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문제 정의
- 본 연구에서는 2006년에 인천지역 해양환경에서 분리한 V. vulnificus 233주를 대상으로 API 20E 동정 kit 결과와 지가厶 및 viuB 유전자 검출을 위한 PCR (중합효소연쇄반응) 결과를 비교분석하였고, 대상균주의 항생제 감수성 결과와 PFGE 유전자형을 알아보고자" 하였다.
제안 방법
- 233주의 V. vulnificus를 API 20E kit로 실험하여 ONPG Arginine dehydrolase, Lysine decarboxylase, Ornithine decarboxylase, glucose, amygdalin 이용 결과에 따라 15개의 API profile 그룹으로 분류하였다. 그 중 해수는 11개의 profile 그룹으로 나뉘었고, 갯벌은 10개, 어패류는 6개, 수족관수는 2개로 분류되었다.
- 면봉으로 균액을 묻혀 MHA (Muller Hinton Agar, Difco, USA) 배지 표면에 골고루 바른 다음 실온에 10분간 방치한 후 항생제 디스크(BBL, Becton Dickinson, USA)를 올려놓았다. 3*>7C 에서 24시간 배양한 후 억제환의 크기를 nun 단위로 측정하여 NCCLS 기준에 따라 판정하였다. 본 실험에 사용한 항생제 디스크는 Table 3과 같이 총 21종을 사용하였으며, 정도관리 균주로 E.
- NA상의 단독 콜로니를 생리식염수에 McFarland No. 0.5로 현탁한 후 API 20E kit (Biomerieux, France)의 well에 각각 분주하고 37℃에서 20시간 배양 후 API 20E kit manual에 따라 결과를 확인하였다.
- V. vulnificus 233주의 염색체 DNA를 No杠 제한효소로 절단하여 PFGE를 실시한 바, 78.2-1, 135 kb 사이에서 10~20개의 DNA 분절이 관찰되었으며, 이 결과를 dendrogram으로 분석하였다(Fig. 1). 90% 이상의 상동성을 기준으로 PFGE pattern을 분류한 결과 모두 126개의 유형으로 분리되었고, 58%이상의 상동성을 기준으로 13개의 cluster (A, B, C, D, E, F, G H, I, J, K, L, M)虎로 분류하였다.
- V.硕cus의 종내다양성이 채취장소나 동정원(source of isolation)과 관계없이 나타난 이유로 채취장소의 환경조건 유사, 해수의 흐름에 따른 세균의 이동 및 굴의 여과섭식 시 해수와 굴 사이 균 교환 등으로 추정하였다(14). 본 연구에서는 강화도와 인천연안에서 분리한 厅 vulnificus 233 주에 대해 PFGE 분석을 한 결과 90% 이상의 상동성을 기준으로 126개의 유형으로 분리되었고, 58%이상의 상동성을 기준으로 13개의 cluster로 분류하였다.
- 5)로 4회 세척한 후 4℃ 보관하였다. 각 plug는 세절한 후 제한효소용 완충용액(NEB, En읺and) 10 μ1, 제한효소 Not\ (NEB, England) 3 μ1 (30 unit), BSA(NEB, England) 1 μ 1, 멸균 증류수 86 μ1를 넣고 37P에서 2시간 동안 반응시켰고, Molecular weight market로 사용한 Salmonella serovar Braenderup ATCC BAA-664는 제한표소 NotL 대신 Xbai (NEB, England) 1.5 pil (30 U)를 넣어 처리하였다. 제한효소 반
- 5가 되도록 현탁하였다. 면봉으로 균액을 묻혀 MHA (Muller Hinton Agar, Difco, USA) 배지 표면에 골고루 바른 다음 실온에 10분간 방치한 후 항생제 디스크(BBL, Becton Dickinson, USA)를 올려놓았다. 3*>7C 에서 24시간 배양한 후 억제환의 크기를 nun 단위로 측정하여 NCCLS 기준에 따라 판정하였다.
- 생물형 2는 indole과 ornithine decarboxylase 를 생산하지 않고, 공통적인 LPS 형태를 나타내어 serovar E로 표시하고, 주로 뱀장어에게 원인균으로 작용하며, 사람에게는 기회 감염원의 가능성으로 보고되고 있다(21). 본 연구는 2006년 3 월부터 10월 사이 인천지역 강화도와 연안 일대의 해수 및 갯벌, 어패류에서 분리된 K vulnificus 233주에 대해 API 20E kit의 검사를 실시하였다. 그 결과 대부분 indole 양성반응을 나타내어 생물형 으로 주정하였고, ONPG와 amygdalin 결과는 100% 양성이므로 API 20E kit를 이용하여 V.
- 생화학적으로 확인 동정된 균주를 대상으로 cytolysin- hemolysin 유전자(whA, 205 bp) 와 siderophore receptor 생성에 관여하는 유전자(viuB, 505 bp) 부위에 대한 PCR을 실시하였다 (7). 사용한 primer는 whA-F; TTCCAACTTCAAACCGAACTA TGAC, whA-R; ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG viuB-F; GGTTGGGCACTAAAGGCAGATATA 및 viuB-R; CGGCAGTG GACTAATACGCAGC와 같고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 변성하고 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분간 30회 반복한 후 72 。(2에서 5분간 확장하여 4。(2에 정치한 다음 전기영동으로 증폭 산물을 확인하였다.
- 대상균주 분포는 Table 1과 같다. 확인 동정을 위한 실험방법으로 선택배지는 Thiosulfate Citrate Bile-salt Sucrose (TCBS, Difco, USA) 한천배지를 사용하여 녹색의 집락(sucrose 비분해)을 확인한 후 1% NaCl이 첨가된 Nutrient 한천배지 (NA, Difco, USA)에 계대하였다.
대상 데이터
- 3*>7C 에서 24시간 배양한 후 억제환의 크기를 nun 단위로 측정하여 NCCLS 기준에 따라 판정하였다. 본 실험에 사용한 항생제 디스크는 Table 3과 같이 총 21종을 사용하였으며, 정도관리 균주로 E. coll ATCC 25922를 사용하였다.
- 실험균주는 2006년 1월부터 12월까지 비브리오 유행 예측사업을 통해 인천지역 해양환경가검물로부터 분리된 균주 407주 중 233주를 대상으로 하였다. 대상균주 분포는 Table 1과 같다.
- 사용한 primer는 whA-F; TTCCAACTTCAAACCGAACTA TGAC, whA-R; ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG viuB-F; GGTTGGGCACTAAAGGCAGATATA 및 viuB-R; CGGCAGTG GACTAATACGCAGC와 같고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 변성하고 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분간 30회 반복한 후 72 。(2에서 5분간 확장하여 4。(2에 정치한 다음 전기영동으로 증폭 산물을 확인하였다. 양성대조균주로 V vulnificus ATCC 27562를 사용하였다.
데이터처리
- 5|ig/ml)로 염색하였다. PFGE 결과는 BioNumeric software (Applied Math)를 이용 dendrogram을 작성하여 균주간의 유연 관계를 비교분석하였다.
이론/모형
- PFGE 는 PulseNet PFGE (PulseNet Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga)(16)와 김 등의 방법 (1)을 사용하였다. 먼저 시험균주를 NA배지(1% NaCl)에 접종하여 37℃ 에 서 18~24시간 배 양한 다음 2~3 ml의 cell suspension TE buffer (100 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 7.
- 항생제 감수성 시험은 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)의 방법에 따라 표준 디스크 확산법을 실시하였다. NA 에 순수배양된 V.
성능/효과
- 1). 90% 이상의 상동성을 기준으로 PFGE pattern을 분류한 결과 모두 126개의 유형으로 분리되었고, 58%이상의 상동성을 기준으로 13개의 cluster (A, B, C, D, E, F, G H, I, J, K, L, M)虎로 분류하였다. I가 104주(44.
- 본 연구에서는 강화도와 인천연안에서 분리한 厅 vulnificus 233 주에 대해 PFGE 분석을 한 결과 90% 이상의 상동성을 기준으로 126개의 유형으로 분리되었고, 58%이상의 상동성을 기준으로 13개의 cluster로 분류하였다. I가 104주(44.6%)로 가장 많은 균주들이 분포한 유형이었고 채취시기 대부분 I에 가장 많은 균주들이 분포하였으나 10월과 6월에 채취한 검체는 J에 16주 (69.6%) 13주(36.1%)로 가장 많은 균주들이 분포하여 채취 시기와 균주사이에 유전적 상관관계가 있음을 추정할 수 있었다. 월별 채취 분리 균주의 유형분포를 살펴보면 6월, 7월, 8월, 9월과 10월은 각각 7개, 9개, 8개, 6개, 5개에 속한 반면, 5월은 3개로 나타나 다른 채취월에 비해 동절기 이후 V.
- 4%)에 비교적 낮은 감수성을 보였다. V. vulnificus 감염 치료제로 권장되는 tetracycline (98.3%), chloramphenicol (96.6%), ciprofloxacin (98.3 %) 등의 경우 높은 감수성을 보여 치료제로 사용가능함을 확인하였다.
- V. vz涉顽g에 대한 원판확산법에 의한 항생제 감수성 ■ 검사에서 98-100%의 감수성을 보인 항생제는 cloramphenicol, ampicillin, tetracycline 등으로 나타났다. 비브리오 패혈증 치료에는 tetracycline계 항생제의 투여가 권장되고 있으며 Sanford 등은 tetracycline과 cephalosporin의 복합사용을 권장하였고 Chuang 등은 V.
- whA 음성인 3주는 viuB도 음성이었다. viuB 유전자 부위에 대한 PCR 양성 결과는 해수와 어패류는 각각 49주(48%), 16주(48.5%)인 반면 갯벌은 44주(61.1%)였다(Table 2).
- 0 %) 순이었다. 가장 높은 내성을 보인 항생제는 Aminoglycosides 계인 Streptomycin (14.9%)이었고, 1세대 Cephalosporin 계인 Cefezolin (11.4%), 2세대 Cephalosporin 계인 Cefoxitin (9.7%), 1세대 Quinolones 계인 Nalidixic acid (6.2%)순으로 내성을 보였다(Table 3). 항생제 하나 또는 그 이상의 약제에 대해 내성을 나타낸 것은 56주(32%)로 이중에서 해수에서 분리된 균주는 28 주(31.
- 본 연구는 2006년 3 월부터 10월 사이 인천지역 강화도와 연안 일대의 해수 및 갯벌, 어패류에서 분리된 K vulnificus 233주에 대해 API 20E kit의 검사를 실시하였다. 그 결과 대부분 indole 양성반응을 나타내어 생물형 으로 주정하였고, ONPG와 amygdalin 결과는 100% 양성이므로 API 20E kit를 이용하여 V. vulnificus 동정시 ONPG 시험과 amygdalin 시험을 실시하면 V. vulnificus 동정율을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 또한 API 20E profile을 살펴보면 1046105 (31.
- vulnificuse: 검줄하기 위해 siderophore receptor 생성에 관여하는 viuB 유전자와 whA 유전자를 동시에 검출하는 multiplexed real-time PCR 방법을 사용하였고, 임상균주가 환경분리 균주보다 viuB 유전자가 양성일 확률이 높다고 보고하였다(17). 본 연구에서 생화학적으로 V. 5, 血成c*s 로 확인 동정된 209주에 대해 PCR을 실시하였을 때 206주(98.6%)가 whA 양성으로 확인되어 해양가검물에 대해 V. vulnificus 동정시 이 유전자를 타겟으로이용할 수 있음을 확인하였고, viuB 유전자 양성주는 모두 whA 양성으로 해수(48.0%)와 어패류(48.5%)보다 갯벌(61.1%)에 viuB 양성 균주가 많이 분포흐)는 것으로 나타났다.
- 硕cus의 종내다양성이 채취장소나 동정원(source of isolation)과 관계없이 나타난 이유로 채취장소의 환경조건 유사, 해수의 흐름에 따른 세균의 이동 및 굴의 여과섭식 시 해수와 굴 사이 균 교환 등으로 추정하였다(14). 본 연구에서는 강화도와 인천연안에서 분리한 厅 vulnificus 233 주에 대해 PFGE 분석을 한 결과 90% 이상의 상동성을 기준으로 126개의 유형으로 분리되었고, 58%이상의 상동성을 기준으로 13개의 cluster로 분류하였다. I가 104주(44.
- 한편 양등은 임상검체에서 분리된 균주에 대한항균제 감수성 결과 colistin을 제외한 대부분의 시험 항균제에 감수성을 보인다고 보고하였다(6). 본 연구에서는 분리된 균주대부분이 사용 항생제에 감수성이 높은 것으로 나타났으며, 1세대와 2세대 cephalosporir계인 Cefazolin (42.3%) 및 Cefoxitin (48.6%)과 Aminoglycosides계인 Streptomycin (47.4%)에 비교적 낮은 감수성을 보였다. V.
- 시험균주 175주에 대해 항생제 감수성 실험을 한 결과 가장 높은 감수성을 보인 항생제는 Imipenem (100.0%)이었으며 Sulfamelhoxazole/lrimethoprim (98.9%), Tetracycline, Ciprofloxacin (98.3%), Ampicillin/sulbactam (97.1%), Chloramphenicol (96.6%), Cefepime (94.9%), Ceftriaxone (94.8%) 순으로 나타났다. 중등도 내성은 CefHzolin (46.
후속연구
- vulnificus 에 의한 질병발생 시 역학의 기초 자료로 활용하기 위해서는 장기간의 PFGE 데이터 축적과 타 시 .도의 분리균주에 대한 PFGE 패턴 및 다른 분자역학적 방법으로 얻은 결과와의 비교분석 등도 있어야 할 것으로 사료된다.
- 환경 검체별, 지역별 유전적 상관관계는 얻을 수 없었다. 앞으로 PFGE 분석을 통해 얻은 유전적 양상 및 특성을 향후 인천지역에서 V. vulnificus 에 의한 질병발생 시 역학의 기초 자료로 활용하기 위해서는 장기간의 PFGE 데이터 축적과 타 시 .도의 분리균주에 대한 PFGE 패턴 및 다른 분자역학적 방법으로 얻은 결과와의 비교분석 등도 있어야 할 것으로 사료된다.
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