본 연구에서는 염소, 오존, UV에 의한 크립토스포리디움의 불활성화정도를 평가하기 위해 HCT-8세포를 사용하는 세포배양법과 최적확수기법을 결합하였다. 이 방법은 크립토스포리디움 감염성을 평가하는데 있어 "gold standard"라고 여겨지는 동물감염성 실험 만큼이나 민감하였고 소독제에 의한 크립토스포리디움의 불활성화를 측정할 수 있는 유용한 방법이었다. 실험실규모의 연구결과, $5^{\circ}C$, pH 7.0 조건에서 크립토스포리움을 약 1 log 불활성화시키기위한 염소와 오존 CT값은 각각 $1,250mg{\cdot}min/L,\;16mg{\cdot}min/L$ 이었다. 이는 오존을 사용하여 소독하였을 때 조차도 낮은 온도에서는 크립토스포리디움을 불활성화시키기 어렵다는 것을 보여주는 것이다. 염소와 오존과는 달리 UV는 온도에 상관없이 크립토스포리디움을 불활성화시키기에 매우 효과적이어서 UV가 2 $mJ/cm^2$ 조사되었을 때 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되었다.
본 연구에서는 염소, 오존, UV에 의한 크립토스포리디움의 불활성화정도를 평가하기 위해 HCT-8세포를 사용하는 세포배양법과 최적확수기법을 결합하였다. 이 방법은 크립토스포리디움 감염성을 평가하는데 있어 "gold standard"라고 여겨지는 동물감염성 실험 만큼이나 민감하였고 소독제에 의한 크립토스포리디움의 불활성화를 측정할 수 있는 유용한 방법이었다. 실험실규모의 연구결과, $5^{\circ}C$, pH 7.0 조건에서 크립토스포리움을 약 1 log 불활성화시키기위한 염소와 오존 CT값은 각각 $1,250mg{\cdot}min/L,\;16mg{\cdot}min/L$ 이었다. 이는 오존을 사용하여 소독하였을 때 조차도 낮은 온도에서는 크립토스포리디움을 불활성화시키기 어렵다는 것을 보여주는 것이다. 염소와 오존과는 달리 UV는 온도에 상관없이 크립토스포리디움을 불활성화시키기에 매우 효과적이어서 UV가 2 $mJ/cm^2$ 조사되었을 때 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되었다.
Cell culture infectivity assay using HCT-8 cell was combined with most-probable-number technique to evaluate the inactivation of Cryptosporidium parvum by various disinfectants, including chlorine, ozone, and UV light. The assay was demonstrated to be as sensitive as animal infectivity assay, which ...
Cell culture infectivity assay using HCT-8 cell was combined with most-probable-number technique to evaluate the inactivation of Cryptosporidium parvum by various disinfectants, including chlorine, ozone, and UV light. The assay was demonstrated to be as sensitive as animal infectivity assay, which has been considered the "gold standard" for assessing Cryptosporidium oocyst infectivity, and a valuable tool to evaluate inactivation of C. parvum by disinfectants. Bench-scale inactivation study showed that at the condition of $5^{\circ}C$ and pH 7.0, CT value of $1,250mg{\cdot}min/L$ by chlorine and $16mg{\cdot}min/L$ by ozone were required to achieve approximately 1.0 log inactivation of C. parvum, suggesting that even ozone could not be sufficient to inactivate C, parvum at low. temperature. Unlike chlorine and ozone, UV light is very effective to inactivate C. parvum, regardless of temperature. A UV light dose of 2 $mJ/cm^2$ provided at least 3 log inactivation of C. parvum.
Cell culture infectivity assay using HCT-8 cell was combined with most-probable-number technique to evaluate the inactivation of Cryptosporidium parvum by various disinfectants, including chlorine, ozone, and UV light. The assay was demonstrated to be as sensitive as animal infectivity assay, which has been considered the "gold standard" for assessing Cryptosporidium oocyst infectivity, and a valuable tool to evaluate inactivation of C. parvum by disinfectants. Bench-scale inactivation study showed that at the condition of $5^{\circ}C$ and pH 7.0, CT value of $1,250mg{\cdot}min/L$ by chlorine and $16mg{\cdot}min/L$ by ozone were required to achieve approximately 1.0 log inactivation of C. parvum, suggesting that even ozone could not be sufficient to inactivate C, parvum at low. temperature. Unlike chlorine and ozone, UV light is very effective to inactivate C. parvum, regardless of temperature. A UV light dose of 2 $mJ/cm^2$ provided at least 3 log inactivation of C. parvum.
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문제 정의
본 연구에서는 HCT-8 세포를 감염시킨 오시스트의 여러 중식 단계 (sporozoites, merozoites, meronts etc)를 형광 항체염색법으로 검출하는 CC-IFA(Cell Culture-Immunofluorescence assay)*에 최적확수기법 (Most-Probable Number techmique)을 결합하여 감염성 오시스트를 정량 계수하고자 하였다. 아울러 이러한 감염성 정량방법을 적용해 염소, 오존, UV 등 다양한 소독제에 의한 크립토스포리디움 감염성 감소율을 측정함으로써 소독효율을 비교하고 특히 UV 조사의 경우에는 저압 UV램프와 중압램프의 소독효율을 비교 평가하였다.
제안 방법
PBS로 4회 반복 세정한 후 커버슬립을 덮고 밀봉하였다. 400배율 이상의 형광DIC현미경으로 슬라이드의 각 웰을 관찰하여 형광점 (foci)의 무리(cluster)에 초록형광점이 적어도 3개 이상 있으면 양성으로 판정하였다(Fig. 1).
8개의 웰챔버(well chamber)를 가진 웰챔버슬라이드에 HCT- 8(Human illocecal adenocarcinoma cell, ATCC CCL-224; American Type Culture Collection) monolayer를 형성시켰다 (배양온도 37℃, 습도 100%, 5% CO2). 세포 유지배지로는 5% Fetal Bovine Serum, 10% Opti-MEM, 1% 200 mM L-Glutamine, 2% IM HEPES를 첨가한 RPMI-1640을 사용하였으며, 오시스트 감염시에는 Fetal Bovine Serum의 농도를 10%로 증가시킨 성장배지를 사용하였다.
84 mg/L로 접촉시간에 따라 염소감소량이 다소 달랐다. CT값 계산시 소독중 염소농도 감소를 고려치 않고 최 종잔류염 소를 기준으로 계 산하였다.
필요하다. HCT-8 세포를 감염시킨 크립토스포리디움 파븀이 탈낭 후보이는 다양한 증식단계(sporozoites, trophozoites, type I/Ⅱ, meronts, merozoites, macrogametocyte, microgametocyte) FITC로 표지된 anti-sporozoite and merozoite antibody와 결합하여 형광DIC현미경 하에서 2~5 pm 크기의 크고 작은 초록색 형광점의 무리(cluster, 이하 클러스터)로 관찰할 수 있는데 한 개의 클러스터에 3개 이상의 형광점이 발견되면 DICE〕의한 확인을 거쳐 양성으로 판정하였다(Fig. 1~2).
사용하였다. UV는 광원으로부터 collimated beam tube를 통해 시료에 수직으로 조사되도록 조절되었으며 시료부의 광도는 표준 광도계로 측정하였다. UV조사 직전, 일정량의 오시스트를 여과지 유출수(0.
UV소독실험시 감염성평가와 비교하기위해 활성측정 방법인 탈낭실험을 추가로 실시하였다. 저압 UV램프를 사용하여 실험하였으며 조사량은 감염성평가를 위한 실험과 동일한 조건에서 실시하였다.
UV소독장치는 중압(1 kW) 및 저압(10 W) UV lamp를 교체 장착할 수 있는 RAYOX Advanced Ozidation System (CALGON社)을 사용하였다. UV는 광원으로부터 collimated beam tube를 통해 시료에 수직으로 조사되도록 조절되었으며 시료부의 광도는 표준 광도계로 측정하였다.
UV는 광원으로부터 collimated beam tube를 통해 시료에 수직으로 조사되도록 조절되었으며 시료부의 광도는 표준 광도계로 측정하였다. UV조사 직전, 일정량의 오시스트를 여과지 유출수(0.1 NTU, pH 7.2, 4℃)에 부유시켜 혼합시킨 후 교반자석이 들어있는 페트리접시에 10 mL씩 분주하고 교반시키면서 UV에 의한 불활성화 실험을 수행하였다. 소독시험시 크립토스포리디움 오시스트 농도는 1.
5 mL 미세 원심 분리 관으로 옮긴후 12,000 rpm에서 4분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하였다. pH 2.75인 acified Hank's bal- anced salt solution를 1 mL 넣고 혼합하여 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다, Hank's balanced salt sohition으로 3번 씻어낸 후 1% 담즙 200 μL과 0.44% 탄산수소나트륨 50 μL 을 넣고 37Q에서 4시간 동안 배양한뒤 탈낭되지 않은 오시스트 수(IO), 부분탈낭된 오시스트 수(PO), 속빈 오시스트수(EO)를 계수하였다. 탈낭율은 식 (2)와 같이 나타낼 수 있다.
세포성장배지를 넣어 1 mL 만든 후 세포성장배지를 사용해 1/5 희석을 단계적으로 여섯번 반복하여 6개의 튜브를 준비하였다. 각 희석단계별로 준비된 6개의 시료마다 8개의 웰 챔버에 나누어 감염시키고 37℃, 습도 100%, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양후 슬라이드를 배양기에서 꺼내 배지를 제거하고 PBS로세척한 후 100% 메탄올을 첨가해 10분간 고정시킨 다음 챔버를 제거하였다.
또한 8개의 웰 중 50%를 감염시키는데 필요한 오시스트량(IDs。)도 구하였는데 logistic regression에 입각한 식 (4)에의해 각 주입농도별 response logits을 구해 양반응곡선(doseresponse curve)를 그린 후 response logit = 0이 되는 주입농도(dose)를 ID50으로 하였다. ID50은 마우스감염 등 감염시험에서 감염력을 나타내는데 널리 사용되며 소독시험에서 감염력을 비교하는데도 적절히 사용될 수 있다.
). 세포 유지배지로는 5% Fetal Bovine Serum, 10% Opti-MEM, 1% 200 mM L-Glutamine, 2% IM HEPES를 첨가한 RPMI-1640을 사용하였으며, 오시스트 감염시에는 Fetal Bovine Serum의 농도를 10%로 증가시킨 성장배지를 사용하였다.
2, 4℃)에 부유시켜 혼합시킨 후 교반자석이 들어있는 페트리접시에 10 mL씩 분주하고 교반시키면서 UV에 의한 불활성화 실험을 수행하였다. 소독시험시 크립토스포리디움 오시스트 농도는 1.5x106 오시스트/mL이었으며, 조사량은 일정한 광량에 조사시간을 변화시킴 으로써 결정 하였는데 조사시간은 UV shutter를 열고 닫아 조절하였다. UV조사량은 식 (1) 과 같이 계산될 수 있다.
아울러 이러한 감염성 정량방법을 적용해 염소, 오존, UV 등 다양한 소독제에 의한 크립토스포리디움 감염성 감소율을 측정함으로써 소독효율을 비교하고 특히 UV 조사의 경우에는 저압 UV램프와 중압램프의 소독효율을 비교 평가하였다.
2 mg/L의 염소수를 조제하였다. 유리실린지에 염소수를 담고 약 IO*1 개의 오시스트가 함유된 오시스트 현탁액 10 hL를 주입한후 잔류염소를 측정하여 염소초기농도로 하였다. 실린지 유출구를 클램프로 조여 밀봉한 후 5℃에서 교반하면서 일정시간동안 염소와 접촉시킨 다음 잔류염소를 측정하여 최종 농도로 하고 나머지를 모두취해 3% 티오황산 나트륨 용액을 첨가하여 염소를 중화시켰다.
탈낭실험을 추가로 실시하였다. 저압 UV램프를 사용하여 실험하였으며 조사량은 감염성평가를 위한 실험과 동일한 조건에서 실시하였다. UV를 조사한 후 페트리접시에 있는 시료를 15 mL 원심분리관으로 옮기고 1, 050 xg에서 15 분 동안 원심분리한 다음 상등액을 제거하였다.
차아염소산나트륨용액(유효염소 약 13%)을 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 희석한 후 1일 이상 교반시켜 chlorine-liee water를 만들어 약 1.2 mg/L의 염소수를 조제하였다. 유리실린지에 염소수를 담고 약 IO*1 개의 오시스트가 함유된 오시스트 현탁액 10 hL를 주입한후 잔류염소를 측정하여 염소초기농도로 하였다.
프로그램에 희석단계수, 반복접종횟수, 적용된 시료량 등을 입력하여 MPN값을 도출하고 이로부터 퍼센트 감염력 (Percent Inffectivity)을 구하였으며 그 식 (3)은 다음과 같다.
대상 데이터
사용하였다. 구입한 오시스트는 미리 탈낭법(in vitro excystation)에 의해 활성을 측정하였고 매 감염시험마다 약 106개의 오시스트를 취해 hemacytometer로 농도를 결정한 후 세포 감염에 사용하였다.
오시스트는 살아있는 Cryptosporidium parvum 오시스트 (source : calf infected by Iowa strain, sterling parasitology Lab)를 구입하여 냉장 보관하였고 65일령 이내의 오시스트를 실험에 사용하였다. 구입한 오시스트는 미리 탈낭법(in vitro excystation)에 의해 활성을 측정하였고 매 감염시험마다 약 106개의 오시스트를 취해 hemacytometer로 농도를 결정한 후 세포 감염에 사용하였다.
이론/모형
감염성 오시스트의 MPN값은 미국 ICR(Information Collection Rule)용 MPN calculator program을 사용하여 결정하였다. 프로그램에 희석단계수, 반복접종횟수, 적용된 시료량 등을 입력하여 MPN값을 도출하고 이로부터 퍼센트 감염력 (Percent Inffectivity)을 구하였으며 그 식 (3)은 다음과 같다.
되도록 준비하였다. 실험은 5℃에서 수행되었으며, 오존 측정에는 Indigo Colorimetric Method(Standard Method 4500-03 B.)을 사용하였다.
성능/효과
클러스터로 관찰되었으나(Fig. 5(a)), 3~60 mJ/cm2 조사시에는 meront 이상의 증식단계를 포함한 클러스터는전혀 관찰되지 않고 세포 침입 초기 단계인 trophozoite만이 발견되었다(Fig. 5(b)).
2) 이러한 측정방법을 실험실차원의 염소 및 오존실험에 적용한 결과, 수온 5℃, pH 7.0 조건에서 PBS 중 감염성오시스트 1 log 불활성화에 필요한 CT값은 염소의 경우 1, 250 mg . min/L, 오존의 경우 16 mg .
3) UW조사실험의 경우 UV가 크립토스포리디움의 활성에는 거의 영향을 주지 못했지만 세포배양 결과 살아있는 크립토스포리디움이 세포 내 침투후 증식단계를 갖지 못하고 trophozite까지만 진행되어 감염성이 현저히 감소되는 것이 발견되었다. 저압 및 중압 UV 모두 2 mJ/cn?의 조사량에서 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되어 크립토스포리디움 제거에 낮은 조사량에도 매우 효과적인 것으로 나타났으며, UV램프간의 불활성화율 차이는 볼 수 없었다.
)을 측정한 결과는 Table 1과 같다. In vitro excystation에서 모두 95% 이상의 탈낭율을 보인 오시스트이었지만, 세포감염시 퍼센트감염력은 0.7~6.3%로 결과되었고 50% 세포 감염에 필요한 주입량(IDso)은 13~33이었는데, 세포감염법을 적용한 Slifko 등9)의 5~50과 유사하고 마우스감염에서의 ID50 15~377 보다는 다소 작았다. 이러한 결과는 세포배양법과 마우스감염법간에 강한 상관성이 있으므로 세포배양법이 마우스감염법을 대체하는 효과적인 감염성 측정법이라 할 수 있다.
1 log 불활성화되었다는 결과와 유사하였다. UV 조사가 4℃ 조건에서 수행되었다는 점을 고려할 때 기존의 염소 및 오존소독과는 달리 저온에서도 UV에 민감하게 반응한다는 것을 보여주었다.
이러한 결과에 기초할 때, 일정수준이상의 UV 조사는 오시스트의 감염성은 감소시키지만 활성이나 세포침입능력에는 거의 영향을 주지 않음을 알 수 있다. 따라서 세포배양 후 감염성여부를 분자생물학적 방법으로 검출할 경우 오양성의 가능성이 존재하여 불활성화율이과소평가될 수 있다고 판단된다. 실제로 Keegan 등")의 연구 결과를 보면 세포배양 후 real-time PCR을 통해 감염량을 정량하였는데 20 mJ/cn?에서 약 2 log 정도 제거되었다고 보고하고 있다.
1 log 불활성화율을 보였다. 또한 3 mJ/cm2 이상 조사될 경우 형광점(foci)의 무리(cluster)가 전혀 발견되지 않아 약 4 log 이상 불활성화됨을 확인할 수 있었다. 이는 동물감염법을 사용한 Clancy 등")이 2 mJ/cm2 조사시 3.
시험 결과, 소독중 오존농도 감소에 대해 고려하지 않고 잔류 오존 농도에 기초하여 CT값을 계산할 경우, CT값 상승에 따라 크립토스포리디움의 ID50은 증가하고 퍼센트 감염력은 감소하였다.
시험 결과, 접촉시간 증가 즉 CT값 상승에 따라 크립토스포리디움의 ID50은 증가하고 퍼센트 감염력은 감소하였다. 그러나 176~520 mg .
저압 및 중압 UV 모두 2 mJ/cn?의 조사량에서 크립토스포리디움이 3 log 이상 불활성화되어 크립토스포리디움 제거에 낮은 조사량에도 매우 효과적인 것으로 나타났으며, UV램프간의 불활성화율 차이는 볼 수 없었다.
5(b)). 이러한 결과에 기초할 때, 일정수준이상의 UV 조사는 오시스트의 감염성은 감소시키지만 활성이나 세포침입능력에는 거의 영향을 주지 않음을 알 수 있다. 따라서 세포배양 후 감염성여부를 분자생물학적 방법으로 검출할 경우 오양성의 가능성이 존재하여 불활성화율이과소평가될 수 있다고 판단된다.
잔류염소농도를 기준으로 계산할 때 수온 5℃, pH 7.0에서 크립토스포리디움 1 log 불활성화에는 1, 250 mg - min/L 가 필요한 것으로 나타났다. 志村有通 등은 마우스감염법을 사용한 연구에서 잔류염소 0.
제거율을 얻었다. 즉 사용된 UV램프에 상관없이 낮은 조사량에서도 만족할 만한 불활성화율을 얻을 수 있었으며, 램프에 따른 불활성화율 차이는 크지 않다고 볼 수 있다. 따라서 정수장에서 UV소독공정 도입시 UV램프에 의한 크립토스포리디움 불활성화율 차이 보다는 경제성, 안전성, 설치 .
즉 소독처리하지 않은 시료의 ID50과 비교하여 계산된 log 제거율은 CT값과 상관성을 가졌으며(r = 0.8550, p = 0.0007), 퍼센트감염력으로 비교될 경우에도 log 제거율과 CT값은 관련성을 나타내었다(r = 0.7756, p = 0.0015).
3과 같다. 초기 염소농도는 1.14~ 1.21 mg/L로써 염소 소독을 하는 정수장에서 정수지 유출수의 통상적인 잔류 염소 농도인 약 1 m&M]서의 크립토스포리디움 제거율을 측정하는데 적합하였으며 960~5, 400분의 접촉시간 후 최종 잔류 염소 농도는 0.67-0.84 mg/L로 접촉시간에 따라 염소감소량이 다소 달랐다. CT값 계산시 소독중 염소농도 감소를 고려치 않고 최 종잔류염 소를 기준으로 계 산하였다.
후속연구
가장 민감한 지표는 감염성(inactivity)이다. 본 연구에서는 세포배양법에 최적확수기법을 결합, 적용하여 감염성 크립토스포리디움 오시스트를 정량하였으며, 그 민감도는 마우스감염법 만큼 민감하였으나, 사용된 오시스트 일령, 로트번호, 희석조작의 숙련도, 배양세포 계대번호 등이 감염성 측정 결과에 영향을 줄 수 있으므로 이에 대한 신중한 고려가 필요할 것으로 판단되었다.
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