 발현은 T림프구의 활성을 감소시켜 면역조절의 가능성이 있음을 시사하였다. 또한, HCV 특이 tetramer 반응은 T 림프구의 과도한 활성으로 자기사멸(apoptosis)의 경로에 있음을 caspase 3 활성으로 확인하였고, 역시 PD-L1의 발현이 T 림프구를 자기사멸(apoptosis)로부터 구제하여 caspase 3 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 PD-L1과 간성(liver) T 림프구 표면의 PD-1 결합이 T 림프구의 자기사멸을 막고, 또한 그 기능을 회복시켜 만성 C형 간염 치료에 응용될 수 있음을 시사한다.
인체의 바이러스 감염 방어기전에서 T 림프구는 중요한 역할을 한다. 하지만, 만성 C형 간염 바이러스의 일차적 복제장소인 간염 환자의 간에서 분리된 HCV 특이 T 림프구는 심각한 기능결핍을 보인다. 이러한 T 림프구 기능결핍의 이유로는 PD-1, CTLA-4 등 면역억제 물질의 발현, 또는 간에서 특이적으로 유도되는 면역내성(immune tolerance)이 있으나, 간세포(hepatocytes)와 HCV 특이 T 림프구의 상호작용에 대해서는 명확하게 확립되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 HLA(human leukocyte antigen) A2+ 간암세포주(human hepatoma cell line; huh7.5)가 항원제시(antigen presentation)를 통해 효과적으로 HCV 특이 T 림프구를 활성화시키며 간암세포주(huh7.5) 표면의 PD-L (program death ligand) 1 발현은 T림프구의 활성을 감소시켜 면역조절의 가능성이 있음을 시사하였다. 또한, HCV 특이 tetramer 반응은 T 림프구의 과도한 활성으로 자기사멸(apoptosis)의 경로에 있음을 caspase 3 활성으로 확인하였고, 역시 PD-L1의 발현이 T 림프구를 자기사멸(apoptosis)로부터 구제하여 caspase 3 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 PD-L1과 간성(liver) T 림프구 표면의 PD-1 결합이 T 림프구의 자기사멸을 막고, 또한 그 기능을 회복시켜 만성 C형 간염 치료에 응용될 수 있음을 시사한다.
T cells play a key role in viral infection. However, in patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection, HCV-specific T cells are dysfunctional and impaired in the liver, which is the primary site for HCV replication. There are multiple potential mechanisms for HCV-specific T cell dysfunctio...
T cells play a key role in viral infection. However, in patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection, HCV-specific T cells are dysfunctional and impaired in the liver, which is the primary site for HCV replication. There are multiple potential mechanisms for HCV-specific T cell dysfunction including induction of immune inhibitory pathways (program death-1; PD-1, cytotoxic t lymphocyte associated antigen-4; CTLA-4) and immune tolerance induced specific for the liver. However, the interaction between hepatocytes and HCV-specific CD8 T cells has not clearly established. In this study, we confirmed huh (human hepatoma) 7.5 cells expressing HLA (human leukocyte antigen) A2 presented antigen to activate HCV-specific CD8 T cells in HLA A2-restricted manner and expression of PD-L (program death ligand) 1 on huh7.5 cells reduced HCV-specific CD8 T cell activation, suggesting an immune modulatory activity. Loss of HCV-specific tetramer responses following antigenic stimulation correlated with increased caspase-3 activity. In addition, PD-L1 on huh7.5 cells rescued HCV-specific CD8 T cells from apoptosis. Our results suggest that the interaction between PD-L1 and PD-1 can recover the function of HCV-specific CD8 T cells in the liver, which could be applied in therapy of HCV chronic infection.
T cells play a key role in viral infection. However, in patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection, HCV-specific T cells are dysfunctional and impaired in the liver, which is the primary site for HCV replication. There are multiple potential mechanisms for HCV-specific T cell dysfunction including induction of immune inhibitory pathways (program death-1; PD-1, cytotoxic t lymphocyte associated antigen-4; CTLA-4) and immune tolerance induced specific for the liver. However, the interaction between hepatocytes and HCV-specific CD8 T cells has not clearly established. In this study, we confirmed huh (human hepatoma) 7.5 cells expressing HLA (human leukocyte antigen) A2 presented antigen to activate HCV-specific CD8 T cells in HLA A2-restricted manner and expression of PD-L (program death ligand) 1 on huh7.5 cells reduced HCV-specific CD8 T cell activation, suggesting an immune modulatory activity. Loss of HCV-specific tetramer responses following antigenic stimulation correlated with increased caspase-3 activity. In addition, PD-L1 on huh7.5 cells rescued HCV-specific CD8 T cells from apoptosis. Our results suggest that the interaction between PD-L1 and PD-1 can recover the function of HCV-specific CD8 T cells in the liver, which could be applied in therapy of HCV chronic infection.
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문제 정의
5 cells)와 HCV 특이 T 림프구와의 상호작용에 대한 연구가 가능하게 되었다(2). 따라서 본 연구에서는 간암세포주가 HCV항원을 표면에 발현, 항원제시세포로의 가능성을 확인함과 동시에 HCV 특이 T 림프구를 활성화 할 수 있는지, 그리고 간암세포주의 표면에 PD-L1을 발현시 HCV 특이 T 림프구의 활성화에 어떠한 영향이 있는지 살펴보고자 한다.
5 line은 IFN발현과 밀접하게 관련있는 RIG-I 부위에 결함(point mutation)을 유도하여 세포배양액에 훨씬 높은 HCV 복제율을 유지할 수 있게 되었다(2, 11). 따라서 본 연구에서는 만성 C형 간염의 표적세포인 간세포의 항원제시(antigen presentation) 가능성을 인체 간암세포주(huh7.5 cells)와 C형 간염 회복환자에서 분리된 HCV특이 T 림프구를 이용하여 살펴보았다. 첫번째로, HCV NS3 1406 peptide를 간암세포주(huh7.
본 연구에서는 HCV 특이성 T 림프구의 활성을 측정할 수 있는 또 다른 방법인 HCV 특이성 tetramer 반응을 살펴보았다. Tetramer 반응이란 특정 항원 펩타이드를 4개의 분자 (tetramer)로 구성하여 형광물질을 부착한 후 T 림프구와 반응시켜 특정항원을 인식하여 결합하는 특이 T 림프구을 유세포 분광기로 정량적으로 측정하는 것이다.
가설 설정
The expression of IFN-γ and TNF-α are measured by intracellular cytokine staining using flow cytometry. (B) HLA A2+ huh7.5 cells with or without PD-L1 expression are pulsed with HCV NS3 1406 peptide. Peripheral lymphocytes from HLA A2+ subjects are added and the expression of IFN-γ and TNF-α are measured in the same way.
제안 방법
6시간 후, T림프구에서 생성, brefeldin A에 의해 세포내 축척된 IFN-γ와 TNF-α를 유세포 분광기(flow cytometry)를 이용한 intracellular cytokine staining 으로 측정 분석했다.
HCV peptide를 받아들인 항원제시세포(antigen presenting cells), 즉 간암세포주(huh7.5)가 HCV에 특이적으로 반응하는 T 림프구를 활성화 시켜 IFN-γ와 TNF-α를 생성할 수 있는지 살펴보기 위해 간암세포주(huh7.5 cells)에 HCV NS3 1406 peptide를 가하여 24시간 동안 배양 후 PBS로 펩타이드의 잔유물을 완전히 제거, C형 간염 회복 환자 혈액에서 분리된 HCV 특이 T 림프구, 그리고 brefeldin A을 넣어 6시간 동안 혼합배양 후 세포 내 축척되는 IFN-γ와 TNF-α를 측정하였다.
HLA A2 -/+ 간암세포주(huh7.5)의 PD-L1발현 여부를 유세포분광기(flow cytometry)로 확인후 HCV NS3 1406 peptide과 함께 배양하였다. 24시간 후, 세포주를 PBS (phosphate buffered saline)로 세 번이상 세척하여 peptide의 잔유물을 완전히 제거한 다음 HLA A2+ C형 간염 회복 환자로부터 분리한 T림프구와 세포내 단백질 분비과정을 억제하는brefeldin A을 넣어 혼합배양하였다(13, 14).
5) are infected with lentiviral vector expressing HLA A2 or PD-L1 (program death ligand 1). The expression of HLA A2+ (A, middle, blue) or PD-L1 (B, right, blue) on huh7.5 cells are measured by Flow cytometry among three different cell lines (huh7.5, HLA A2+ huh7.5, HLA A2+ PD-L1 huh7.5) made in this experiments.
5)에 의한 재차 항원제시를 받음으로써 과도한 활성에 의해 자기살해(apoptosis)의 과정을 겪고 있을 수도 있다고 예상하였다. 따라서 T 림프구의 자기살해(apoptosis) 경로 중 중요한 인자로 작용하는 caspase 3의 활성 정도를 함께 측정하였다. 그림 3C에서 보는 바와 같이 HCV tetramer반응이 감소함과 동시에 caspase 3의 활성이 증가됨을 알 수 있다.
5 cells)는 일반적으로 HLA A11형으로 알려져 있다. 따라서, HLA A2형 환자로부터의 분리된 HCV 특이 T 림프구에 대한 반응이 미미할 것으로 판단하여 본 연구에서는 lentiviral 벡터를 이용하여 간암세포주에 HLA A2의 발현을 유도하였다. 그림1A은 HLA A2발현을 유도하는 lentivirus의 도입후 간암세포주의 HLA A2 발현이 월등히 증가하였음을 보여준다.
분석하고자 하는 간암세포주(huh7.5)와 환자의 혈액에서 분리된 T 림프구를 각각의 형광항체로 염색하여 형광세기의 정도를 FACS Canto (Becton Dickinson, USA)로 측정하고 FlowJo (Tree Star Inc, USA)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 모든 형광항체(monoclonal antibodies; FITC anti-HLA A2, PE-cy7 anti-PD-L1, APC anti-NS31406 tetramer)는 BD Bioscience (USA)로부터, Capsase-3 Detection Kit은 QIAGEN (USA)으로부터 구입하였다.
15%) 모두 크게 감소됨을 볼 수 있다. 일반적으로 brefeldin A의 처리시간은 1-6시간으로 다양하나 본 실험에서는 6시간 처리하였으며 brefeldin A의 세포독성에 대한 영향은 없음을 실험군과 대조군의 비교로 확인하였다.
첫번째로, HCV NS3 1406 peptide를 간암세포주(huh7.5)에 항원으로 가하고 일정한 시간이 지난 뒤 간암세포주(huh7.5)의 항원제시로 HCV 특이 T 림프구가 활성화 되는 것을 IFN-γ와 TNF-α의 생성으로 확인하였다.
대상 데이터
Huh7.5 hepatoma cell line 인체 간암 세포주는 Charles M. Rice 박사(The Rockefeller University)로부터 제공 받아 10% fetal bovine serum을 함유한 DMEM을 사용하여 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다(11). HLA A2와 PD-L1을 발현하는 lentiviral 벡터는 James Riley 박사(The University of Pennsylvania)로부터 제공 받았다(18).
5)와 환자의 혈액에서 분리된 T 림프구를 각각의 형광항체로 염색하여 형광세기의 정도를 FACS Canto (Becton Dickinson, USA)로 측정하고 FlowJo (Tree Star Inc, USA)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 모든 형광항체(monoclonal antibodies; FITC anti-HLA A2, PE-cy7 anti-PD-L1, APC anti-NS31406 tetramer)는 BD Bioscience (USA)로부터, Capsase-3 Detection Kit은 QIAGEN (USA)으로부터 구입하였다.
필라델피아 보훈병원(Philadelphia Veterans Affairs Medical Center)과 펜실베니아 대학병원(Hospital of the University of Pennsylvania)에서 과거 HCV감염이 있었으나 자연적으로 회복한 환자(HCV-seropositive but RNA-negative patients)들이 모집되었다. 이들 중 HLA A2 양성으로 혈액 중 HCV NS3 항원결정기(epitope)에 반응하는 HCV 특이 CD8 T 림프구의 양이 많은 대상이 선별되었으며, 환자로부터의 샘플 채취는 필라델피아 보훈병원 IRB (institutional review boards)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 이루어졌다.
성능/효과
이러한 T 림프구 기능결핍의 이유로는 PD-1, CTLA-4 등 면역억제 물질의 발현, 또는 간에서 특이적으로 유도되는 면역내성(immune tolerance)이 있으나, 간세포 (hepatocytes)와 HCV 특이 T 림프구의 상호작용에 대해서는 명확하게 확립되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 HLA (human leukocyte antigen) A2+ 간암세포주(human hepatoma cell line; huh7.5)가 항원제시(antigen presentation)를 통해 효과적으로 HCV 특이 T 림프구를 활성화시키며 간암세포주 (huh7.5) 표면의 PD-L (program death ligand) 1 발현은 T림프구의 활성을 감소시켜 면역조절의 가능성이 있음을 시사하였다. 또한, HCV 특이 tetramer 반응은 T 림프구의 과도한 활성으로 자기사멸(apoptosis)의 경로에 있음을 caspase 3 활성으로 확인하였고, 역시 PD-L1의 발현이 T 림프구를 자기사멸 (apoptosis)로부터 구제하여 caspase 3 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
마찬가지로 PD-L1도 lentiviral 벡터를 이용하여 간암세포주 표면에 발현시켰다(그림 1B). 또한 HLA A2 와 PD-L1의 지속적인 높은 발현 정도는 각각의 발현에 영향없이 반영구적인 상태임을 확인하였다.
5) 표면의 PD-L (program death ligand) 1 발현은 T림프구의 활성을 감소시켜 면역조절의 가능성이 있음을 시사하였다. 또한, HCV 특이 tetramer 반응은 T 림프구의 과도한 활성으로 자기사멸(apoptosis)의 경로에 있음을 caspase 3 활성으로 확인하였고, 역시 PD-L1의 발현이 T 림프구를 자기사멸 (apoptosis)로부터 구제하여 caspase 3 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 PD-L1과 간성(liver) T 림프구 표면의 PD-1결합이 T 림프구의 자기사멸을 막고, 또한 그 기능을 회복시켜 만성 C형 간염 치료에 응용될 수 있음을 시사한다.
5)과 혼합 배양한 T 림프구의 경우 반복된 항원제시로 인하여 T 림프구 활성고갈 상태가 되어 HCV 특이 tetramer 반응이 감소하였다. 또한, tetramer 반응의 감소와 T 림프구 자기사멸(apoptosis)의 표지인 caspase-3활성이 밀접한 상관관계가 있음을 밝혔다. 이러한 결과는 최근 몇몇 연구에서 제시된 간세포가 CD8 T 림프구의 사멸을 매개할 수 있다는 보고와 일치한다(1, 8, 20).
본 연구에서도 간암세포주 표면에 PD-L1을 발현시켜 T 림프구와 반응시킨 경우 T 림프구에서 생성되는 IFN-γ와 TNF-α가 현저히 줄어듬을 관찰하였다.
이러한 CD8 T 림프구의 사멸을 IL-2나 다른 기관의 면역세포와의 혼합배양으로 막을 수 있는 것으로 볼 때 간세포가 직접적으로 CD8 T 림프구를 사멸시키기 보다는 어떤 환경적인 인자들이 관련되어 있음을 시사한다. 흥미롭게도 본 연구에서는 이러한 T 림프구의 사멸이 간암세포 주의 표면에 PD-L1을 유도함으로써 구제될 수 있음을 확인하였다. 만성 C형 간염시 간에서 관찰되는 HCV특이 T 림프구는 높은 PD-1의 발현과 더불어 나타나는 기능고갈로 대부분 간세포를 침입한 HCV를 방어하지 못한 채 대량의 자기사멸과정을 겪게 된다.
후속연구
하지만 PD-L1을 임상면역요법으로 도입하여 T 림프구의 기능을 회복하고 또한 자기사멸을 억제할 수있다면 만성 C형 간염 회복에 획기적인 계기를 마련할 수 있을 것이다. 다음단계의 연구는 HCV 복제시스템이 구축된 간암세포주(huh7.5)를 이용하여 실질적인 바이러스의 감염에 의한 T 림프구의 활성여부를 확인하는 것이 될 것이다.
만성 C형 간염시 간에서 관찰되는 HCV특이 T 림프구는 높은 PD-1의 발현과 더불어 나타나는 기능고갈로 대부분 간세포를 침입한 HCV를 방어하지 못한 채 대량의 자기사멸과정을 겪게 된다. 하지만 PD-L1을 임상면역요법으로 도입하여 T 림프구의 기능을 회복하고 또한 자기사멸을 억제할 수있다면 만성 C형 간염 회복에 획기적인 계기를 마련할 수 있을 것이다. 다음단계의 연구는 HCV 복제시스템이 구축된 간암세포주(huh7.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
HCV의 표적세포인 간세포에 대한 연구는 어떤 어려움을 겪어왔는가?
HCV의 표적세포인 간세포에 대한 연구는 오랜 기간 동안 많은 문제점으로 인해 어려움을 겪어왔다. 첫째, 인체 내 간세포를 직접 분리하여 실험적으로 배양하는 것이 거의 불가능하며, 둘째, RNA형 바이러스인 HCV에 대한 복제 시스템(replication system)을 확립하지 못했기 때문이었다(10). 하지만 최근 간세포에서 분화된 간암세포주(human hepatoma cells; huh cell line)를 간세포 모델로 도입하여 HCV 복제시스템을 실험적으로 구축함으로써 간암 세포주(human hepatoma 7.
C형 간염 바이러스는 인체 감염 시 어떻게 간염이나 간경화, 간암 등을 일으키는가?
C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV)는 지놈길이 9.6 kb의 RNA바이러스로 인체에 감염시 간세포 표면에 발현 되는 CD81, SR-B1, claudin-1, occludin 등의 수용체를 통해 만성 간염 및 간경화와 간암을 일으키는 것으로 알려져 있다 (12). 항 HCV치료제로는 인테페론(interferon)-α, 리바비린 (ribavirin) 등이 알려져 있으나 바이러스의 strain마다 치료효과가 다양하며 항 HCV백신은 아직 개발되지 않았다(15).
T 림프구는 어디에 중요한 역할을 하는가?
T 림프구는 바이러스에 감염된 세포 사멸이나 항바이러스 항체를 생성하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나 C형 간염이만성적으로 진행된 환자의 혈액에는 HCV특이적 T 림프구가 거의 존재하지 않으며 있다 하더라도 그 기능이 결핍되어 있는 것으로 알려져 있다.
참고문헌 (20)
Bertolino, P., G.W. McCaughan, and D.G. Bowen. 2002. Role of primary intrahepatic T-cell activation in the 'liver tolerance effect'. Immunol. Cell. Biol. 80, 84-92.
Binder, M., G. Kochs, R. Bartenschlager, and V. Lohmann. 2007. Hepatitis C virus escape from the interferon regulatory factor 3 pathway by a passive and active evasion strategy. Hepatology 46, 1365-1374.
Chayama, K., C.N. Hayes, N. Hiraga, H. Abe, M. Tsuge, and M. Imamura. 2011. Animal model for study of human hepatitis viruses. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 13-18.
Freeman, G.J., A.J. Long, and Y. Iwai. 2000. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med. 192, 1027-1034.
Freeman, G.J., E.J. Wherry, R. Ahmed, and A.H. Sharpe. 2006. Reinvigorating exhausted HIV-specific T cells via PD-1-PD-1 ligand blockade. J. Exp. Med. 203, 2223-2227.
Golden-Mason, L., B. Palmer, J. Klarquist, J.A. Mengshol, and N. Castelblanco. 2007. Upregulation of PD-1 expression on circulating and intrahepatic hepatitis C virus-specific CD8+ T cells associated with reversible immune dysfunction. J. Virol. 81, 9249-9258.
Holz, L.E., A. Warren, D.G. Le Couteur, D.G. Bowen, and P. Bertolino. 2010. CD8+ T cell tolerance following antigen recognition on hepatocytes. J. Autoimmun. 34, 15-22.
Jo, J., U. Aichele, N. Kersting, R. Klein, P. Aichele, E. Bisse, A.K. Sewell, H.E. Blum, R. Bartenschlager, V. Lohmann, and R. Thimme. 2009. Analysis of CD8+ T-cell-mediated inhibition of hepatitis C virus replication using a novel immunological model. Gastroenterology 136, 1391-1401.
Jo, J., V. Lohmann, R. Bartenschlager, and R. Thimme. 2011. Experimental models to study the immunobiology of hepatitis C virus. J. Gen. Virol. 92, 477-493.
Keril, J.B., A.J. McKeating, and M.C. Rice, 2002. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014.
Lauer, G.M. and B.D. Walker. 2001. Hepatitis C virus infection. New Engl. J. Med. 345, 41-52.
Nakamoto, N., D.E. Kaplan, J. Coleclough, Y. Li, M.E. Valiga, and K.M. Chang. 2008. Functional restoration of HCV-specific CD8 T cells by PD-1 blockade is defined by PD-1 expression and compartmentalization. Gastroenterology 134, 1927-1937.
Nakamoto, N., H. Cho, A. Shaked, K. Olthoff, M.E. Valiga, M. Kaminski, E. Gostick, D.A. Price, G.J. Freeman, E.J. Wherry, and K.M. Chang. 2009. Synergistic reversal of intrahepatic HCV-specific CD8 T cell exhaustion by combined PD-1/CTLA-4 blockade. PLoS Pathog. 5, e1000313.
Pagliaro, L., A. Craxi, C. Cammaa, F. Tine, V. di Marco, L. Iacono, and P. Almasio. 1994. Interferon-alpha for chronic hepatitis C: an analysis of pretreatment clinical predictors of response. Hepatology 19, 820-828.
Salomon, B. and J.A. Bluestone. 2001. Complexities of CD28/B7: CTLA-4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation. Annu. Rev. Immunol. 19, 225-252.
Uebelhoer, L., J.H. Han, B. Callendret, G. Mateu, N.H. Shoukry, H.L. Hanson, C.M. Rice, C.M. Walker, and A. Grakoui. 2008. Stable cytotoxic T cell escape mutation in hepatitis C virus is linked to maintenance of viral fitness. PLoS Pathog. 4, e1000143.
Varela-Rohena, A., C. Carpenito, E.E. Perez, M. Richardson, R.V. Parry, M. Milone, J. Scholler, X. Hao, A. Mexas, R.G. Carroll, C.H. June, and J.L. Riley. 2008. Genetic engineering of T cells for adoptive immunotherapy. Immunol. Res. 42, 166-181.
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