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문제 정의
- TOX2P/TOX2M prims.쌍에 의한 PCR 실험을 통해 국내의 수체에서 남조류 독성 검출의 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 5, -CCAATCCCTATCTAAACACAGTAACTCGG3 PCR 증폭은 GeneAmp2400 thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, USA)을 이용하여 실시하였다. PCR mixture에는 10 x PCR buffer (Promega, USA) 2.
- ELISA를 이용한 microcystins 분석은 0, 16~2.5ppb 범위에서 제작사의 protoc0l에 따라 Microcystin ELISA Plate Kit (EnviroLogix Inc., Portland, USA)를 사용하여 실시하였다. 분석에 앞서 100 mL의 samplee 진공농축기 (Labconco, USA)에서 동결건조 시켰으며, 건조된 시료들은 sonication (Sonic Dismembrator 550, USA)2]- 더불어 20 mL 의 Milli-Q water (Millipore Coporation, USA)로 3회에걸쳐 추출하였다.
- PCR 생 성 물은 PCR Purification kit (Bio Basics, Canada)^- 사용하여 정제 (purification) 하였으며, ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing 하였다. 모든 염기서 열은 BLAST 2.
- TOX2P/TOX2M primer쌍을 이용하여 국내 8개 수체에서 분리한 국립환경과학원의 남조류 균주들을 대상으로 mcyB 유전자의 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 분석 에서 16개의 균주들 중 8개의 균주들, Microcystis sp.
- 모든 PCR 결과들은 ELISA에 의한 micTocystins의 정량분석 결과들과 일치하였다 (Table 1). mcyB 유전자 부위의 정확한 확인을 위해 band 가 확인된 8개의 PCR 산물들을 대상으로 mcyB 유전자서열분석을 실시한 후, 분석된 염기서열들을 GenBank에등록된 균주들의 서열들과 비교하였다. 그 결과,mcyB 유전자의 각 염기서열은 공통으로 M.
- 남조류의 독성 잠재력을 확인하기 위해 microcystins 합성 유전자인 mqyB에 특이적으로 작용하는 TOX2P/ T0X2M primer쌍을 이용한 whole-cell PCR을 실시하였다. 환경시료를 대상으로 한 실험 결과에서 TOX2P/TOX2M primei쌍은 약 1,000 cells .
- 0 Ready Reaction Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing 하였다. 모든 염기서 열은 BLAST 2.1 을 사용하여 GenBank에 등록된 mcyB의 서열과 비교하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 남조류 균주(strain)들은 국립환경과학원 (NIER, National Institute of Environmental Research)의 배양 균주들을 이용하였으며, 이들 균주들은 15개의Microcystis 속과 1개의 Phormidium musicola로 구성되었다 (Table 1). 실험을 위해 균주들은 약 30 gmol photons s-1의 조도와 25± 1℃의 온도에서 CB medium (Watanabe, 1996)을 사용하여 성장시켰다.
- (Table 1). 실험을 위해 균주들은 약 30 gmol photons s-1의 조도와 25± 1℃의 온도에서 CB medium (Watanabe, 1996)을 사용하여 성장시켰다.
- 현장 시료들은 남조류가 출현한 2006년 6월과 9월 사이에 굴포천 (1개 지점), 영천댐(1개 지점) 및 안계댐 (2개 지점)으로 부터 각각 채집하였다. 출현종의 동정은 광학현미 경 (Zeiss Axioskop2, German) 400~ 1,000네]에서 실시하였다.
이론/모형
- Microcystins의 정량 분석을 위해 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 사용하였다. ELISA를 이용한 microcystins 분석은 0, 16~2.
성능/효과
- 따라서, 8개의 모든 PCR 산물들은 mcyB 유전자에 해당하는 부분임을 확신할 수 있었다. TOX2P/TOX2M primer쌍의 현장 적용성을 알아보기 위해 현장(굴포천, 영천댐 및 안계댐에서 채집한 9개의 시료들에 대해 DNA 추출과정을 생략한 whole-cell PCR을 실시한 결과, ELISA에 의해 microcystins 생성이 확인된 4개의 현장시료들에서만 양성 대조군(M, aeruginosa NIER-10010)과 동일한 크기 (350 bp)의 PCR 산물이 확인되었다(Fig. 2). 현장시료들에 대한 whole-PCR과 ELISA 분석 결과들의 일치는 TOX2P/TOX2M primer쌍이 현장에서 잠재적 microcystins 생성종의 확인을 위한 효과적인 probe 임을 보여 주었다.
- 환경시료를 대상으로 한 실험 결과에서 TOX2P/TOX2M primei쌍은 약 1,000 cells . mLe의 낮은 밀도에서 효과적으로 mcyB 유전자의 증폭에 성공하였으며, mcyB 유전자를 지닌 종들은 모두 ELISA 분석에 의해 micipcystins의 생성이 확인되었다. 따라서, TOX2P/ TOX2M primer쌍은 국내의 수체에서 독성 남조류의 신속하고 효과적인 검출을 위한 유용한 probe로 판단되었다.
- mcyB 유전자 부위의 정확한 확인을 위해 band 가 확인된 8개의 PCR 산물들을 대상으로 mcyB 유전자서열분석을 실시한 후, 분석된 염기서열들을 GenBank에등록된 균주들의 서열들과 비교하였다. 그 결과,mcyB 유전자의 각 염기서열은 공통으로 M. aeruginosa(GenBank accession no. AB019578), M. aeruginosa (AB092806), M. viridis (AB092807) 및 M. aeruginosa PCC7813(AY034601)의 유전자의 부위와 98~ 100 %의 identity를 나타내었다. 특히, M.
- viridis (AB092807)와 100%의 identity를 보였다. 따라서, 8개의 모든 PCR 산물들은 mcyB 유전자에 해당하는 부분임을 확신할 수 있었다. TOX2P/TOX2M primer쌍의 현장 적용성을 알아보기 위해 현장(굴포천, 영천댐 및 안계댐에서 채집한 9개의 시료들에 대해 DNA 추출과정을 생략한 whole-cell PCR을 실시한 결과, ELISA에 의해 microcystins 생성이 확인된 4개의 현장시료들에서만 양성 대조군(M, aeruginosa NIER-10010)과 동일한 크기 (350 bp)의 PCR 산물이 확인되었다(Fig.
- mLe의 낮은 밀도에서 효과적으로 mcyB 유전자의 증폭에 성공하였으며, mcyB 유전자를 지닌 종들은 모두 ELISA 분석에 의해 micipcystins의 생성이 확인되었다. 따라서, TOX2P/ TOX2M primer쌍은 국내의 수체에서 독성 남조류의 신속하고 효과적인 검출을 위한 유용한 probe로 판단되었다.
- 1). 모든 PCR 결과들은 ELISA에 의한 micTocystins의 정량분석 결과들과 일치하였다 (Table 1). mcyB 유전자 부위의 정확한 확인을 위해 band 가 확인된 8개의 PCR 산물들을 대상으로 mcyB 유전자서열분석을 실시한 후, 분석된 염기서열들을 GenBank에등록된 균주들의 서열들과 비교하였다.
- 이번 연구에서 mcy 유전자가 확인된 균주 및 현장 시료들은 모두 ELISA에 의해 microcystins의 생성 이 확인되었다 (Table 1). 이는 mcy 유전자를 지닌 Microcystis 개체들은 거의 예외 없이 microcystins를 실제로 생성한다고 보고한 선행 연구 결괴들과 일치한다(Via-Ordorika et aZ.
- aeruginosa PCC7813(AY034601)의 유전자의 부위와 98~ 100 %의 identity를 나타내었다. 특히, M. viridis NIER-10020 의 mcyB 염기서열은 M. viridis (AB092807)와 100%의 identity를 보였다. 따라서, 8개의 모든 PCR 산물들은 mcyB 유전자에 해당하는 부분임을 확신할 수 있었다.
- , 1999), Pan 등 (2002)은 TOX2P/TOX2M에 의한 PCR 법은 microcystins 생성 균주를 매우 신속하고 효과적으로 검출할 수 있는 유용한 방법임을 이미 증명한 바 있다. 특히, 이번 연구를 통해 형태적으로 동일한 개체들 사이에서 독성 균주와 비독성 균주가 모두 확인되었다는 점은 주목할 만하다(Table 1). 이는 선행 연구들(Neilan et al.
- 2). 현장시료들에 대한 whole-PCR과 ELISA 분석 결과들의 일치는 TOX2P/TOX2M primer쌍이 현장에서 잠재적 microcystins 생성종의 확인을 위한 효과적인 probe 임을 보여 주었다.
후속연구
- 결과적으로, TOX2P/TOX2Mprimei.쌍에 기초한 PCR법과 HPLC법 사이의 적절한 호환이 이루어진다면 국내 수계의 microcystins에 대한 더호율적인 모니터링이 가능할 것으로 판단된다.
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