선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 HCT-8 세포를 감염시킨 오시스트의 여러 중식 단계 (sporozoites, merozoites, meronts etc)를 형광 항체염색법으로 검출하는 CC-IFA(Cell Culture-Immunofluorescence assay)*에 최적확수기법 (Most-Probable Number techmique)을 결합하여 감염성 오시스트를 정량 계수하고자 하였다. 아울러 이러한 감염성 정량방법을 적용해 염소, 오존, UV 등 다양한 소독제에 의한 크립토스포리디움 감염성 감소율을 측정함으로써 소독효율을 비교하고 특히 UV 조사의 경우에는 저압 UV램프와 중압램프의 소독효율을 비교 평가하였다.
제안 방법
- PBS로 4회 반복 세정한 후 커버슬립을 덮고 밀봉하였다. 400배율 이상의 형광DIC현미경으로 슬라이드의 각 웰을 관찰하여 형광점 (foci)의 무리(cluster)에 초록형광점이 적어도 3개 이상 있으면 양성으로 판정하였다(Fig. 1).
- 8개의 웰챔버(well chamber)를 가진 웰챔버슬라이드에 HCT- 8(Human illocecal adenocarcinoma cell, ATCC CCL-224; American Type Culture Collection) monolayer를 형성시켰다 (배양온도 37℃, 습도 100%, 5% CO2). 세포 유지배지로는 5% Fetal Bovine Serum, 10% Opti-MEM, 1% 200 mM L-Glutamine, 2% IM HEPES를 첨가한 RPMI-1640을 사용하였으며, 오시스트 감염시에는 Fetal Bovine Serum의 농도를 10%로 증가시킨 성장배지를 사용하였다.
- 84 mg/L로 접촉시간에 따라 염소감소량이 다소 달랐다. CT값 계산시 소독중 염소농도 감소를 고려치 않고 최 종잔류염 소를 기준으로 계 산하였다.
- 필요하다. HCT-8 세포를 감염시킨 크립토스포리디움 파븀이 탈낭 후보이는 다양한 증식단계(sporozoites, trophozoites, type I/Ⅱ, meronts, merozoites, macrogametocyte, microgametocyte) FITC로 표지된 anti-sporozoite and merozoite antibody와 결합하여 형광DIC현미경 하에서 2~5 pm 크기의 크고 작은 초록색 형광점의 무리(cluster, 이하 클러스터)로 관찰할 수 있는데 한 개의 클러스터에 3개 이상의 형광점이 발견되면 DICE〕의한 확인을 거쳐 양성으로 판정하였다(Fig. 1~2).
- 사용하였다. UV는 광원으로부터 collimated beam tube를 통해 시료에 수직으로 조사되도록 조절되었으며 시료부의 광도는 표준 광도계로 측정하였다. UV조사 직전, 일정량의 오시스트를 여과지 유출수(0.
- UV소독실험시 감염성평가와 비교하기위해 활성측정 방법인 탈낭실험을 추가로 실시하였다. 저압 UV램프를 사용하여 실험하였으며 조사량은 감염성평가를 위한 실험과 동일한 조건에서 실시하였다.
- UV소독장치는 중압(1 kW) 및 저압(10 W) UV lamp를 교체 장착할 수 있는 RAYOX Advanced Ozidation System (CALGON社)을 사용하였다. UV는 광원으로부터 collimated beam tube를 통해 시료에 수직으로 조사되도록 조절되었으며 시료부의 광도는 표준 광도계로 측정하였다.
- UV는 광원으로부터 collimated beam tube를 통해 시료에 수직으로 조사되도록 조절되었으며 시료부의 광도는 표준 광도계로 측정하였다. UV조사 직전, 일정량의 오시스트를 여과지 유출수(0.1 NTU, pH 7.2, 4℃)에 부유시켜 혼합시킨 후 교반자석이 들어있는 페트리접시에 10 mL씩 분주하고 교반시키면서 UV에 의한 불활성화 실험을 수행하였다. 소독시험시 크립토스포리디움 오시스트 농도는 1.
- 5 mL 미세 원심 분리 관으로 옮긴후 12,000 rpm에서 4분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하였다. pH 2.75인 acified Hank's bal- anced salt solution를 1 mL 넣고 혼합하여 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다, Hank's balanced salt sohition으로 3번 씻어낸 후 1% 담즙 200 μL과 0.44% 탄산수소나트륨 50 μL 을 넣고 37Q에서 4시간 동안 배양한뒤 탈낭되지 않은 오시스트 수(IO), 부분탈낭된 오시스트 수(PO), 속빈 오시스트수(EO)를 계수하였다. 탈낭율은 식 (2)와 같이 나타낼 수 있다.
- 세포성장배지를 넣어 1 mL 만든 후 세포성장배지를 사용해 1/5 희석을 단계적으로 여섯번 반복하여 6개의 튜브를 준비하였다. 각 희석단계별로 준비된 6개의 시료마다 8개의 웰 챔버에 나누어 감염시키고 37℃, 습도 100%, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양후 슬라이드를 배양기에서 꺼내 배지를 제거하고 PBS로세척한 후 100% 메탄올을 첨가해 10분간 고정시킨 다음 챔버를 제거하였다.
- 또한 8개의 웰 중 50%를 감염시키는데 필요한 오시스트량(IDs。)도 구하였는데 logistic regression에 입각한 식 (4)에의해 각 주입농도별 response logits을 구해 양반응곡선(doseresponse curve)를 그린 후 response logit = 0이 되는 주입농도(dose)를 ID50으로 하였다. ID50은 마우스감염 등 감염시험에서 감염력을 나타내는데 널리 사용되며 소독시험에서 감염력을 비교하는데도 적절히 사용될 수 있다.
- ). 세포 유지배지로는 5% Fetal Bovine Serum, 10% Opti-MEM, 1% 200 mM L-Glutamine, 2% IM HEPES를 첨가한 RPMI-1640을 사용하였으며, 오시스트 감염시에는 Fetal Bovine Serum의 농도를 10%로 증가시킨 성장배지를 사용하였다.
- 2, 4℃)에 부유시켜 혼합시킨 후 교반자석이 들어있는 페트리접시에 10 mL씩 분주하고 교반시키면서 UV에 의한 불활성화 실험을 수행하였다. 소독시험시 크립토스포리디움 오시스트 농도는 1.5x106 오시스트/mL이었으며, 조사량은 일정한 광량에 조사시간을 변화시킴 으로써 결정 하였는데 조사시간은 UV shutter를 열고 닫아 조절하였다. UV조사량은 식 (1) 과 같이 계산될 수 있다.
- 아울러 이러한 감염성 정량방법을 적용해 염소, 오존, UV 등 다양한 소독제에 의한 크립토스포리디움 감염성 감소율을 측정함으로써 소독효율을 비교하고 특히 UV 조사의 경우에는 저압 UV램프와 중압램프의 소독효율을 비교 평가하였다.
- 2 mg/L의 염소수를 조제하였다. 유리실린지에 염소수를 담고 약 IO*1 개의 오시스트가 함유된 오시스트 현탁액 10 hL를 주입한후 잔류염소를 측정하여 염소초기농도로 하였다. 실린지 유출구를 클램프로 조여 밀봉한 후 5℃에서 교반하면서 일정시간동안 염소와 접촉시킨 다음 잔류염소를 측정하여 최종 농도로 하고 나머지를 모두취해 3% 티오황산 나트륨 용액을 첨가하여 염소를 중화시켰다.
- 탈낭실험을 추가로 실시하였다. 저압 UV램프를 사용하여 실험하였으며 조사량은 감염성평가를 위한 실험과 동일한 조건에서 실시하였다. UV를 조사한 후 페트리접시에 있는 시료를 15 mL 원심분리관으로 옮기고 1, 050 xg에서 15 분 동안 원심분리한 다음 상등액을 제거하였다.
- 차아염소산나트륨용액(유효염소 약 13%)을 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 희석한 후 1일 이상 교반시켜 chlorine-liee water를 만들어 약 1.2 mg/L의 염소수를 조제하였다. 유리실린지에 염소수를 담고 약 IO*1 개의 오시스트가 함유된 오시스트 현탁액 10 hL를 주입한후 잔류염소를 측정하여 염소초기농도로 하였다.
- 프로그램에 희석단계수, 반복접종횟수, 적용된 시료량 등을 입력하여 MPN값을 도출하고 이로부터 퍼센트 감염력 (Percent Inffectivity)을 구하였으며 그 식 (3)은 다음과 같다.
대상 데이터
- 사용하였다. 구입한 오시스트는 미리 탈낭법(in vitro excystation)에 의해 활성을 측정하였고 매 감염시험마다 약 106개의 오시스트를 취해 hemacytometer로 농도를 결정한 후 세포 감염에 사용하였다.
- 오시스트는 살아있는 Cryptosporidium parvum 오시스트 (source : calf infected by Iowa strain, sterling parasitology Lab)를 구입하여 냉장 보관하였고 65일령 이내의 오시스트를 실험에 사용하였다. 구입한 오시스트는 미리 탈낭법(in vitro excystation)에 의해 활성을 측정하였고 매 감염시험마다 약 106개의 오시스트를 취해 hemacytometer로 농도를 결정한 후 세포 감염에 사용하였다.
이론/모형
- 감염성 오시스트의 MPN값은 미국 ICR(Information Collection Rule)용 MPN calculator program을 사용하여 결정하였다. 프로그램에 희석단계수, 반복접종횟수, 적용된 시료량 등을 입력하여 MPN값을 도출하고 이로부터 퍼센트 감염력 (Percent Inffectivity)을 구하였으며 그 식 (3)은 다음과 같다.
- 되도록 준비하였다. 실험은 5℃에서 수행되었으며, 오존 측정에는 Indigo Colorimetric Method(Standard Method 4500-03 B.)을 사용하였다.
성능/효과
- 클러스터로 관찰되었으나(Fig. 5(a)), 3~60 mJ/cm2 조사시에는 meront 이상의 증식단계를 포함한 클러스터는전혀 관찰되지 않고 세포 침입 초기 단계인 trophozoite만이 발견되었다(Fig. 5(b)).
- 2) 이러한 측정방법을 실험실차원의 염소 및 오존실험에 적용한 결과, 수온 5℃, pH 7.0 조건에서 PBS 중 감염성오시스트 1 log 불활성화에 필요한 CT값은 염소의 경우 1, 250 mg . min/L, 오존의 경우 16 mg .
- 3) UW조사실험의 경우 UV가 크립토스포리디움의 활성에는 거의 영향을 주지 못했지만 세포배양 결과 살아있는 크립토스포리디움이 세포 내 침투후 증식단계를 갖지 못하고 trophozite까지만 진행되어 감염성이 현저히 감소되는 것이 발견되었다. 저압 및 중압 UV 모두 2 mJ/cn?의 조사량에서 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되어 크립토스포리디움 제거에 낮은 조사량에도 매우 효과적인 것으로 나타났으며, UV램프간의 불활성화율 차이는 볼 수 없었다.
- )을 측정한 결과는 Table 1과 같다. In vitro excystation에서 모두 95% 이상의 탈낭율을 보인 오시스트이었지만, 세포감염시 퍼센트감염력은 0.7~6.3%로 결과되었고 50% 세포 감염에 필요한 주입량(IDso)은 13~33이었는데, 세포감염법을 적용한 Slifko 등9)의 5~50과 유사하고 마우스감염에서의 ID50 15~377 보다는 다소 작았다. 이러한 결과는 세포배양법과 마우스감염법간에 강한 상관성이 있으므로 세포배양법이 마우스감염법을 대체하는 효과적인 감염성 측정법이라 할 수 있다.
- 1 log 불활성화되었다는 결과와 유사하였다. UV 조사가 4℃ 조건에서 수행되었다는 점을 고려할 때 기존의 염소 및 오존소독과는 달리 저온에서도 UV에 민감하게 반응한다는 것을 보여주었다.
- 이러한 결과에 기초할 때, 일정수준이상의 UV 조사는 오시스트의 감염성은 감소시키지만 활성이나 세포침입능력에는 거의 영향을 주지 않음을 알 수 있다. 따라서 세포배양 후 감염성여부를 분자생물학적 방법으로 검출할 경우 오양성의 가능성이 존재하여 불활성화율이과소평가될 수 있다고 판단된다. 실제로 Keegan 등")의 연구 결과를 보면 세포배양 후 real-time PCR을 통해 감염량을 정량하였는데 20 mJ/cn?에서 약 2 log 정도 제거되었다고 보고하고 있다.
- 1 log 불활성화율을 보였다. 또한 3 mJ/cm2 이상 조사될 경우 형광점(foci)의 무리(cluster)가 전혀 발견되지 않아 약 4 log 이상 불활성화됨을 확인할 수 있었다. 이는 동물감염법을 사용한 Clancy 등")이 2 mJ/cm2 조사시 3.
- 시험 결과, 소독중 오존농도 감소에 대해 고려하지 않고 잔류 오존 농도에 기초하여 CT값을 계산할 경우, CT값 상승에 따라 크립토스포리디움의 ID50은 증가하고 퍼센트 감염력은 감소하였다.
- 시험 결과, 접촉시간 증가 즉 CT값 상승에 따라 크립토스포리디움의 ID50은 증가하고 퍼센트 감염력은 감소하였다. 그러나 176~520 mg .
- 저압 및 중압 UV 모두 2 mJ/cn?의 조사량에서 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되어 크립토스포리디움 제거에 낮은 조사량에도 매우 효과적인 것으로 나타났으며, UV램프간의 불활성화율 차이는 볼 수 없었다.
- 5(b)). 이러한 결과에 기초할 때, 일정수준이상의 UV 조사는 오시스트의 감염성은 감소시키지만 활성이나 세포침입능력에는 거의 영향을 주지 않음을 알 수 있다. 따라서 세포배양 후 감염성여부를 분자생물학적 방법으로 검출할 경우 오양성의 가능성이 존재하여 불활성화율이과소평가될 수 있다고 판단된다.
- 잔류염소농도를 기준으로 계산할 때 수온 5℃, pH 7.0에서 크립토스포리디움 1 log 불활성화에는 1, 250 mg - min/L 가 필요한 것으로 나타났다. 志村有通 등은 마우스감염법을 사용한 연구에서 잔류염소 0.
- 제거율을 얻었다. 즉 사용된 UV램프에 상관없이 낮은 조사량에서도 만족할 만한 불활성화율을 얻을 수 있었으며, 램프에 따른 불활성화율 차이는 크지 않다고 볼 수 있다. 따라서 정수장에서 UV소독공정 도입시 UV램프에 의한 크립토스포리디움 불활성화율 차이 보다는 경제성, 안전성, 설치 .
- 즉 소독처리하지 않은 시료의 ID50과 비교하여 계산된 log 제거율은 CT값과 상관성을 가졌으며(r = 0.8550, p = 0.0007), 퍼센트감염력으로 비교될 경우에도 log 제거율과 CT값은 관련성을 나타내었다(r = 0.7756, p = 0.0015).
- 3과 같다. 초기 염소농도는 1.14~ 1.21 mg/L로써 염소 소독을 하는 정수장에서 정수지 유출수의 통상적인 잔류 염소 농도인 약 1 m&M]서의 크립토스포리디움 제거율을 측정하는데 적합하였으며 960~5, 400분의 접촉시간 후 최종 잔류 염소 농도는 0.67-0.84 mg/L로 접촉시간에 따라 염소감소량이 다소 달랐다. CT값 계산시 소독중 염소농도 감소를 고려치 않고 최 종잔류염 소를 기준으로 계 산하였다.
후속연구
- 가장 민감한 지표는 감염성(inactivity)이다. 본 연구에서는 세포배양법에 최적확수기법을 결합, 적용하여 감염성 크립토스포리디움 오시스트를 정량하였으며, 그 민감도는 마우스감염법 만큼 민감하였으나, 사용된 오시스트 일령, 로트번호, 희석조작의 숙련도, 배양세포 계대번호 등이 감염성 측정 결과에 영향을 줄 수 있으므로 이에 대한 신중한 고려가 필요할 것으로 판단되었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.